异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）是Wickerhamomyces属的微生物，有研究表明该酵母对白酒酿造过程中的酯类合成有促进作用，尤其是己酸乙酯、乙酸乙酯等白酒中重要的酯类物质[1-2]。浓香型白酒以高粱为主要原料，使用高温曲或中温曲作为糖化发酵剂，采用混蒸工艺酿造[3-4]，其酒体香气以酯香为主，各酯类物质的含量及比例对白酒酒体的风格形成起着至关重要的作用[5-6]。
己酸乙酯作为浓香型白酒的主体香，其在酒体中的含量、阈值，决定了浓香型白酒的品质[7-8]，其独特的香气与大量微生物的自发固态发酵系统和微生物间复杂的相互作用密切相关[9]。目前，已有不少学者利用有特殊功能的菌株人工强化接种于白酒的固态发酵，使白酒的品质得到改善。王松等[10]将产香酵母长孢洛德酵母（Lodderomyces elongis porus）Z9Y-91人工强化接种于复糟酒生产，结果表明，该酵母可以提高复糟酒产量，改善复糟酒品质；刘小改等[11]将一株产酯酵母应用于白酒的固态发酵，发现添加产酯酵母生产的原酒中酯类含量是对照组的1.5倍，同时原酒口感品质得到明显改善。
本研究选用前期从大曲中分离的一株具有产酯能力的异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y-1为实验菌株，将其应用于模拟浓香型白酒的固态发酵，考察其对酒醅理化性质、微生物结构及发酵结束时风味成分的影响，为其在浓香型白酒的应用中提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株及大曲
异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）Y-1：由工业微生物菌种保藏与选育河南省工程实验室筛选和保藏；生香活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；中高温大曲：宋河酒业股份有限公司。
1.1.2 化学试剂
2-辛醇（色谱纯）、玉米淀粉（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；酵母膏、蛋白胨（均为分析纯）：北京奥博星生物技术公司；KH2PO4、（NH4）2SO4、MgSO4、CaCl2（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
产酯培养基[12]：酵母膏10 g/L、NH4Cl 0.210 g/L、玉米淀粉2.9 g/L、蛋白胨20 g/L、（NH4）2SO4 0.1 g/L、KH2PO4 0.1 g/L、MgSO4 10 g/L、CaCl2 0.1 g/L。121 ℃灭菌200 min。
牛肉膏蛋白胨培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培养基、马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：上海瑞楚生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Trace 1300-ISQ 7000气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪：赛默飞世尔科技公司；固相微萃取装置（固相微萃取手柄、Supelco 57328-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头）：江苏默克仪器有限公司；ZHJH-C1112C超净工作台、ZQZY-CS全温恒温培养摇床、ZXSD-A1160恒温培养箱：上海智诚分析仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 白酒酿造工艺流程及操作要点
高粱→粉碎→浸泡→蒸粮→加水扬冷→酵母＋大曲→入坛发酵→蒸馏→白酒
操作要点：以浓香型白酒酿造工艺为基础酿造白酒[13]。称取高粱45 kg，用粉碎机粉碎成2～3瓣，加入原料粮总质量70%的热水进行浸泡，每隔6 h翻拌一次，浸泡24 h。浸泡结束后平铺上锅蒸煮80 min，将蒸好的高粱摊平晾凉，并加入原料粮总质量30%的凉水，拌匀后平均分成三等份，分别向原料中添加大曲和活化的微生物。发酵采用坛子发酵：1号坛中添加1.8 kg的中高温大曲＋原料粮总质量2%的蒸馏水（空白组）；2号坛中添加1.8 kg的中高温大曲＋原料粮总质量2%的安琪酵母种子液（活菌数为1×106 CFU/mL）（安琪酵母组）；3号坛中添加1.8 kg的中高温大曲+原料粮总质量2%的Wickerhamomyces anomalus Y-1种子液（活菌数为1×106 CFU/mL）（异常威克汉姆酵母Y-1组），拌匀后将坛子密封自然发酵30 d，经蒸馏得到白酒。
1.3.2 酒醅理化指标及微生物动态监测
每隔5 d分别从坛子的上层、中层及下层取酒醅，将其混合均匀后参考标准DB34/T 2264—2014《固态发酵酒醅分析方法》对酒醅进行前处理，参考文献[14]测定酒醅的pH值、水分、还原糖、淀粉和酸度；参考文献[15]对微生物进行计数。
1.3.3 挥发性风味物质的测定
采用顶空固相微萃取-气质联用技术测定酒醅中的挥发性风味成分。
顶空固相微萃取条件：称取酒醅样品2 g于150 mL的三角瓶内，向瓶内加入30 mL饱和食盐水，用移液枪准确加入5 μL 2-辛醇（内标液，0.072 g/L），放入一颗磁力搅拌转子，用保鲜膜将瓶口密封。插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头，纤维头置于三角瓶上部空间，50 ℃平衡10 min，平衡结束后120 r/min萃取50 min，萃取结束后取出手柄，直接进行GC-MS分析。
气相色谱及质谱条件：参考文献[16]。
定性定量方法：将检测到的物质与美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）11谱库进行比对定性，采用内标法半定量。
1.3.4 数据处理
所有理化指标实验进行3次重复，使用NIST11质谱数据库进行质谱原始数据比对，使用SPSS Statistics 26.0对数据进行差异显著性分析，采用Origin 2018进行绘图。
2 结果与分析
2.1 酒醅理化指标的动态变化
发酵过程中酒醅理化指标的检测结果见图1。
酒醅中酵母繁殖需要水分，糖化、发酵都以水分为媒介[17]。在发酵过程中，如果水分不断增加，则说明酒醅发酵越正常，越彻底[18]。由图1a可知，接种异常威克汉姆酵母Y-1组的酒醅在发酵结束时水分含量最高，达到75%，明显高于其他两组。分析主要原因可能是在发酵中后期酒醅内生成大量水，菌株Y-1能够充分利用酒醅中的营养物质，提高了酒醅微生物整体的代谢能力。在乙醇发酵阶段，代谢产生醇、酸、酯等化合物的时候，水也会伴随生成，间接说明菌株Y-1可以使酒醅产生更多化合物。酒醅的pH值对原酒的品质有着重要影响，酸是形成白酒诸多风味物质的前体物[19]。由图1b可知，接种异常威克汉姆酵母Y-1酒醅的pH值呈现持续下降趋势，其他两组的pH值在临近发酵结束时缓慢上升，由图1c可知，发酵结束时添加异常威克汉姆酵母Y-1组的酒醅酸度最高，一定程度上反映了异常威克汉姆酵母Y-1对有机酸的生成有一定促进作用。
图1 酒醅发酵过程中理化指标的动态变化
Fig.1 Dynamic changes of physicochemical indexes during fermented grains fermentation
淀粉是白酒发酵的基础，由于酒醅生酸、杂菌繁殖等原因，使酒醅中淀粉含量逐渐下降[20]。酒醅发酵过程中，还原糖的变化能够微妙反映发酵过程中的协调程度[21]。由图1d和图1e可知，发酵过程中，酒醅中的淀粉和还原糖含量整体都呈下降趋势，分析原因可能是还原糖作为整个发酵过程中的主要碳源，随着微生物的生长代谢，最终被消耗完全，淀粉也持续降解。空白组酒醅还原糖含量下降1.5%，淀粉含量下降2.1%，安琪酵母组酒醅还原糖含量下降1.5%、淀粉含量下降1.9%，异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅还原糖含量下降1.9%，淀粉含量下降2.3%，最终还原糖含量仅为1.8%，淀粉含量仅为5.2%，与安琪酵母相比，异常威克汉姆酵母Y-1可以提高发酵过程中淀粉及还原糖的转化率。在发酵过程中，异常威克汉姆酵母Y-1组的还原糖和淀粉的含量都处在酵母可以利用的低水平状态，酵母菌首先充分利用酒醅中残留的还原糖进行发酵，然后再利用淀粉，淀粉糖化形成的糖能够被酵母利用并转化成乙醇，不会累积在酒醅中。由此可见，接种Wickerhamomyces anomalus Y-1可以促进微生物菌群对酒醅整体的代谢利用水平提升，改善酒醅的内部环境。
2.2 酒醅微生物群落的动态变化
微生物是白酒发酵过程中最重要的生物因子，也是白酒风味形成的关键，发酵过程中菌落演替和结构变化会使酒醅中的风味物质组成发生改变，引起乙醇到乙酸再到酯类等一系列的变化，最终使白酒风味也发生变化[22]。随着发酵过程的进行，酒醅中各个成分的改变，微生物的生存环境也随之变化，各类菌群结构和数量也会有相应改变，最终具有生长优势的菌群将会稳定存在于酒醅中继续发酵，进行风味物质的代谢和积累[23]。发酵过程中，酒醅中的酵母菌、霉菌和细菌的动态变化见图2。
图2 酒醅发酵过程中微生物群落的动态变化
Fig.2 Dynamic changes of microbial community during fermented grains fermentation
酵母菌作为酒精代谢的核心功能菌群之一，对白酒酿造过程中的产香产酯也发挥着特有贡献[24]。由图2a可知，3组酒醅中的酵母菌落数均呈先快速升高后缓慢下降的趋势，且均在发酵第10天时达到最高值。发酵过程中，异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅的酵母数量最高，大量酵母存活，说明异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅中乙醇在持续生成，接种异常威克汉姆酵母Y-1后可适当通过延长发酵时间来提高出酒率。霉菌和细菌对白酒的品质也至关重要[25]。由图2b和2c可知，3组酒醅中的霉菌和细菌菌落数均呈先升高后下降的趋势，且均在发酵第10天时达到最高值。其中接种异常威克汉姆酵母Y-1组的霉菌和细菌数量最低，分析原因可能是，发酵初期大曲中存在的霉菌、细菌开始缓慢增长，随着发酵的进行，酵母菌的数量增多，霉菌和细菌的生长受到抑制。说明异常威克汉姆酵母的添加对霉菌、细菌的生长有一定抑制作用，酵母生长的越旺盛，对霉菌和细菌的抑制越明显。这也表明菌株异常威克汉姆酵母Y-1的接种量并不是越大越好，过大的接种量可能对酒醅菌群生态产生较大影响。
2.3 酒醅中挥发性风味物质的分析
酒醅中挥发性风味物质分析的GC-MS总离子流色谱图见图3，分析结果见表1。
由图3及表1可知，从3组酒醅中共检测出52种挥发性物质，包括23种酯类、10种醇类、6种挥发性酸类、6种酚类、7种其他化合物。3组酒醅中所检测到的主要物质有丁酸乙酯、己酸乙酯、戊酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯、异戊醇、异辛醇、异丁醇、丙醇、乙酸、己酸、辛酸，异常威克汉姆酵母Y-1组中特有的风味物质为愈创木酚、4-甲基愈创木酚等，这些风味物质对浓香型白酒的风味有着重要的影响[26]。
图3 不同组酒醅中挥发性风味成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.3 Total ion chromatograms of flavor components in fermented grains of different groups analyzed by GC-MS
由表1亦可知，空白组、安琪酵母组和异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅中酯类物质的含量分别为1 143.45 mg/kg、1 587.35 mg/kg、3 066.99 mg/kg。己酸乙酯为浓香型白酒的主要香味成分，具有菠萝香、味甜[27]。优质浓香型白酒中己酸乙酯的含量要求占总酯含量的40%以上，空白组酒醅中己酸乙酯含量只占总酯含量的32.2%，而接种异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅中己酸乙酯含量占总酯含量的54.8%，达到了优质浓香型白酒的要求。相较于其他两组，异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅中的己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯等酯类物质显著提升（P＜0.05），这些酯类物质都具有独特的气味，会使白酒风味更加突出、协调，具有层次感。
表1 不同组酒醅挥发性风味物质GC-MS分析结果
Table 1 Results of flavor substances in fermented grains of different groups analyzed by GC-MS
续表
注：“-”表示未检出；不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
空白组、安琪酵母组和异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅中醇类物质的含量分别为706.64 mg/kg、1 350.49 mg/kg、1 731.61 mg/kg。醇类物质使白酒的香气与味道紧密相连，普遍沸点较低，易挥发，在白酒中起着助香剂的作用，醇也构成了白酒一部分味觉的骨架，在白酒中呈甜味，醇类含量过低会缺乏白酒传统风味，含量过高则会导致酒的涩味增大，还会引起头疼、易醉等现象[28]。安琪酵母组和异常威克汉姆酵母Y-1组中的异戊醇含量明显高于空白组（P＜0.05），说明生香酵母对异戊醇的提高较为明显。异常威克汉姆酵母Y-1组中苯乙醇含量是空白组的3.37倍，是安琪酵母组的1.86倍，安琪酵母虽对苯乙醇含量也有一定的提升作用，但是异常威克汉姆酵母Y-1菌株相较安琪酵母更加突出。研究表明[29]，异常威克汉姆酵母具有较强的产苯乙醇能力，苯乙醇的存在可使白酒香气具有清甜玫瑰气味，使成品酒余味甘甜、清香。
空白组、安琪酵母组和异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅中挥发性酸类物质的含量分别为111.97 mg/kg、36.45 mg/kg、54.37 mg/kg，3组酒醅间相差较小，说明接种异常威克汉姆酵母Y-1并不会直接造成挥发性酸类物质含量的明显改变，影响白酒口感。白酒中酸的含量因等级、批次不同而各异，但是白酒中的酸度过高或过低都会影响白酒品质，酸味过大会导致酒味粗糙，入口尖酸，酸味过小会使合成风味物质的前体较少，导致风味较差，适量的酸可以使白酒风味协调，并且起到一定的缓冲作用[30]。
除酯、醇、酸三类白酒中的主要物质之外，在异常威克汉姆酵母Y-1组中还检测到愈创木酚、4-甲基愈创木酚、苯酚3种有益风味因子，愈创木酚具有抗氧化、抗肿瘤和增强人体免疫力的作用[31]，这几种化合物的感官特征具有类似药草及烟熏风味，虽然含量甚微，但在一定程度上也丰富了酒体的口感，使成品酒风味更加饱满[32]，除此之外，还检测出烷类、吡嗪类等化合物。
3 结论
本研究以自然发酵和添加安琪酵母发酵为对照组，以前期筛选出的一株异常威克汉姆酵母Y-1为出发菌株，将其应用于浓香型白酒的模拟固态发酵实验。结果表明，添加Wickerhamomyces anomalus Y-1可以明显提升微生物菌群对酒醅整体的代谢利用水平，改善酒醅内部环境。同时，酒醅中主要风味成分含量明显增加。发酵结束时，与其他两组相比，异常威克汉姆酵母Y-1组酒醅水分及酸度更高，淀粉和还原糖的利用更加彻底；酵母数量最多，霉菌和细菌数量最少；酯类（3 066.99 mg/kg）及醇类物质的含量（1 731.61 mg/kg）显著提高（P＜0.05），尤其是己酸乙酯、辛酸乙酯、庚酸乙酯、L-乳酸乙酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、苯乙醇、异戊醇、2,3,5,6-四甲基吡嗪等风味物质，此外，在异常威克汉姆酵母Y-1组还检测到愈创木酚等有益因子。本研究初步证实了Wickerhamomyces anomalus Y-1可以明显提高浓香型白酒酒醅产生风味物质的水平，具备提升固态浓香型白酒风味物质的潜力，但尚需要在后续中试生产中作进一步的验证研究。
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