葡萄是世界上种植规模最大、产量最多的水果之一[1]，其中75%的葡萄被用来酿造葡萄酒[2]。2018年我国葡萄酒产量已经跻身世界前十，是最具葡萄酒生产潜力的国家之一[3]。葡萄酒在酿造过程中会产生大量皮渣，皮渣中含有丰富的酚类物质，占果实总酚含量的90%以上[4]。白葡萄在酿酒时，皮渣不经过浸渍和发酵过程，皮渣中的酚类物质几乎没有损失。
白葡萄皮渣中的酚类物质主要为类黄酮类物质，包括黄酮醇和黄烷醇两大类，与葡萄酒中的辅色效应密切相关。GORDILLO B等[5]的研究结果显示，发酵时添加一定比例的白葡萄皮渣能够增强红葡萄酒的颜色表现，证明了白葡萄酒副产物作为外源添加剂提高红葡萄酒酚类潜力的可行性。类黄酮类物质不仅能够赋予葡萄酒艳丽的颜色，其具有的独特生物活性也能够对人的身体起到有效的保健作用。黄烷醇是比较复杂的一类类黄酮化合物，包括黄烷醇单体和原花青素，主要存在于果皮和种子中，多项研究证明，摄入黄烷醇有利于人体健康[6-7]。黄酮醇主要存在于果皮中，其生物活性通常比其相应的黄酮物质更强[8]，具有抗过敏[9]、抗炎症[10]、预防前列腺癌[11]、预防心血管疾病[12]和提高运动能力[13]等多种药理功能，还有研究报道摄入黄酮醇能够降低阿尔兹海默症患病风险[14]。
葡萄酒产业要达到可持续发展，就需要进行减废，将葡萄皮渣变废为宝，为葡萄酒产业带来更高效益。以往的研究多集中在分析红葡萄果皮和种子中的酚类物质组成和含量上，而对白葡萄果皮和种子中的类黄酮物质关注较少。该研究对6个常见的白葡萄品种果皮和种子中的类黄酮物质进行检测，以期为白葡萄皮渣的高效利用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 实验材料
本实验所用‘霞多丽’（Chardonnay）、‘长相思’（Sauvignon Blanc）、‘小芒森’（Petit Manseng）、‘贵人香’（Italian Riesling）、‘雷司令’（Riesling）和‘维欧尼’（Viognier）白葡萄果实：采自中国农业大学上庄实验站（40°08′12″N，116°10′45″E）的玻璃温室。除‘霞多丽’为2015年定植、‘小芒森’2012年定植外，其余品种均定植于2014年。栽植密度为4.0 m×1.0 m，南北行向，水平叶幕，主干高度为2.2 m，每个种植穴定植2株，两个龙干垂直于行向且反向延伸。葡萄园的管理采用常规管理，灌溉方式为滴灌。
1.1.2 试剂
类黄酮类物质标准品（槲皮素、儿茶素、表儿茶素、表棓儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、甲酸、甲醇、乙腈）（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；乙酸钠、甲醇（均为分析纯）：北京化工厂。
1.2 仪器与设备
Agilent 1200系列高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪、Poroshell120 EC-C18色谱柱（150mm×3.0 mm，2.7 μm）、Agilent 1200系列高效液相色谱仪串联离子阱、有可变波长检测器（variable wavelength detector，VWD）、ZorbaxEclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美国Agilent科技有限公司；BSA223S天平：赛多利斯有限公司；S63300HBT超声波仪：上海冠特超声仪器有限公司；FD-1C-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；Micro 17R离心机：赛默飞世尔科技公司。
1.3 方法
1.3.1 果实样品采集
‘长相思’、‘贵人香’和‘雷司令’于2018年8月21日采集，其余葡萄品种果实于2018年9月7日采集。每个品种共3次重复，每次重复选取10穗葡萄，随机采集100粒发育正常且无缺陷的果实为样品。样品在液氮中速冻后置于-80 ℃冰箱待测。
1.3.2 类黄酮类物质的提取
（1）冻干粉的制备
对葡萄果实进行剥皮/取籽，迅速将果皮/种子置于液氮中冷冻，用粉碎机打碎后，置于冷冻干燥机中冻干24 h，得到果皮/种子冻干粉。
（2）果皮黄酮醇的提取
提取果皮黄酮醇的具体操作如下[15]：准确称取0.100 g果皮冻干粉于2 mL离心管中，加入1 mL体积分数50%甲醇水溶液，低温避光超声萃取20 min后，置于离心机中在4 ℃，8000r/min条件下离心5 min，转移上清液到新的离心管中；将残渣按上述操作再提取一次，最后将两次提取的上清液合并摇匀，存于-80 ℃冰箱中待测。
（3）黄烷醇的提取
提取黄烷醇的方法参考LIANG N N等[16]的方法。提取游离黄烷醇的具体操作如下：准确称取0.050 g果皮/种子冻干粉于2 mL离心管中，加入500 μL 70%丙酮水溶液（含0.5%抗坏血酸），充分振荡后离心10 min（4 ℃，8 000 r/min），转移上清液至5 mL离心管中。将残渣按上述操作再提取两次，上清液合并摇匀。加入400 μL上清液于2 mL离心管中，避光条件下氮吹至完全吹干。加入200 μL甲醇（含1%盐酸）溶解，再加入200 μL乙酸钠水溶液（0.2 mol/L）中和，摇匀后于-80 ℃冰箱中保存待用。提取裂解黄烷醇的具体操作如下：准确称取0.100 g果皮/种子冻干粉于2.5 mL离心管中，加入1 mL间苯三酚缓冲液（50 g/L间苯三酚甲醇溶液，0.3 mol/L盐酸，0.5%抗坏血酸），于50 ℃水浴中避光加热20 min后，添加1 mL乙酸钠（0.2 mol/L），反应终止。在4 ℃，8 000 r/min条件下离心15 min，转移上清液至新的离心管中。将残渣按上述操作再提取两次，上清液合并摇匀，置于-80 ℃冰箱保存待用。
1.3.3 类黄酮类物质的检测
（1）黄酮醇的检测
采用高效液相色谱仪串联离子阱，样品测定前经0.22μm水系滤膜过滤，进样量50 μL。流动相A为水∶甲酸∶乙腈=865∶85∶50（V∶V），流动相B为水∶甲酸∶甲醇∶乙腈=215∶85∶450∶250（V∶V），流动相的流速为0.63 mL/min。洗脱程序根据文献[17]进行设定。
（2）黄烷醇的检测
黄烷醇的检测采用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪。样品测定前经0.22 μm水系滤膜过滤，进样量1 μL。洗脱采用的流动相A相为0.1%的甲酸水溶液，B相为含0.1%甲酸的乙腈-甲醇溶液50∶50（V/V）。检测器为多反应监测模式。黄烷醇的洗脱程序根据文献[17]分别设定。
1.3.4 类黄酮类物质的定性和定量
黄酮醇的定性依据为本实验室所建立的葡萄与葡萄酒酚类物质指纹谱库[18]。定量采用外标法，利用Qualitative Analysis of Masshunter软件进行峰面积积分作为定量依据，通过不同梯度标准品的峰面积和浓度的线性拟合曲线进行定量，其中黄酮醇定量以槲皮素为外标物，黄烷醇定量以儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯和表棓儿茶素为外标物。类黄酮类物质含量（mg/kg）以果实鲜质量表示。
1.3.5 数据处理及统计分析
采用SPSS 26.0进行统计分析，采用Excel制表，采用SIMCA 14.1进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。
2 结果与分析
2.1 葡萄果实理化指标的测定结果
检测各品种葡萄果实的基本理化指标，结果见表1。由表1可知，本实验所用葡萄果实均有较好的成熟度，供试品种果实的pH在3.29～3.87之间，可滴定酸含量在5.19～9.66 g/L之间，可溶性固形物含量在17.2～22.5°Bx之间，其中‘贵人香’（17.18°Bx）和‘雷司令’（18.7°Bx）的可溶性固形物含量显著低于其他品种（P＜0.05），‘小芒森’可滴定酸（9.66 g/L）含量显著高于其他品种（P＜0.05），此外‘小芒森’果实的浆果质量显著小于其他品种（P＜0.05）。
表1 葡萄果实的基本理化指标
Table 1 Basic physiochemical indexes of grapes
注：同一列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 黄酮醇含量的测定结果
黄酮醇类化合物具有优秀的生物活性和辅色能力，主要以糖苷化的形式存在于葡萄果皮中，且它的含量和种类与葡萄品种相关[19]。葡萄果皮黄酮醇含量检测结果见表2。由表2可知，‘小芒森’、‘长相思’和‘雷司令’的黄酮醇含量均在9.50 mg/kg以上，显著高于其余品种（P＜0.05）。在6个白葡萄品种果皮中共检测到5种黄酮醇类物质，槲皮素含量最高，约占总黄酮醇总量的80%以上，与MATTIVI F等[20]的研究结果相符，其中‘贵人香’果皮中的槲皮素-3-O-葡萄醛酸苷含量（4.86 mg/kg）显著高于其他品种（P＜0.05），而槲皮素-3-O-葡萄糖苷的含量（1.60 mg/kg）显著低于其他品种（P＜0.05）。此外，NOELIA C M等[21]研究调查了白色品种果皮黄酮醇的特征，在所有白色葡萄品种中均检测到了山奈酚、异鼠李素和槲皮素，而本实验仅在‘小芒森’和‘长相思’中检测到异鼠李素，仅在‘贵人香’和‘雷司令’中检测到芦丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷，可能是由于样品种植于玻璃温室，因紫外光滤减而抑制了葡萄果实黄酮醇的合成，这与LENK S等[22]的研究相符。与红葡萄品种不同，白色葡萄品种的果皮中没有检测到西伯利亚落叶松类黄酮醇、丁香亭和杨梅酮，有研究表明[23-24]，合成这些黄酮醇的基因在白葡萄品种中未表达。
表2 葡萄果皮黄酮醇含量的测定结果
Table 2 Determination results of content of flavonols in grape peel mg/kg
注：“nd”表示未检出。下同。
2.3 黄烷醇含量的测定结果
黄烷醇类化合物主要以原花青素的形式存在于葡萄果皮和种子中。原花青素具有很强的生物活性，具有抗氧化[25]、保护神经系统[26]、抗肿瘤[27]等作用，且安全无毒[28]，具有很高的利用价值。葡萄果皮中黄烷醇含量见表3，葡萄籽中的黄烷醇含量见表4。
表3 葡萄果皮黄烷醇含量的测定结果
Table 3 Determination results of contents of flavanols in grape peel mg/kg
由表3可知，‘维欧尼’葡萄果皮具有较高含量的原花青素（2.76 g/kg）显著高于其他品种（P＜0.05），‘小芒森’次之，‘贵人香’果皮中的黄烷醇含量最少。除原花青素外，供试葡萄果皮中的黄烷醇还包括含量较低的儿茶素、表儿茶素和表棓儿茶素，其中‘霞多丽’果皮中的儿茶素含量（6.93 mg/kg）显著高于其他品种（P＜0.05），‘贵人香’葡萄果皮中的表棓儿茶素含量（1.32 mg/kg FW）显著低于其他品种（P＜0.05）。此外，表儿茶素仅在‘霞多丽’和‘雷司令’种子中检测到。由表4可知，与果皮相比，葡萄籽中的各类黄烷醇化合物含量较高，与VIOLETA I等[29]的研究结果一致。此外，葡萄籽中含有表儿茶素没食子酸酯，没食子酰基化可以提高其活性[30]。‘小芒森’葡萄籽中的原花青素含量较高，且四种单体黄烷醇的含量也处在较高的水平，而‘长相思’葡萄籽中的原花青素和单体黄烷醇含量较少。与果皮相比，葡萄籽中黄烷醇的含量较高，仅‘维欧尼’葡萄种子中的黄烷醇含量低于果皮。
表4 葡萄籽中黄烷醇含量的测定结果
Table 4 Determination results of contents of flavanols in grape seed mg/kg
平均聚合度（mean degree of polymerization，mDP）能够说明原花青素在葡萄果皮和种子种的聚合程度。平均聚合度越高，代表分子质量大、空间结构复杂，无法透过生物膜被生物利用[3]。‘贵人香’果皮中原花青素平均聚合度最高（49.66），而‘霞多丽’果皮中原花青素的平均聚合度仅为26.11，平均聚合度最低。在葡萄籽中，‘贵人香’的平均聚合度（44.98）显著高于其余品种（P＜0.05），最低的是‘雷司令’（10.88）。此外，6个供试品种果皮中的原花青素平均聚合度均高于葡萄籽。
2.4 基于白葡萄果实类黄酮含量的主成分分析
为进一步探究白葡萄品种果实中类黄酮类物质的差异，本研究对类黄酮物质含量进行主成分分析（principal component analysis，PCA），结果见图1。由图1a可知，两个主成分共解释了61.0%的总方差（主成分1为35.4%，主成分2为25.6%）。从x轴方向看，主成分1能将六个白葡萄品种分成四组，‘贵人香’和‘霞多丽’、‘雷司令’位于正半轴，其中‘霞多丽’和‘雷司令’位于原点附近，‘小芒森’和‘长相思’、‘维欧尼’位于负半轴，其中‘长相思’和‘维欧尼’位于原点附近。结合图1b可知，‘贵人香’、‘霞多丽’和‘雷司令’均含有较多的表儿茶素，且‘贵人香’含有较多的芦丁；而异鼠李素、槲皮素-3-葡萄糖苷和果皮表棓儿茶素在‘小芒森’、‘长相思’和‘维欧尼’中含量较高，且‘小芒森’的葡萄籽中黄烷醇含量丰富。主成分2能够将白葡萄品种分为两组，其中‘霞多丽’、‘长相思’和‘维欧尼’位于y轴正半轴，‘贵人香’、‘雷司令’和‘小芒森’位于y轴的负半轴。结合载荷图，位于y轴正半轴的三个品种，其果皮中含有较多的黄烷醇；位于y轴负半轴的三个品种中，‘贵人香’和‘雷司令’果皮中芦丁和山奈酚含量较高，‘小芒森’种子中的原花青素含量较高。
图1 基于白葡萄果实类黄酮的主成分分析得分图（a）和载荷图（b）
Fig.1 Principal component analysis score plot (a) and loading plot(b) based on flavonoids in white grape
3 结论
白葡萄的皮渣在酿酒时不经过浸渍和发酵过程，可以较完整地保留皮渣中的酚类物质。科学利用白色酿酒葡萄皮渣不仅能提高原料利用率，还能减轻环境压力。本研究以玻璃温室种植的白色酿酒葡萄品种‘霞多丽’、‘长相思’、‘贵人香’、‘小芒森’、‘雷司令’、‘维欧尼’为材料，利用高效液相色谱-质谱联用技术检测其果皮、种子中的类黄酮类物质组成和含量，结果表明，‘长相思’、‘雷司令’和‘小芒森’果皮含有较多的黄酮醇，‘维欧尼’果皮黄烷醇含量较高，‘小芒森’葡萄籽中的黄烷醇含量最高。从黄酮醇种类上看，白色葡萄品种的果皮中没有检测到西伯利亚落叶松类黄酮醇、丁香亭和杨梅酮，仅‘小芒森’和‘长相思’含有异鼠李素，‘贵人香’和‘雷司令’含有芦丁和山奈酚-3-O-葡萄糖苷。此外，仅在‘霞多丽’和‘雷司令’的果皮中检测到表儿茶素。基于类黄酮物质含量的主成分分析可以将供试的白葡萄品种区分开，说明类黄酮物质的组成和含量与葡萄基因型有关。本研究结果为规模化提取白葡萄皮渣中类黄酮类物质提供了依据。
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