在葡萄酒发酵过程中，营养管理是确保发酵顺利完成的关键，葡萄汁中缺乏含氮物质影响酵母合成生长代谢所需要的蛋白质，特别是酵母可同化氮（yeast assimilable nitrogen，YAN）的缺乏，影响糖类物质运输和代谢，从而导致发酵产生问题[1-2]。不同年份葡萄汁中的含氮物质之间具有明显的差异，葡萄汁中的营养物质主要受到葡萄的成熟度、气候环境、栽培管理技术、土壤条件、施肥等因素的影响[3]。葡萄汁中的含氮营养物质主要包括有机氮和无机氮两种形式，在不同品种的葡萄、不同的生长年份和不同管理措施的葡萄中有机氮和无机氮之间的比例不同。
在发酵中缺乏营养，酵母生长受到影响，因此出现发酵迟缓甚至发酵停止的风险增加。缺乏营养也可能产生一些不良的风味物质，如硫化氢、乙酸等物质，从而影响葡萄酒的香气质量[4-5]。葡萄汁的含糖量越高，酵母将葡萄汁中的糖全部代谢转化成酒精所需要的营养物质也越多[6-7]。影响葡萄酒发酵的主要因素为葡萄汁中YAN的含量，葡萄汁中的YAN主要包括铵离子、α-氨基酸和小肽。在发酵的早期阶段，酵母迅速吸收积累这些营养物质，从而满足酵母代谢相关的蛋白质合成和生长所需的营养物质，剩余YAN则储存在细胞液泡中[8-9]。在实际生产过程中，酿酒师通常选择不同的营养调整葡萄汁的营养含量，保证发酵的顺利进行，向葡萄汁中添加营养物质不仅改善酒精发酵，还能提高葡萄酒品质[10]。
由于全球气候变暖，葡萄中的含糖量不断升高，在我国新疆、宁夏等酿酒葡萄主产区，葡萄的含糖量到达280 g/L以上屡见不鲜，而酿造这些高糖度的葡萄汁不仅需要耐酒精度高的酵母，同时也要满足酵母对营养的需求，但这些葡萄汁中的营养往往不能满足酵母的代谢需求。
在含氮量不足的情况下，为了避免发酵出现停滞等现象，应适当调整葡萄汁的营养成分，保证发酵顺利的进行。安琪发酵营养NutrienFast是含有酵母制品、磷酸氢二铵以及酵母需要的微量营养物质，添加100 mg/L的安琪发酵营养NutrienFast将会增加13～14 mg/L YAN。本实验在缺乏营养且含糖量在280 g/L的葡萄汁中进行，通过在不同的发酵时期添加发酵营养剂NutrienFast，研究其对葡萄酒酒精发酵的影响，以期解决或预防葡萄酒的发酵停止或停滞问题，提高葡萄酒的品质。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
安琪葡萄酒酵母、安琪发酵营养剂NutrienFast：安琪酵母股份有限公司。
葡萄汁：赤霞珠葡萄除梗、破碎，添加30 mg/L果胶酶（商业果胶酶，按照说明书用量使用），在4 ℃条件下冷浸渍24 h，分离葡萄汁和葡萄皮渣，然后用0.8 g/L的皂土进行下胶处理，48 h后分离上清葡萄汁，葡萄汁的糖度用葡萄糖调节至280 g/L，相对密度1 118，用酒石酸调节pH为3.6，酵母可同化氮为180 mg/L。
1.2 仪器与设备
Chromaster系列5210高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：日立高新技术公司；PH-3C pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；BSA3202S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；HGZN-32电热恒温干燥箱、HPX-Ⅱ300恒温生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；DMA35 便携式密度计：奥地利Anton Paar（安通帕）公司。
1.3 实验方法
1.3.1 葡萄酒发酵方法
将500 mL葡萄汁装入500 mL三角瓶中，三角瓶用U型单向阀封口，单向阀中加入1.5 mL水密封，CO2能正常溢出，同时防止氧气进入，模拟葡萄酒的厌氧发酵。
酵母活化：酵母的用量为250 mg/L，用10倍酵母质量、温度35～40 ℃、含有5%葡萄糖水溶液活化酵母20 min，活化后加入装有500 mL葡萄汁的三角瓶中，将三角瓶置于25 ℃恒温培养箱中发酵17 d，分别在发酵第0、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11天添加0.4 g/L安琪发酵营养NutrienFast。每天测定CO2的质量损失。
发酵完成后放入4 ℃冰箱中，待酵母沉降后，分离上清液，检测葡萄酒的相对密度、酒精度、残糖。剩余的酵母沉降物用滤纸分离酵母，将分离后的酵母，放入105 ℃烘箱中烘干至恒质量，称量酵母的干质量。
1.3.2 测定方法
葡萄酒的相对密度：使用DMA35 便携式密度计测定；葡萄酒酒精度、残糖：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定[11]。
CO2质量损失：添加酵母后，用单向阀封口，称量原始质量，每天用分析天平称量整个发酵体系的质量。计算公式如下：
2 结果与分析
2.1 发酵营养剂NutrienFast的添加时期对酵母发酵进程的影响
在葡萄酒生产中影响酵母发酵进程的主要因素是营养物质的含量和种类，其中葡萄汁中YAN的含量是影响葡萄酒发酵进程的主要因素[12]。研究发现，酵母提供氮素营养和其他营养物质能提高酵母对酒精的耐受性[13-14]，改善葡萄汁中营养成分对葡萄酒的香气物质的种类和浓度的影响[15-17]。酵母不同的生长阶段对营养的需求不同，本研究是通过在酵母发酵不同的阶段添加发酵营养剂NutrienFast，研究营养对酒精发酵代谢的影响，结果见表1。
表1 发酵营养剂NutrienFast添加时间对发酵结束后CO2累积质量损失的影响
Table 1 Effect of fermentation nutrient agent NutrienFast addition time on CO2 cumulative mass loss after fermentation
注：不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由表1可知，与对照（未添加营养）相比，在发酵不同时期添加安琪发酵营养NutrienFast，CO2累积质量损失均有所提高，其中在发酵第3天（糖消耗36.26%）、第4天（糖消耗44.18%）时添加安琪发酵营养NutrienFast，CO2累积质量损失最高，分别为129.62 g/L、128.82 g/L，说明此时添加安琪发酵营养NutrienFast发酵最彻底；这一阶段是酵母生长的稳定期，其他研究发现稳定期添加营养对酵母的蛋白质合成和糖的转运具有积极显著的促进效果[18]。发酵第4天后添加安琪发酵营养NutrienFast对发酵的促进作用减弱，在发酵第11天（糖消耗73.95%）时添加安琪发酵营养NutrienFast，对发酵的影响最弱。
2.2 发酵营养剂NutrienFast添加时期对酵母生物量的影响
本研究中酵母接种量为250 mg/L，接种后的酵母活细胞数为6×106 cells/mL。研究发现，在含有足够营养的葡萄汁中，葡萄酒发酵完成后，酵母数量能达到108个细胞/mL左右，酵母生物量能达到3～5 g/L，若葡萄汁中的营养不足，酵母数量和酵母干质量均受到影响[19-20]。
在不同时期添加发酵营养剂NutrienFast对酵母细胞干质量的影响见图1。由图1可知，与对照（未添加营养）相比，发酵前6 d（糖消耗≤56.46%）添加营养都能明显的促进酵母的生长，发酵结束后酵母干质量均在3.2 g/L以上，其中发酵第2～4天时添加营养对酵母干质量的影响最为显著，发酵结束后酵母干质量分别为3.53 g/L、3.57 g/L、3.62 g/L，发酵结束后酵母干质量的变化趋势与酵母发酵速率和酵母累积质量损失的趋势一致，因此酵母的生物量的大小影响了酵母的发酵速度，不同时期添加营养剂对酵母的生物量和酵母的发酵速度具有不同的影响，在YAN不足的发酵中，不仅需要添加营养剂，还需要确定最佳的营养剂添加时期，才能达到最佳的应用效果。MENDES-FERREIRA A等[21]的研究发现，YAN通过增加酵母生物量、刺激酵母对糖的利用影响葡萄酒的发酵，添加氮素营养导致了细胞数量的增加，增加了比发酵速率，从而缩短了发酵的时间。
图1 营养添加时间对发酵结束后酵母干质量的影响
Fig.1 Effect of nutrition addition time on yeast dry mass after fermentation
2.3 营养添加时期对葡萄酒理化指标的影响
2.3.1 营养添加时期对葡萄酒相对密度的影响
发酵结束后葡萄酒的相对密度越低，表示葡萄酒中的残糖含量越低，酒精度越高。
从图2可以看出，在发酵第3天和第4天时添加安琪发酵营养NutrienFast葡萄酒相对密度最低，分别为991和990.5。在发酵过程中酵母的生长时期主要包括迟滞期、指数生长期，稳定期和消亡期。在迟滞期，酵母需要适应葡萄酒的发酵环境，然后酵母进入指数生长期，此时酵母快速繁殖，大量的吸收葡萄汁中的营养物质，当酵母指数生长期结束时，对应糖消耗大约为30%[22]，此时若葡萄汁中缺乏营养将导致发酵不完全，因此在发酵进行到30%左右添加营养对发酵具有明显的促进作用。本研究在发酵进行到第3天和第4天时添加营养，发酵完成后的相对密度最低，此时的发酵进行到35%～45%之间，该时期添加营养对酵母的影响最大。
图2 营养添加时间对发酵结束后葡萄酒相对密度的影响
Fig.2 Effect of nutrition addition time on specific gravity of wine after fermentation
2.3.2 营养添加时期对葡萄酒残糖含量的影响
图3表示了不同时期添加营养对最终葡萄酒中残糖的影响，发酵第3天和第4天时添加安琪发酵营养NutrienFast，葡萄酒残糖最低，分别为3.38 g/L和3.68 g/L，均低于4 g/L，说明发酵完全，而其他时期添加营养均不能发酵完全，添加过早或过晚均不能使酵母很好的代谢葡萄汁中的糖。发酵进行到30%～40%时，酵母到达稳定期阶段，在这一阶段添加营养，一方面对发酵速度影响非常显著，该时期添加营养会减少发酵时间，促进酵母发酵速度，快速完成发酵[23]。从图3可以看出，第3天和第4天添加营养的发酵中发酵完成，其他时期添加营养的发酵中糖均高于4 g/L，因此均未完成发酵。
图3 营养添加时间对发酵结束后葡萄酒残糖含量的影响
Fig.3 Effect of nutrition addition time on residual sugar content of wine after fermentation
2.3.3 营养添加时期对葡萄酒酒精度的影响
图4显示了不同营养添加时期对最终葡萄酒酒度的影响，发酵第3天和第4天时添加安琪发酵营养NutrienFast，发酵结束后葡萄酒的酒精度最高，分别为16.5%vol和16.4%vol。本实验中葡萄汁中的糖含量为280 g/L，YAN为180 mg/L，葡萄汁中缺乏营养，不能完成葡萄酒的发酵，因此需要添加营养物质使酒精发酵完全。研究发现氮素的缺乏导致酵母的代谢活性和生物量降低[8-9，24]，引起酵母发酵困难，从而出现发酵停滞的风险，本研究中在缺乏营养的葡萄汁发酵的不同时期添加营养物质，结果显示，在发酵中期（35%～45%）添加营养，葡萄酒中的酒精度达到最高，且含糖量低于4 g/L，符合国家标准对干型葡萄酒的要求。因此推荐该时期作为补充营养的最佳时期，在缺乏营养的葡萄汁中通过补充营养物质来防止发酵缓慢或停滞[25]。
图4 营养添加时间对发酵结束后葡萄酒酒精度的影响
Fig.4 Effect of nutrition addition time on alcohol content of wine after fermentation
3 结论
本研究从CO2累积质量损失、最终酵母干质量，葡萄酒的理化指标等方面评价不同时期添加安琪发酵营养NutrienFast对葡萄酒发酵的影响。结果表明，在发酵第3天（糖消耗36.26%）、第4天（糖消耗到达44.18%）时添加营养对发酵的影响最大，此时CO2累积质量损失最高，分别为129.62 g/L和128.82 g/L；酵母干质量最高，分别为3.57 g/L、3.62 g/L；葡萄酒相对密度最低，分别为991和990.5；残糖最低，分别为3.38 g/L和3.68 g/L；酒精度最高，分别为16.5%vol和16.4%vol；且酒精发酵完全（残糖分别为3.38g/L和3.68 g/L，均＜4 g/L，符合国家标准对干型葡萄酒的要求，因此在发酵第3～4天（发酵进行到35%～45%之间）添加营养物质可有效解决或者预防葡萄酒的发酵停止或停滞的问题，使发酵完全达到国家对干型葡萄酒的要求。本研究中还缺乏添加营养对葡萄酒香气的影响，需要在后期进行深入的研究。
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