猕猴桃又称羊桃、藤梨、奇异果等，为起源于我国的多年生落叶藤本植物[1]，其果实富含维生素C、维生素E、多酚等多种抗氧化物质，具有较高的营养价值[2]。据联合国粮农组织统计，截至2019年，我国的猕猴桃种植面积及产量稳居世界第一[3]，是名副其实的猕猴桃种植大国。
猕猴桃属于呼吸跃变型水果，其季节性强、成熟期集中、不耐储运的特点，使得产地面临巨大的仓储与销售压力[4]。目前我国的猕猴桃仍以鲜食为主[5]，猕猴桃深加工产业仍较为单一。大量的猕猴桃被用以制作果汁、果脯、果酱等产品，同质化程度高，且对猕猴桃的附加值提升十分有限[6]。
本试验以新鲜猕猴桃为原料，通过发酵与蒸馏获得猕猴桃白兰地，通过单因素试验及响应面试验优化猕猴桃白兰地的生产条件，以期丰富优质猕猴桃资源深加工产品，有助于缓解猕猴桃成熟期集中带来的销售难题，对于延长猕猴桃产业链，增加产品附加值，促进猕猴桃产业发展具有较强的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
优质无破损猕猴桃：市售；71 B降酸型活性干酵母：丹麦拉曼德有限公司；果胶酶（食品级，酶活力5万U/g）：河南万邦实业有限公司；蔗糖（食品级）、无水碳酸钠、无水乙醇（均为分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；pH 0.5～5.0精密pH试纸：上海三爱思试剂有限公司；医用级脱脂棉、脱脂棉纱布：浚县洁云卫生材料有限公司。
1.2 仪器与设备
SHP-250BШ型生化培养箱：北京中兴伟业世纪仪器有限公司；MA-A1-159型电蒸锅：中山市美澳塑胶制品有限公司；HHR-2W型手持式折射仪：成都豪创光电仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 猕猴桃白兰地酿造工艺流程及操作要点
猕猴桃→分选清洗→破碎打浆→酶解→调节糖酸度→接种酵母→主发酵→过滤→蒸馏→陈酿→猕猴桃白兰地
原料的筛选及预处理：筛选成熟度适中的猕猴桃[7]，使用蒸馏水进行表面清洗后，将果实连皮使用破壁机破碎，制备果浆。
酶解：向猕猴桃匀浆中加入70 mg/L[8]果胶酶充分搅拌，25 ℃静置2 h。
调节糖酸度：使用化学法进行初次降酸，向果胶酶处理后的果浆中加入1.8 g/L碳酸钠调节后总酸含量为4.6 g/L（以柠檬酸计）[9]；通过外源添加蔗糖的方式进行初始含糖量的调节。
酵母接种与主发酵：称取适量71B活性酵母干粉溶解于100 mL 35 ℃温水[10]，静置20 min进行活化。将活化后的酵母以一定接种量加入猕猴桃果浆中充分混匀，完成酵母接种。将接种完成后的果浆转入发酵罐内，每罐1 L（不超过容积的60%），于一定温度条件下进行发酵，当发酵液残糖＜6 g/L时视为发酵结束[11]。
过滤及蒸馏：发酵结束后，使用双层纱布进行醪液分离，去除发酵后的酒糟。获得的猕猴桃酒满罐密封、避光储存于16 ℃条件下，避免氧化对成品酒品质的不良影响。将过滤获得的猕猴桃酒置入蒸馏装置中，使用二次蒸馏法进行白兰地蒸馏：一次蒸馏温度约95 ℃，保留10%vol～70%vol酒精度的蒸馏酒，以提升获得的猕猴桃白兰地质量。二次蒸馏收集30%vol～70%vol酒精度的蒸馏酒，剩余的酒头与酒尾与预蒸馏的原酒混合，继续进行蒸馏[12-14]。
陈酿：将蒸馏后获得的猕猴桃白兰地放入储酒桶中满罐密封陈酿45 d[15]，以减轻新生产的白兰地所具有的辛辣、苦涩、刺激口感。陈酿过程中严格控制陈酿温度（15 ℃）及储藏室光线，持续监测酒液挥发酸含量，以避免对成品酒品质造成不利影响[16]。
1.3.2 猕猴桃白兰地酿造工艺条件优化单因素试验
发酵时间对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响：将破碎后的猕猴桃果浆糖度调整至17%，接种0.2 g/L活化后的干酵母，发酵温度为22 ℃，发酵时间分别为5 d、6 d、7 d、8 d、9 d[17]。发酵结束后蒸馏发酵液，得到酒精度为40%vol[18]猕猴桃白兰地进行感官评价并计算出酒率，探究发酵时间对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响。
发酵温度对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响：将破碎后的猕猴桃果浆糖度调整至17%，接种0.2 g/L活化后的干酵母，分别于18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃条件下发酵7 d[15]。发酵结束后蒸馏发酵液，得到酒精度为40%vol猕猴桃白兰地进行感官评价并计算出酒率，探究发酵温度对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响。
酵母接种量对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响：将破碎后的猕猴桃果浆糖度调整至17%，分别接种0.05 g/L、0.20 g/L、0.35 g/L、0.50 g/L、0.65 g/L活化后的干酵母[20]，发酵温度为22 ℃，发酵时间为7 d。发酵结束后蒸馏发酵液，得到酒精度为40%vol猕猴桃白兰地进行感官评价并计算出酒率，探究发酵过程中酵母接种量对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响。
初始糖度对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响：将破碎后的猕猴桃果浆糖度分别调整至13.6%、15.3%、17.0%、18.7%、20.4%，以0.2 g/L接种活化后的干酵母，发酵温度为22 ℃，发酵时间为7 d。发酵结束后蒸馏发酵液，得到酒精度为40%vol猕猴桃白兰地进行感官评价并计算出酒率，探究初始糖度对猕猴桃白兰地出酒率及感官评分的影响[21]。
1.3.3 猕猴桃白兰地酿造工艺条件优化响应面试验
选择发酵温度（A）、酵母接种量（B）、初始糖度（C）为响应面优化的3个考察因素，每个因素分别设定-1、0、1水平，以出酒率（Y1）、感官评分（Y2）为响应值，采用3因素3水平的响应面分析法进行Box-Behnken响应面试验，响应面试验因素与水平见表1。
表1 猕猴桃白兰地酿造工艺优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for kiwifruit brandy brewing process optimization
1.3.4 测定方法
总糖、总酸、挥发酸、酒精度的测定：按照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[22]。
出酒率的计算：参考GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[23]，先将所得原酒酒精度转化成50%vol，经查酒精度对照表，折算在标准大气压下，20 ℃时蒸馏出的白兰地体积（mL）及酒度。计算公式如下：
感官评价标准：感官评定由20名经统一培训的食品发酵专业老师及学生组成，采用9点类项标度的方法从香气、味道和色泽方面对猕猴桃白兰地进行感官评定。根据各位评委的评分计算均值，感官评定总分为各项评分均值之和，感官评价标准见表2。
表2 猕猴桃白兰地感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of kiwifruit brandy
续表
1.3.5 数据处理
使用Excel 2016进行数据整理及均值计算，使用Design Expert 8.0.6软件绘制回归模型及响应面分析图。
2 结果与分析
2.1 猕猴桃白兰地酿造工艺优化单因素试验结果与分析
2.1.1 发酵时间对猕猴桃白兰地感官评分及出酒率的影响
由图1可知，出酒率随发酵时间延长呈先上升后下降的趋势，发酵5 d时残糖偏高，发酵仍不完全，出酒率仅为7.89%；发酵7～8 d时，出酒率较稳定，为13.75%；至9 d时出酒率略有下降，为12.7%，这一现象可能与发酵过程中的酒精挥发有关，也可能是发酵末期酵母活力下降，导致杂菌生长分解酒精所致。感官评分随发酵时间延长呈先升高后趋于平稳的趋势，发酵3 d时发酵罐中开始产生果香；发酵5 d时发酵仍不完全，酒精含量低，香气物质含量较少，感官评分仅为75分；发酵7～9 d的感官评分维持在80分，但发酵7 d时，果香和发酵香气更为突出，随着发酵时间的延长酒体果香逐渐变淡，同时出现苦涩感。因此，选择发酵时间7 d为宜。
图1 发酵时间对猕猴桃白兰地出酒率和感官评分的影响
Fig. 1 Effect of fermentation time on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy
2.1.2 发酵温度对猕猴桃白兰地感官评分及出酒率的影响
由图2可知，出酒率随发酵温度升高呈先上升后下降的趋势，发酵温度18 ℃条件下酵母活力较弱、起酵速度慢、出酒率低，仅为7.37%；18～22 ℃区间内，出酒率与发酵温度呈正相关，发酵温度22 ℃时猕猴桃白兰地出酒率最高，为12.7%；发酵温度超过22 ℃后出酒率逐渐下降，这可能与酒精挥发及高温条件下酵母的过早老化相关[24]。感官评分随发酵温度升高呈先升高后降低的趋势，当发酵温度为18 ℃时，酒体具有明显苦涩感，这可能是酵母降酸能力受限造成有机酸含量升高所致；22 ℃时酵母的发酵活力强，猕猴桃白兰地的香气更加细腻优雅，感官评分为82分；发酵温度超过22 ℃时发酵速度显著加快且酵母老化也随之加快，快速的发酵也加剧了香气物质的挥发，造成香气质量下降。因此，选择发酵温度22 ℃为宜。
图2 发酵温度对猕猴桃白兰地出酒率和感官评分的影响
Fig. 2 Effect of fermentation temperature on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy
2.1.3 酵母接种量对猕猴桃白兰地感官评分及出酒率的影响
由图3可知，出酒率随酵母接种量的增大呈先上升后下降的趋势，当酵母接种量为0.05 g/L时，由于接入的酿酒酵母过少，造成了初期的发酵迟滞及后期的酵母老化，导致了出酒率的降低，仅为9.73%；当酵母接种量为0.35 g/L时，猕猴桃白兰地出酒率最高，为20.0%；而当酵母接种量＞0.35 g/L时，过多的酵母导致营养物质迅速被消耗，发酵基质环境迅速恶化，使得酵母大量死亡并发生自溶，最终导致出酒率的下降，为12%。感官评分随酵母接种量的增加呈先升高后降低的趋势，酵母接种量为0.05 g/L时，猕猴桃果浆不能较好的完成发酵，香气较为闭锁，且具有不良发酵风味，感官评分仅为75分；当酵母接种量为0.35 g/L时，酿酒酵母发酵性能最佳，猕猴桃果香浓郁且具有丰富的发酵香气，感官评分达到80分；当酵母接种量＞0.35 g/L时起酵较快，果香及发酵香气快速产生，但发酵期结束后留存的香气明显变淡，涩味也略有增加，感官评分有所降低。因此，选择酵母接种量0.35 g/L为宜。
图3 酵母接种量对猕猴桃白兰地出酒率和感官评分的影响
Fig. 3 Effect of yeast inoculum on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy
2.1.4 初始糖度对猕猴桃白兰地感官评分及出酒率的影响
由图4可知，出酒率随初始糖度的增大呈先上升后下降的趋势，初始糖度为13.6%时出酒率最低，为8.67%，可能是低糖度条件下酒精发酵底物不足所致；当初始糖度为17%时，猕猴桃白兰地的出酒率达到最高，为16.67%；初始糖度＞17%后，出酒率与含糖量呈反比下降，其原因可能为过高的初始糖度会对酿酒酵母产生渗透压胁迫，造成酵母前期活力不足，起酵困难，从而导致猕猴桃白兰地的出酒率降低[25]。感官评分随初始糖度的增加呈先升高后降低的趋势，初始糖度为13.6%时发酵速度慢，发酵结束后果香与发酵香气均较淡，感官评分仅有73分；当调整初始糖度为17%时，起酵速度较快，蒸馏过后得到的酒体香味较突出，感官评分最高，为82分；初始糖度＞17%时，高浓度的糖含量造成了发酵初期的渗透压胁迫，并在发酵末期促进了其他微生物的代谢，并最终影响了猕猴桃白兰地的品质。因此，选择初始糖度17%为宜。
图4 初始糖度对猕猴桃白兰地出酒率和感官评分的影响
Fig. 4 Effect of initial sugar content on liquor yield and sensory score of kiwifruit brandy
2.2 猕猴桃白兰地酿造工艺优化响应面试验结果及分析
2.2.1 回归模型建立及方差分析
使用Design Expert 8.0.6软件对Box-Behnken试验结果进行多元回归拟合，得到出酒率（Y1）、感官评分（Y2）与发酵温度（A）、酵母接种量（B）、初始糖度（C）间的二次多项回归模型：
出酒率：Y1=21.69+0.57A+0.78B+0.27C+AB-1.17AC+1.63BC-3.59A2-1.53B2-1.50C2
感官评分：Y2=83.20+1.13A+0.38B+1.25C+0.25AB+AC+0.5BC-3.73A2-3.73B2-3.47C2
表3 猕猴桃白兰地酿造工艺优化Box-Behnken试验设计方案及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments for kiwifruit brandy brewing process optimization
对出酒率试验结果进行方差分析，结果见表4。由表4可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），所得的回归方程能够很好的预测响应值；在回归分析模型中，一次项B和交互项AB、AC、BC及二次项A2、B2、C2均对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A对结果影响显著（P＜0.05），在响应值分析中占主要影响因素；在选取的各因素水平范围中，按照影响响应值的大小，排列顺序为B（酵母接种量）＞A（发酵温度）＞C（初始糖度），响应面结果方差分析中模型决定系数为0.983 9，调整决定系数R2Adj为0.963 2，证明拟合度较好，能够解释96.32%的响应值变化。
表4 以出酒率为评价指标的响应面试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface experiments results using liquor yield as evaluation index
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。下同。
对感官评价试验结果进行方差分析，结果见表5。由表5可知，该模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），所得回归方程能够很好的预测响应值；在回归分析模型中，一次项A、C及二次项A2、B2、C2均对结果影响极显著（P＜0.01），在响应值分析中占主要影响因素；在选取的各因素水平范围中，依据方程系数的估计值A=1.13，B=0.38和C=1.25，按照影响响应值的大小，排列顺序为C（初始糖度）＞A（发酵温度）＞B（酵母接种量），响应面结果方差分析中模型决定系数为0.979 0，调整决定系数R2Adj为0.952 1，证明拟合度较好，能够解释95.21%响应值的变化。
表5 以感官评分为评价指标的响应面试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of response surface experiments results using sensory score as evaluation index
2.2.2 出酒率响应面分析及优化
使用Design Expert 8.0.6软件根据出酒率回归模型绘制响应面分析图，以进一步研究各因素间交互作用对出酒率的影响作用，结果见图5。
由图5可知，发酵温度、酵母接种量、初始糖度间交互作用对猕猴桃白兰地出酒率影响的响应面均呈凸面，存在最高点，且等高线均呈椭圆形，说明各因素间交互作用对猕猴桃白兰地的出酒率的影响显著，与方差分析结果一致。
图5 发酵温度、酵母接种量、初始糖度交互作用对猕猴桃白兰地出酒率影响的响应曲面及等高线
Fig. 5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation temperature,yeast inoculum,initial sugar content on liquor yield of kiwifruit brandy
根据出酒率的回归模型方程得到猕猴桃白兰地的最佳发酵条件为发酵温度22 ℃，初始糖度18%，酵母菌接种量0.37 g/L，此时猕猴桃白兰地出酒率的预测值为21.93%。根据感官评分的回归模型方程得到猕猴桃白兰地的最佳发酵条件为发酵温度20.5 ℃，初始糖度14%，酵母菌接种量0.34 g/L，此时猕猴桃白兰地感官评分的预测值为85分。
由于出酒率与生产成本直接相关，且最高出酒率发酵条件下的预测感官评分（83分）与感官评分回归模型方程预测得到的最高感官评分（85分）差异较小，综合考虑，确定猕猴桃白兰地的最优发酵工艺为发酵温度22 ℃，初始糖度18%，酵母菌接种量0.37 g/L。
为验证模型的准确性，以分析得到的最佳发酵工艺进行验证试验，三组平行试验得到的出酒率分别为21.76%、21.88%和22.06%，均值为21.90%，与理论预测值21.93%非常接近，在此条件下得到的猕猴桃白兰地果香酒香浓郁，风味典型性，感官评分为81分。因此认为该响应面法优化猕猴桃白兰地酿造工艺较为准确，可应用到酿造白兰地实际生产中。
3 结论
本试验通过单因素试验及中心组合设计试验对猕猴桃白兰地的酿造工艺进行了优化，结果表明对出酒率影响的顺序为酵母接种量（B）＞发酵温度（A）＞初始糖度（C），对感官评分影响的顺序为C（初始糖度）＞A（发酵温度）＞B（酵母接种量）。以出酒率为主要评价指标，得出猕猴桃白兰地的最优工艺参数为发酵温度22 ℃、初始糖度18%，酵母菌接种量0.37 g/L。此条件下，出酒率可达21.90%，得到的猕猴桃白兰地果香酒香浓郁，风味典型性，感官评分为81分。证明响应面模型拟合效果较好。该工艺条件下所得的猕猴桃白兰地果香酒香浓郁，风味典型性，具有良好的应用前景。
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