大豆酱口味独特，营养丰富，原料经发酵后易被人体吸收，是我国传统调味品之一，其历史可追溯上千年[1]。据报道[2-4]，大豆酱还具有预防癌症、降血糖及预防糖尿病的作用。昭通大豆酱因其产地得名“昭通酱”，其色泽、香味、滋味都具有与众不同的特色，也是云南昭通地区有名的高原特产农产品。相比其他地区的豆酱，昭通有两个明显的工艺特色：①昭通酱原料不是用蒸煮而是采用炒熟的大豆作为原料，炒熟或炒香的花椒、辣椒、香料等作为辅料进行自然发酵制成[5]；②昭通酱采用的2步发酵法（制曲和下酱）周期长，整个发酵过程需180 d才能完成，是一种具有独特风味和工艺的传统发酵豆酱[6-7]。
从20世纪中期人们就已开始对发酵豆制品的风味进行初步探索，随着社会的发展和科学技术的进步，检测技术水平在不断地改进和提高。目前众多国内外相关学者对食品中的香味成分的鉴定技术做了大量的工作，探究了风味物质形成的机理和性质[8-9]。庞惟俏等[10]在6种大豆酱中共检出124种挥发性化合物，包括醇类、酯类、醛酮类、酸酚类。ZHAO J X 等[11]利用顶空固相微萃取（headspace solidphase microextraction，HS-SPME）、气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术、气相色谱-嗅闻法联用（gas chromatography-olfactometry，GC-O）技术分析自然发酵与人工发酵豆酱中挥发性成分的差异性，结果表明，自然发酵组豆酱中挥发性化合物种类多于人工发酵组。PARK J S等[12]采用GC-MS技术对传统的4种类型大豆酱风味物质成分进行分析，其中酯类、酮类含量最高。由此可知，SPME-GC-MS技术被广泛用于测定食品中挥发性成分[13-14]。
目前针对昭通酱发酵过程中挥发性成分的报道相对较少，因此本实验基于在前期的研究基础上[5-7，15]，采用HSSPME 结合GC-MS技术探究了昭通酱发酵过程中的挥发性物质的变化，并通过气味活度值（odor activityvalue，OAV）筛选昭通酱关键香气成分，并对结果进行主成分分析（principal component analysis，PCA）及相关性分析，以期为昭通酱的品质提升、发展创新以及更好地工业化生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
大豆、辣椒、花椒、盐、香料、白酒：市售。
1.1.2 试剂
环己酮（纯度≥99%）：上海凯赛化工有限公司。
1.2 仪器与设备
6890-MS 5973 N 型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；固相微萃取装置及（DVB/CAR/PDMS）50/30 μm萃取头、DB-5色谱柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）：美国J&W Scientific公司。
1.3 方法
1.3.1 昭通酱加工工艺流程及操作要点[7]
炒豆→磨粉→捏团→制曲→下酱→晒酱→昭通酱成品
操作要点：
炒豆：根据豆粒的直径大小将豆子分开炒熟，避免炒糊和夹生；
磨粉：大豆炒制后去壳，粉碎成豆粉；捏团：豆粉里加75%清水拌匀后揉捏成约200 g的酱团；制曲：将酱团盖上稻草进行发酵，大约发酵28 d左右进行下一步处理；
下酱：长霉的酱团刷去表面菌丝，捻碎，按曲质量加入35%辣椒粉，20%混合香料，白酒适量，兑清水150%搅拌均匀，制成稀酱；
晒酱：稀酱于露天场地经日晒夜露，3 d翻酱一次，6个月左右得到昭通酱成品。
1.3.2 样品取样及处理
将面酱捏团后第1次采集酱样，到第28天制曲阶段停止进入下酱（XJ）阶段，即加入适量食盐、辣椒、花椒、水、香料和白酒拌匀。采集后的酱样立即装入已灭菌的密封袋，置于-20 ℃保存。
1.3.3 昭通酱挥发性风味物质测定
参考蒋立文等[16-17]的方法稍作修改。萃取头选用50/30μm Carboxen/SPME规格（灰色），测定前先在250 ℃的进样口老化1 h。称取样品4 g（精确到0.001 g）于顶空瓶中，加入50 μL 0.0120 mg/mL环己酮标准品（内标物）和4 mL蒸馏水，密封；置于70 ℃加热板上平衡30 min，将萃取头穿过密封垫插入顶空进样瓶内后推出纤维头（纤维头不接触样品），顶空吸附40 min，插入GC进样口解吸5 min。气相色谱条件、质谱条件和定性分析的方法均参照文献[7]中方法执行。挥发性有机物半定量计算公式如下：
通过VAN GEMERT L J[18]的研究，查阅各挥发性有机物的气味阈值（d，介质为水），并计算气味活性值（odor activity value，OAV），其计算公式如下：
式中：Ci为该化合物在昭通酱样中的含量，mg/kg；OTi为该组分在水中的气味阈值，mg/kg。
当OAV≥1时，认定该物质对昭通酱香气有着重要的贡献[19]，是昭通酱中关键香气成分。
2 结果与分析
2.1 昭通酱发酵过程中挥发性成分分析
2.1.1 昭通酱发酵过程挥发性香气成分检测结果
不同发酵过程中昭通酱共鉴定出的挥发性化合物的种类及相对含量见表1。由表1可知，共检出60种挥发性成分，包括14种酯类，12种烷烯类、12种醇类、2种醛类、1种酮类、3种醚类、4种酚类和12种其他类，其种类与前人报道[22-23]的研究结果基本相似。其中0 d（大豆原料）中其他类挥发性物质11种，总含量为40.97 μg/g，醇类挥发性物质4种，总含量为39.47 μg/g，烷烯类挥发性物质4种，总含量为15.94 μg/g，其他挥发性物质种类和相对含量均相对较低，挥发性物质主要由苯乙烯、1-辛烯-3-醇和呋喃类化合物组成。随着发酵时间延长，酯类、酮类和醚类物质呈先上升后下降的趋势，其中酮类和醚类在制曲结束（0～28 d）后浓度达到最大，下酱后开始下降。烷烯类物质在发酵过程中含量呈上升趋势，醇类、酚类、醛类和其他类物质呈下降趋势。其他类中的吡嗪类物质下降，醇类物质和烷烯类物质是制曲阶段挥发性物质的主要组成部分。下酱阶段（28～180 d），烷烯类、醇类和酯类物质占主导。酯类物质相比制曲阶段总量继续上升，到70 d达到最高，为25.90 μg/g，到发酵结束（180 d），含量降至7.95 μg/g，烷烯类物质是下酱后阶段含量最高的挥发性物质，到发酵结束烷烯类物质含量达到92.33 μg/g，其次是醇类物质，含量为13.31 μg/g。由图1可知，左侧柱状图代表各昭通酱样品的挥发性物质数量，上侧柱状图以及下侧的点-线代表各样本之间挥发性物质的交集数量[24-25]。结果显示，大豆原料中挥发性物质有32种，在昭通酱发酵过程中保持大豆原有的（交集）挥发性物质有8种，分别为茴香脑、3,4-二甲氧基苯乙烯、苯乙醇、芳樟醇、甲基麦芽酚、苯甲醛、2,5-二甲基吡嗪和2,3,5-三甲基吡嗪，并且在发酵过程中，这8种物质呈上升趋势；随着发酵的进行，酯类和烷烯类有机物质种类和含量呈上升趋势，醇类有机物种类和含量呈下降趋势。
图1 昭通酱发酵过程中各类挥发性成分韦恩图分析
Fig.1 Venn diagram analysis of various volatile components during Zhaotong soybean paste fermentation process
表1 昭通酱发酵过程中主要挥发性香气成分的变化情况
Table 1 Change of main volatile aroma components during Zhaotong soybean paste fermentation process
续表
注：“-”表示未检出。
2.1.2 昭通酱发酵过程挥发性物质检测结果的主成分分析及相关性分析
不同种类的挥发性化合物在不同的食品加工过程中有很大的关联[20]，WANG S等[21]从日本传统豆豉酱中对46种挥发性化合物进行了鉴定，证实了豆酱中各类化合物之间有着很大的关联性，尤其是醛类和酯类物质与感官呈正相关。昭通酱样本间差异性和昭通酱发酵过程中挥发性物质种类之间的主成分分析及相关性分析结果见图2。由图2a可知，采用PCA多元变量统计分析，可知各组昭通酱的特征变量86.74%的累计差异被描述，包含67.89%的PC1和18.85%的PC2。可明显看到制曲阶段昭通酱中挥发性成分差异性较大，而下降阶段差异性较小。在热图中每一行和每一列都代表一类挥发性物质，每个单元格的颜色展示的是对应列挥发性物质种类和对应行挥发性物质种类的相关系情况。由图2b可知，酯类与酚类，醚类与酮类、烷烯类，酮类与其他类均呈负相关性，烷烯类与其他类呈显著负相关（P＜0.05）；酮类与烷烯类、酚类呈正相关性。此结果与表1的变化基本相符。醇类物质与其他类（吡嗪为主）显著呈正相关（P＜0.05），而与酯类物质呈显著负相关（P＜0.05）；烷烯类物质与醛类物质呈显著负相关（P＜0.05），而与酮类物质呈极显著负相关（P＜0.01）。
图2 昭通酱发酵过程中各类挥发性成分主成分分析（a）及相关性分析（b）结果
Fig.2 Results of principal component analysis (a) and correlation analysis (a) of various volatile components during Zhaotong soybean paste fermentation process
红色表示正相关，蓝色表示负相关，“*”表示显著相关（P＜0.05），“**”表示极显著相关（P＜0.01）。
2.2 发酵过程中昭通酱气味活度值分析
采用OAV表征发酵过程中昭通酱各香气化合物对主体香气成分的贡献，通过文献查询各挥发性物质的阈值，通过计算各挥发性物质浓度阈值的比值计算OAV。当OAV≥1时，可以认为该挥发性物质对样品的整体风味具有贡献作用[26]。LIU P 等[27]利用皮尔逊相关系数对蚕豆酱中40种挥发性香味物质基于线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA）鉴定发现其样品主要表现为香料香、甘草香、果香、草香、花香和芳香气味；LU Y L等[28]通过GCO-MS技术分析了柱候酱中100种挥发性成分，并通过气味强度和OAV分析，确定24种重要香气化合物，主要为异戊酸乙酯、异丁酸乙酯、亚麻酸和桉树醇。昭通酱发酵过程中主要挥发性成分气味活度值计算结果见表2。由表2可知，昭通酱发酵过程中OAV≥1的挥发性成分共鉴定出40种，包括8种烷烯类、酯类9类、醇类8种、吡嗪类7种、酚类4种、醛类2种、酮类1种、醚类1种。其中原料中（0 d）共鉴定出16种，其中OAV较大的分别为芳樟醇、愈创木酚、苯乙烯、正己醇、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、1-辛烯-3-醇、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、2,5-二乙基吡嗪等，随着发酵的进行，发酵第7、14、28、28（下酱）、42、70、110、150、180天，OAV≥1的挥发性成分分别有20种、19种、24种、24种、24种、24种、25种、27种、27种。各类成分在不同发酵时间的昭通酱中OAV各不相同，芳樟醇、丁酸乙酯、月桂烯、桉树醇、愈创木酚、2-甲基丁酸乙酯、甲基麦芽酚、苯甲醛、茴香脑、亚油酸乙酯、1-石竹烯、水杨酸甲酯、对乙基苯酚、邻异丙基甲苯、（+）-柠檬烯成为发酵过程中主要呈香物质。各类挥发性物质中芳樟醇有似佛手（香柠檬）香，甲基麦芽酚呈焦香奶油糖香气，苯甲醛有似苦杏仁芳香，丁酸乙酯有菠萝芳香气味，乙酸芳樟酯有似橙叶、香柠檬及生梨香，月桂烯有甜橘味和香脂气，1-石竹烯有似丁香香味，水杨酸甲酯有冬青叶香味，桉树醇有樟脑气息和草药香，对乙基苯酚带有木-酚气息，愈创木酚有特殊芳香气味，2-甲基丁酸乙酯有苹果皮、菠萝皮和李子皮香气，4-烯丙基苯甲醚有似大茴香香气，4-乙基-2-甲氧基苯酚有香辛料和草药香气，（+）-柠檬烯有橙子香气，丁香酚呈丁香油香和石竹辛香，茴香烯有似茴香香气，γ-癸内酯有椰子和桃子香气，γ-十二内酯有似奶油、桃子、梨香气。这些成分很可能是构成昭通酱发酵后期的主要呈香挥发性物质。
表2 昭通酱发酵过程中主要挥发性成分气味活度值
Table 2 Odor activity value of main volatile components during Zhaotong soybean paste fermentation process
续表
注：“-”表示未检出；“DNC”表示未确定；风味特征描述来源于http：//www.perflavory.com；https：//www.chemicalbook.com。
3 结论
昭通酱在发酵过程中共检出60种挥发性成分，其中烷烯类12种、酯类14种、醇类12种、酮类1种、酚类4种、醚类3种、醛类2种、其他类12种。其中，在制曲阶段检出的挥发性物质种类较少，下酱后，随着发酵时间延长，酱中检出的挥发性物质种类明显增多，发酵过程中酯类、酮类和醚类物质呈先上升后下降的趋势，烷烯类物质在发酵过程中含量呈上升趋势，醇类、酚类、醛类和其他类物质呈下降趋势。醇类物质和烷烯类物质是制曲阶段挥发性物质的主要组成部分。下酱阶段烷烯类、醇类和酯类物质占主导。通过计算各挥发性物质浓度阈值的比值计算OAV，共鉴定出40种OAV≥1的挥发性香味成分，这些挥发性香味物质均呈不同的香味特征，主要呈现焦香奶油糖香气、苦杏仁芳香、菠萝芳香气味、香柠檬香、脂香、丁香、冬青叶香、草药香、木-酚气息、大茴香等，这些香味共同构成昭通酱的主要呈香特征，使昭通酱具有独特的风味和丰富的营养。
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