香菇（Lentinus edodes）又名花蕈、香信、冬菰，是世界上仅次于蘑菇的第二大食用菌，由于其味道鲜美、气味怡人，在民间又被冠以“菇中皇后”的美称，可见人们对香菇的喜爱程度[1-2]。同时又是一种食药同源的食物，体内含有香菇多糖、有机碱、香菇嘌呤和一些矿物质元素，具有抗肿瘤[3]、增强免疫力[4]、抗氧化[5]、健脾保肝[6]、预防佝偻及贫血等功能[7]。据2019年统计数据显示，香菇依然是我国产量最大的食用菌，年产量可达300万t[8]。香菇柄是香菇在生产加工过程中的下脚料，香菇柄占整个香菇质量的25%～30%左右，产量较大。目前对香菇的应用主要集中在生物活性的提取、方便食品的研发等方面，但香菇调味品相关产品较少，覃财华[9]以香菇为原料，经复水工艺处理后，发现炒酱时间2.6 min，黄豆酱添加量56 g，辣椒添加量5.5 g时，香菇酱的感官评分为9.4分，成品色泽红艳润泽，香气浓郁；程洋洋等[10]以糯米、黄豆为原料，选用米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.04进行制曲制备香菇柄发酵酱糕。在单因素试验的基础上对发酵酱糕的制曲工艺进行响应面优化。结果表明，香菇柄发酵酱糕的制曲最优条件为糯米与黄豆质量比2∶3、米曲霉接种量0.8%、培养时间48 h、培养温度30 ℃。此条件下成曲蛋白酶活力为2 625.48 U/g。
发酵酱是一种利用微生物发酵制成的调味品，在3000多年前的周朝便开始生产食用[11]。目前生产和食用发酵酱的地区主要分布在亚洲。不同原料和发酵工艺对发酵酱的营养成分、氨基酸组成、挥发性成分影响较大，其中氨基酸组成和挥发性成分是评价品质的关键指标。目前氨基酸组成测定方法较为统一，主要采用氨基酸自动测定仪，而挥发性成分的测定方法较多，主要有气质联用技术（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、气相色谱-嗅闻仪（gas chromatograph-olfactometry，GC-O）等，部分研究还结合感官量化描述分析（quantitativedescriptiveanalysis，QDA）和相对气味活度值（relative odor activity value，ROAV）技术对挥发性成分进行研究[12-14]。这些检测技术的特点是样品用量少、少量的化学试剂和快速的色谱分离，缺点是前处理复杂、时间长、灵敏性较低，气相-离子迁移谱（gas chro matography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）作为一种新型的风味物质分析手段，具有灵敏度高、选择性强、操作简单、检测过程快速高效、仪器易携带、小型化等优点。
本研究使用香菇柄发酵酱与未添加香菇柄的传统发酵酱为研究对象，并对其进行水分、还原糖、氨基酸态氮、红色指数氨基酸等指标测定，采用气相色谱-离子迁移谱联用（GC-IMS）技术分析其挥发性风味成分，建立两种发酵酱的风味指纹图谱，以期为香菇柄的深加工及再利用及香菇柄发酵酱的产业化开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
香菇柄发酵酱、传统发酵酱：江西农业大学食品科学与工程学院制作。为保证测试样品品质，发酵结束后取出冷却至室温，置于-18 ℃冰柜中保存备用。
3,5-二硝基水杨酸（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、盐酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：阿拉丁试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
JH2102电子天平：上海精密科学仪器有限公司；GPX-9248A电热鼓风干燥箱：上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；GDYQ-1000S酱油氨基酸态氮快速测定仪：长春·吉大小天鹅仪器有限公司；L-8900日立氨基酸自动分析仪：日本日立公司；FlavourSpec
风味分析仪：德国G.A.S公司；MXT-5色谱柱（1 μm，0.53 mm×15 m）：美国RESTEK公司。
1.3 方法
1.3.1 香菇柄发酵酱与传统发酵酱的加工工艺流程及操作要点
（1）香菇柄发酵酱加工工艺流程：
糯米、黄豆→接种→制曲→烘干、粉碎→成曲→香菇柄粉、成曲→搅拌→食盐水→发酵→装罐→灭菌→成品
（2）传统发酵酱加工工艺流程：
糯米、黄豆→接种→制曲→烘干、粉碎→成曲→加食盐水→发酵→装罐→灭菌→成品
操作要点：
香菇柄粉的制备：去除杂质后洗净，放在阴凉通风处晾干表面水分，放入105 ℃烘箱内烘6 h，取出粉碎过40目筛子，放入密封袋中阴凉干燥处备用。
制曲：黄豆与糯米按照一定的比例混合，浸泡12 h后捞出沥干水分，在121 ℃高压灭菌锅中灭菌15 min，取出后摊开放置于桌面自然冷却至30 ℃以下，接种0.7%米曲霉As3.042，在30 ℃，培养48 h，中间进行两次通风翻曲，曲料表面布满黄绿色菌丝，完成制曲。
烘干、粉碎、成曲：将制曲过程中获得的成曲40 ℃烘制24 h，取出粉碎过20目筛子，放入密封袋中4 ℃冰箱保存。
加食盐水：称取60 g的食用盐放入烧杯中，加入1 000 g的蒸馏水溶解，得到6%食盐水，于高压蒸汽灭菌锅121 ℃灭菌10 min后冷却。
发酵：将粉碎后的成曲与盐水按1.0∶2.5的比例混合均匀并将密封后的发酵罐放置在恒温培养箱中，50 ℃恒温发酵20 d后取出装罐。
灭菌：灌装完成后的发酵酱进蒸屉排气，排气时迅速旋紧，高温高压灭菌（121 ℃、20 min），冷却后即得香菇柄发酵酱与传统发酵酱成品。
1.3.2 常规理化指标测定
水分含量测定：参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》。还原糖含量测定：参考GB/T 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》。氨基酸态氮含量测定：参照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》。红色指数测定：红色指数是豆酱色调表征方法之一，反映豆酱主要颜色的强弱，红色指数越大，红色色调越深。参照孙月琴[15]的方法并作修改。取0.5 g发酵酱，加入50 mL体积分数为70%乙醇溶液，60 ℃水浴1 h，冷却后2 400 r/min离心15 min澄清。紫外分光光度计测定波长510 nm和610 nm处的吸光度值A1、A2，红色指数计算公式如下：
。氨基酸含量测定：参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》。
1.3.3 挥发风味成分的测定
样品前处理：取发酵酱样品后搅拌均匀，取1 g样品置于20 mL顶空瓶中，55 ℃孵育20 min后进样，每个样品平行测定3次。
检测条件：气相-离子迁移单元：色谱柱柱温60℃；MXT-5色谱柱（1 μm，0.53 mm×15 m）；漂移气体为氮气（N2）（纯度＞99.999%）；IMS探测器温度45 ℃，样品分析时间20 min。
顶空进样单元：孵化温度55 ℃；孵化时间20 min；进样体积200 μL；进样针温度85 ℃；孵化转速500 r/min。
载气流速条件：初始2 min流速保持为2 mL/min，10 min内流速线性增加至10 mL/min，接着在后续10 min内增加至100 mL/min结束。
1.3.4 数据处理
采用SPSS 26.0软件进行数据统计分析；Microsoft Excel 2016软件进行绘图处理；氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成与含量分析；样品之间的挥发性物质定性分析、谱图差异、挥发性有机物差异利用FlavourSpec
机载插件进行分析。
2 结果与分析
2.1 香菇柄发酵酱与传统发酵酱常规理化指标测定结果
水分、还原糖、氨基酸态氮含量和红色指数是评价发酵酱的几个重要指标。香菇柄发酵酱与传统发酵酱理化指标测定结果见表1。由表1可知，香菇柄发酵酱中的水分（62.79%）和氨基酸态氮含量（0.76%）均低于传统发酵酱，还原糖含量（21.12%）、红色指数（1.44）均高于传统发酵酱。从发酵酱理化指标来看，香菇柄发酵酱与传统发酵酱品质基本无太大差别，说明添加制备香菇柄发酵酱可行，且其品质符合国标GB 2718—2014《酿造酱》的要求[16]。
表1 两种发酵酱常规理化指标测定结果
Table 1 Determination results of routine physical and chemical indexes of two kinds of fermented pastes
2.2 香菇柄发酵酱与传统发酵酱氨基酸测定
2.2.1 氨基酸组成
2种发酵酱中氨基酸的组成和含量测定结果如见表2。
表2 两种发酵酱中氨基酸含量测定结果
Table 2 Determination results of amino acid contents in two kinds of fermented pastes
注：“*”为必需氨基酸。
由表2可知，2种发酵酱中均检测出17种氨基酸，其中包括10种非必需氨基酸（non-essential amino acid，NEAA）和7种必需氨基酸（essential amino acid，EAA）。2种发酵酱中含量较高氨基酸均为谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸。在必需氨基酸中，亮氨酸的含量在2种发酵酱中均最高，分别为6.76 mg/g、7.86 mg/g，含量最低的必需氨基酸在香菇柄发酵酱中是苏氨酸，仅为3.53mg/g，传统发酵酱中是甲硫氨酸，为3.90mg/g。传统发酵酱的必需氨基酸、非必需氨基酸和总氨基酸含量（total amino acid，TAA）均高于香菇柄发酵酱，分别为87.71 mg/g、33.43 mg/g、54.28 mg/g。香菇柄发酵酱中的必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值（EAA/NEAA）为61.59，满足联合国粮食及农业组织（food and agriculture organization of the united nations，FAO）/世界卫生组织（world health organization，WHO）模式中对EAA/NEAA的要求（60%以上）是优质蛋白来源。
2.2.2 呈味氨基酸
氨基酸不仅具有一定的生理功能，而且具有一定的呈味特性，正是这一特点才使得氨基酸类化合物在食品中的广泛应用。根据氨基酸不同的呈味特性，主要分为四类氨基酸，分别是鲜味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸和芳香族氨基酸，有些还包括咸味氨基酸[17]。
如图1所示，呈味氨基酸按照相对含量排列依次为鲜味、苦味、甜味和芳香族。鲜味氨基酸在2种发酵酱中的含量分别为36.681 mg/g、42.978 mg/g，也是含量最高的呈味氨基酸，可见作为传统调味品的发酵酱在食用过程中主要是赋予鲜味；苦味氨基酸与甜味氨基酸在传统发酵酱中质量分数相差不大，而在香菇柄发酵酱中二者相差2.877 mg/g；相较于其他三种氨基酸，芳香族氨基酸含量较低，仅为9.481 mg/g和9.708 mg/g。由此可见，2种发酵酱中氨基酸的组成比例类似，在各种呈味氨基酸的相互作用下，表现出相似并各具特点的呈味特性[18]。
图1 两种发酵酱中呈味氨基酸比较
Fig.1 Comparison of flavor amino acids in two kinds of fermented pastes
2.3 香菇柄发酵酱与传统发酵酱挥发性成分测定
2.3.1 香菇柄发酵酱与传统发酵酱挥发性成分的二维图谱
通过GC-IMS分析的两种发酵酱中挥发性成分的二维谱图见图2。由图2可知，整个二位图谱的背景为深蓝色，在横坐标1.0处有一条红色竖线为经归一化处理后的反应离子峰（reaction ion peak，RIP），反应离子峰两侧分布着不同颜色且深度不一的斑点，每一个点代表一种挥发性有机物，颜色代表物质的浓度，颜色越深代表物质的浓度越大[19]；纵坐标为气相色谱的保留时间（retention time，RT），横坐标为离子迁移时间（drift time，DT）。同一种化合物可能会以单体、二聚体或多聚体形式出现，这是由于电离作用和物质的性质和浓度大小共同决定的[20]。从图2可以看出，将传统发酵酱谱图为背景扣除时，香菇柄发酵酱谱图中有很多红色斑点，说明菇柄发酵酱中的部分风味物质比传统发酵酱多。两种发酵酱中的挥发性成分可通过GC-IMS技术很好的进行分离，并通过系统所带软件识别不同挥发性物质的差异。
图2 两种发酵酱中挥发性成分的二维图谱
Fig.2 Two-dimensional chromatograms of volatile components in two kinds of fermented pastes
2.3.2 香菇柄发酵酱与传统发酵酱挥发性成分的指纹图谱对比分析
两种发酵酱中挥发性成分指纹图谱见图3。由图3可知，有些挥发性物质是共有的，区别仅在于峰体积的大小。主要有乙醇、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、甲基丙醛、丙酮等物质；香菇柄发酵酱中异戊醇、苯乙醛、苯甲醛、己醛、糠醛、乙酸、2-甲基丙酸乙酯2-戊基呋喃等物质的含量较高；传统发酵酱中芳樟醇、庚醇、3-甲基-3-丁烯-1-醇、2-甲基-1-丁醇、己醇、异丁醇、戊醛、丁醛、2-甲基丁酸乙酯、乙酸甲酯、3-羟基-2-丁酮、2-丁酮、2,3-丁二酮、己酸、戊酸、2-甲基-3-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,5-二甲基呋喃、二甲基三硫醚等物质的含量较高。
图3 两种发酵酱中挥发性风味成分的指纹图谱
Fig.3 Fingerprint of volatile flavor components in two kinds of fermented pastes
根据挥发性成分气相色谱的保留指数、保留时间和漂移时间，利用GC-IMS Library Search机载插件对所测物质进行定性分析，结果见表3。由表3可知，2种发酵酱共检测出32中挥发性成分，主要有8类化合物，其中醇类和醛类共17种，是发酵酱中主要的风味物质，其次为酯类和酮类，陈瑶等[21]采用利用气相-离子迁移色谱分析不同品种鱼子酱挥发性成分差异，发现鱼子酱中共鉴定出28种挥发性成分，其中醛类16种、酮类5种、醇类3种、烯烃类3种、酯类1种。
表3 两种发酵酱中挥发性成分的定性分析结果
Table 3 Qualitative analysis results of volatile components in two kinds of fermented pastes
续表
注：M代表单体；D代表二聚体。
醇类化合物主要由支链氨基酸、碳水化合物代谢产生，也可由脂肪氧化代谢产生[22]。乙醇在两种发酵酱中均检出，并且峰体积较大，说明乙醇含量较高，乙醇具有酒香味，在香菇柄发酵酱中含量较高，峰体积达到了1 977.517。醛类化合物是通过不饱和脂肪酸的降解产生，醛类挥发性成分一般都具有令人愉悦的花果香味、麦芽香味，同时也有较高的阈值[23-24]。醛类挥发性成分中峰体积最丰富的戊醛、2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、2-甲基丙醛，戊醛在传统发酵酱中峰体积比香菇柄发酵酱高了436.595。酯类化合物产生于发酵过程中醇类物质与酸类物质的酯化反应，主要为乙酯类化合物，二者差异较明显的酯类化合物为2-甲基丁酸乙酯[25]。共检测出4种酮类化合物，主要有3-羟基-2-丁酮、2-丁酮、丙酮，2,3-丁二酮含量在4种酮类化合物中峰体积最小。其他类化合物主要是酸类、吡嗪类、呋喃类、醚类化合物，两种发酵酱中均未检测出酚类和其他烃类化合物。
2.3.3 香菇柄发酵酱与传统发酵酱挥发性风味成分主成分分析
主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种重要的降维分析方法之一，利用数据最主要的方面代替原始数据，在食品指纹图谱研究中应用较为广泛[26]。利用GC-IMS图谱数据结合PCA，对不同产地翠冠梨果、不同部位安徽地方火腿、不同烤制过程大鲵肉、不同贮存时间酱香型白酒中的挥发性成分进行了区分研究[27-30]。选择差异峰对2种发酵酱挥发性风味成分进行PCA分析，结果见图4。由图4可知，第一主成分PC1方差贡献率为94%，第二主成分PC2方差贡献率为4%，PC1和PC2的累计方差贡献率为98%，可以很明显的将香菇柄发酵酱和传统发酵酱进行很好的区分。由图4可知，香菇柄发酵酱相对较为集中，而传统发酵酱相对较为分散，基于2种发酵酱挥发性风味成分可以将两种酱很好区分开。
图4 两种发酵酱中挥发性成分主成分分析结果
Fig.4 Principal component analysis results of volatile components in two kinds of fermented pastes
3 结论
通过对2种发酵酱种常规理化指标、氨基酸组成和挥发性成分进行测定，结果表明，香菇柄发酵酱中还原糖含量（21.12%）及红色指数（1.44）均明显高于传统发酵酱，其水分含量（62.79%）及氨基酸态氮含量（0.76%）稍低于传统发酵酱。两种发酵酱中均测出17种氨基酸（包含7种必需氨基酸），传统发酵酱、香菇柄发酵酱氨基酸总量分别为99.09 mg/g、87.71 mg/g，且两种发酵酱中呈味氨基酸比例相似。两种发酵酱均共检测出32种挥发性成分，包括醇类8种、醛类9种、酯类3种、酮类4种、酸类3种、吡嗪类2种、呋喃类2种、醚类1种。香菇柄发酵酱中的必需氨基酸与非必需氨基酸含量比值（EAA/NEAA）高于FAO/WHO模式中对优质蛋白EAA/NEAA的要求（60%）。2种发酵酱中呈味氨基酸含量从高到低依次为鲜味氨基酸＞苦味氨基酸＞甜味氨基酸＞芳香族氨基酸。
利用GC-IMS技术对2种发酵酱中的挥发性成分进行了分析，共鉴定出35种挥发性成分，研究发现2种发酵酱中挥发性成分组成相似，且都是由醇类化合物、醛类化合物在起主要作用。综上所述，香菇柄参与发酵过程制作香菇柄发酵酱具有理论可行性，在实际生产加工过程中应加大对以香菇柄为原料的深加工食品的开发与利用，可以有效地延长食用菌产业链，并创造经济价值。
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