木质纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接的直链多糖，是地球上最丰富的可再生资源[1-3]。木质纤维素在纤维素酶系的协同作用下最终可被降解为葡萄糖：内切葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）随机作用于纤维素分子内部的非结晶区产生葡萄糖和短的纤维寡糖；外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）沿着纤维素非还原末端由外向里水解β-1,4-糖苷键释放纤维寡糖、纤维二糖或葡萄糖；β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）将纤维二糖或其他可溶性的纤维二糖和纤维寡糖水解成葡萄糖分子[4-5]，减少这些中间产物对葡聚糖外切酶和葡聚糖内切酶的的抑制，提高纤维素酶系的水解糖化率，在纤维素的降解中起着非常关键的作用[6-10]。
目前，应用的β-葡萄糖苷酶大都产自于真菌[11-12]，且对霉菌的研究较多[13]。β-葡萄糖苷酶是一种重要的工业酶，在多种生物转化中发挥重要作用，其被广泛应用于生物燃料[14-15]、造纸工业、纺织工业[16-17]、废弃物和食品的加工[18-20]。微生物所产的β-葡萄糖苷酶热稳定性差、产量低，严重制约了β-葡萄糖苷酶的工业化生产及应用[21-23]。因此，挖掘并纯化耐热的β-葡萄糖苷酶具有重要的意义。
本研究以前期从中国广西原始森林腐木的土壤中筛选得到的1株高产β-葡萄糖苷酶菌株芽枝霉菌（Cladosporium cladosporioides）Lcxs9[24]为研究对象，对其进行固态发酵产β-葡萄糖苷酶，采用硫酸铵沉淀及强阴离子交换柱对其所产β-葡萄糖苷酶进行分离纯化，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）对其分子质量进行检测，并对其酶学性质进行研究，以期为β-葡萄糖苷酶的应用奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株
芽枝霉菌（Cladosporium cladosporioides）Lcxs9：分离自广西环江县木论自然保护区原始森林腐木的土壤，保存于微生物及植物资源开发利用广西高校重点实验室。
1.1.2 试剂
蛋白浓度测定试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；蔗渣：宜州博庆制糖有限责任公司；七叶苷、水杨苷（均为分析纯）：上海晶纯试剂有限公司；葡萄糖（分析纯）：广州化学试剂厂；正丁醇、乙酸乙酯、氨水、三氯化铁、苯胺、丙酮、二苯胺（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）：（分析纯）：上海如吉生物科技发展有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基[25]：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1 000 mL煮沸30 min，4层纱布过滤，加20 g葡萄糖和15 g琼脂，定容至1 000 mL。121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
固体发酵培养基[26]：蔗渣6 g，麸皮4 g，Mandels营养盐液30 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min。
β-葡萄糖苷酶酶活快速检测平板[27]：三氯化铁0.03%，七叶苷0.1%，琼脂1.5%。
1.2 仪器与设备
NGC色谱系统：美国Bio-Rad公司；ZWY-2102型立式全温度恒温摇床：上海智城分析仪器制造有限公司；Infinite M200PRO全波长酶标仪：上海精密科学仪器有限公司；AvantiJE落地式离心机：美国贝克曼库尔特公司；PHS-3B型pH仪：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 芽枝霉菌Lcxs9的固体发酵
将芽枝霉菌Lcxs9划线接种于PDA培养基，30 ℃条件下活化培养3 d。芽枝霉菌Lcxs9 PDA斜面菌种用10 mL生理盐水洗下制成孢子悬液（108 CFU/mL），按10%的接种量将孢子悬液接种于固体发酵培养基中，每天翻动两次，30 ℃培养4 d。
1.3.2 β-葡萄糖苷酶酶活的测定
（1）DNS法
粗酶液的制备：培养物中加入200 mL无菌双蒸水（ddH2O），40 ℃恒温水浴1 h，四层纱布过滤，6 000 r/min离心10 min，取上清液，得到粗酶液[26]。
β-葡萄糖苷酶酶活的测定[27]：反应体系中添加0.05 mL适当浓度的酶液和1mL 1%水杨苷溶液底物（采用0.02 mol/L pH4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制）混匀，60 ℃条件下反应30 min，添加3 mL DNS试剂终止反应，沸水浴6 min后冷水浴，采用紫外分光光度计在波长540 nm处测定吸光度值。
β-葡萄糖苷酶酶活的定义[27]：每分钟产生1 μmol葡萄糖的酶量为1个酶活单位（U）。
（2）快速检测法[28]
取200 μL粗酶液点于β-葡萄糖苷酶酶活快速检测平板上，如果产生黑色沉淀点，说明具有β-葡萄糖苷酶酶活性。
1.3.3 可溶性总蛋白含量的测定方法
使用蛋白浓度测定试剂盒测定可溶性总蛋白质含量。
1.3.4 β-葡萄糖苷酶的纯化
盐析[29]：取7份粗酶液，每份100 mL，分别用相对饱和度为30%～90%（以10%的梯度递增）的硫酸铵进行沉淀，沉淀后于4 ℃条件下静置12 h过夜。盐析过夜后的酶液以8 000 r/min、4 ℃条件离心20 min，收集沉淀，并用pH 4.8的柠檬酸缓冲溶液溶解沉淀，并补足至原体积的1/5。
脱盐：采用Sephadex G-25凝胶柱快速脱盐，采用快速检测法测定β-葡萄糖苷酶酶活，依据酶活确定最佳硫酸铵纯化盐析区间，初步纯化酶产物4 ℃保存。
阴离子交换层析[30-31]：采用MonoQ10/100GL强阴离子交换层析柱，利用BioLogic Duo-Flow蛋白质纯化仪对初步纯化的酶进行进一步纯化，具体条件：Bio-压力530 psi，以pH 8.3的0.01 mol/L Tris-HCl为起始缓冲液，以含1 mol/L NaCl的pH为8.3的0.01 mol/L Tris-HCl为洗脱缓冲液，流速1 mL/min，0～0.3 mol/L NaCl线性梯度洗脱分离蛋白质，每管收集0.5 mL，纯化酶4 ℃保存。采用DNS法测定β-葡萄糖苷酶酶活，采用SDS-PAGE[32]法检测蛋白质的分子质量及纯度。
1.3.5 β-葡萄糖苷酶水解活性及转苷活性的测定
取10 mL 1%纤维二糖（采用0.02 mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液配制），按体积比100∶1加入纯化后的酶液，30 ℃反应3 h，采用薄层层析法（thin layer chromatography，TLC）检测水解产物[33-34]。
1.3.6 β-葡萄糖苷酶酶学性质测定
（1）最适pH及pH稳定性
将β-葡萄糖苷酶与pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的缓冲液混合，在最适温度条件下测定酶活，并计算相对酶活力，确定β-葡萄糖苷酶的最适pH值。
将β-葡萄糖苷酶置于pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的缓冲液中，于4 ℃放置24 h后，30 ℃保持3 h，在最适pH值和最适温度下测定酶活，并计算相对酶活力，研究pH对β-葡萄糖苷酶稳定性的影响。
（2）最适温度及温度稳定性
采用最适pH的缓冲液溶解β-葡萄糖苷酶，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃条件下测定酶活，并计算相对酶活力，确定β-葡萄糖苷酶的最适作用温度。
将β-葡萄糖苷酶分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80 ℃、90 ℃条件下恒温水浴保持60 min后，在最适pH和最适温度下测定酶活，并计算相对酶活力，研究温度对β-葡萄糖苷酶稳定性的影响。
（3）金属离子
纯化酶液中添加不同的金属离子Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni+、Cu2+、Ag2+、Co2+、Hg2+，使终浓度为2 mmol/L，测定酶活，并计算相对酶活，研究不同金属离子对β-葡萄糖苷酶活性的影响。
相对酶活的定义：以粗酶液酶活为100%，其他条件下的酶活性与粗酶液酶活性的比值为相对酶活。
酶促反应动力学参数的测定[35]：以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，pNPG）为底物，在pH4.8、30 ℃条件下测定酶活力，计算出相应的初始反应速度，利用双倒数作图法求得β-葡萄糖苷酶的米氏常数（Km）值和最大酶反应速率（Vmax）。
2 结果与分析
2.1 芽枝霉菌Lcxs9 β-葡萄糖苷酶的纯化
通过不同相对饱和度（30%～90%）的硫酸铵盐析后，测定β-葡萄糖苷酶酶活和可溶性蛋白含量，结果发现，当硫酸铵相对饱和度为70%时，β-葡萄糖苷酶酶活和可溶性蛋白含量最高。在此基础上，进一步采用MonoQ10/100GL强阴离子交换层析柱纯化β-葡萄糖苷酶，得到两个具有β-葡萄糖苷酶酶活的洗脱成分，分别编号为BG CC1、BG CC2，其酶活力和纯化情况见表1。
表1 芽枝霉菌Lcxs9产β-葡萄糖苷酶纯化过程
Table 1 Purification process of β-glucosidase produced by Cladosporium cladosporioides Lcxs9
由表1可知，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的比酶活力分别为6.6 U/mg和12.2 U/mg，纯化回收率分别为11.4%和17.7%，纯化倍数分别为10.8和15.3。采用SDS-PAGE对β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的纯度和分子质量进行测定，结果见图1。
图1 β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE检测结果
Fig.1 SDS-PAGE detection results of β-glucosidase
M为蛋白Marker，1为BG CC1，2为BG CC2，C为发酵原液。
由图1可知，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的分子质量分别为41 kDa和53 kDa，条带单一。
2.2 β-葡萄糖苷酶的水解活性及转苷活性
以1%纤维二糖为底物，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的水解活性及转苷活性见图2。由图2可知，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2均具有水解活性，可以水解纤维二糖得到葡萄糖；同时具有转苷活性，可以利用低分子质量的单糖合成纤维三糖和纤维四糖。
图2 β-葡萄糖苷酶水解性质和转苷活性测定结果
Fig.2 Determination results of hydrolysis properties and transglycosidation activity of β-glucosidase
1为四种糖（G：葡萄糖、C2：纤维二糖、C3：纤维三糖、C4：纤维四糖）混合标样；2为葡萄糖标样；3为纤维二糖标样；4为纤维二糖+BG CC1；5为纤维二糖+BG CC2。
2.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质测定结果
2.3.1 β-葡萄糖苷酶最适反应pH和pH稳定性实验
β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的最适反应pH和pH稳定性试验结果见图3。由图3A可知，在30 ℃条件下，随着pH值的升高，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的酶活均呈先升高后下降的趋势，当pH为6.0时，两种β-葡萄糖苷酶的酶活均最高，因此，确定两个β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值为6.0。由图3B可知，两种β-葡萄糖苷酶均在pH 3.0～12.0范围内较稳定，相对酶活均＞40%。CHRISTAKOPOULOS P等[36]研究发现，尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）所产的β-葡萄糖苷酶的最适pH为4.5；MATSUMOTO K等[37]研究发现，串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）所产的β-葡萄糖苷酶在pH 4.0～11.0范围内较稳定。芽枝霉菌Lcxs9所产的β-葡萄糖苷酶有较宽的pH耐受范围，说明具有更大的应用潜力。
图3 β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的最适pH（A）和pH稳定性（B）
Fig.3 Optimum pH (A) and pH stability (B) of β-glucosidase BG CC1 and BG CC2
2.3.2 β-葡萄糖苷酶的最适反应温度和热稳定性
β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的最适反应温度和热稳定性试验结果见图4。由图4A可知，在最适pH6.0时，随着反应温度的升高，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的酶活呈先升高后下降的趋势，当反应温度为60 ℃时，β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2的酶活力最高，因此，确定两种β-葡萄糖苷酶的最适反应温度均为60 ℃。由图4B可知，两种β-葡萄糖苷酶均在20～80 ℃范围内稳定性较好，相对酶活均＞50%。
图4 β-葡萄糖苷酶的最适温度（A）和热稳定性（B）
Fig.4 Optimum temperature (A) and thermostability (B) of β-glucosidase
CHAN C S等[38]分离纯化得到的β-葡萄糖苷酶DT-Bgl的最适作用温度为70℃，可用于开发木质纤维素生物质有效糖化的生物工艺；LIEW K J等[16]从Jeotgalibacillus malaysiensis中分离纯化获得一种新的β-葡萄糖苷酶BglD5（GH1），其在65 ℃条件下稳定；TIWARI R等[22]研究发现，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）产的β-葡萄糖苷酶RA10在80 ℃条件下稳定，热稳定性β-葡萄糖苷酶有助于纤维素生物质有效糖化为可发酵糖；XIA W等[23]研究发现，热稳定性好的纤维素酶（60 ℃时保持稳定）水解纤维素糖化效率显著提高。芽枝霉菌Lcxs9所产的β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃，在20～80 ℃范围内稳定性较好，说明具有更大的应用潜力。
2.3.3 金属离子对β-葡萄糖苷酶的影响
金属离子在酶的催化反应中常作为活化剂或抑制剂[39-40]，不同金属离子对β-葡萄糖苷酶BG CC1和BG CC2活力的影响见表2。由表2可知，Zn2+和Ni+对两种β-葡萄糖苷酶均无明显影响，Cu2+、Ag2+、Co2+、Hg2+对两种β-葡萄糖苷酶均有强烈的抑制作用，而Mn2+、Ca2+和Mg2+对两种β-葡萄糖苷酶均具有激活作用，分析原因可能是这些金属离子在低浓度下可以稳定酶的三级结构，并有助于酶活力中心与底物的亲和与结合催化过程，金属离子通过结合酶的活性中心从而影响酶的构象和活性[39-40]。
表2 金属离子对β-葡萄糖苷酶酶活的影响
Table 2 Effect of metal ions on the enzyme activity of β-glucosidase
2.3.4 β-葡萄糖苷酶动力学实验结果
利用pNPG为底物，测得芽枝霉菌Lcxs9所产两种β-葡萄糖苷酶的米氏常数Km均为2.76 mg/mL，最大反应速率（Vmax）均为20.6 U/mg。
3 结论
采用硫酸铵沉淀及强阴离子交换柱从芽枝霉菌Lcxs9固态发酵产物中分离纯化得到两种β-葡萄糖苷酶，分别命名为BG CC1和BG CC2，通过SDS-PAGE检测，其分子质量分别为41 kDa、53 kDa，比酶活力分别为8.6 U/mg、12.2 U/mg。两种酶都具有水解活性，可以水解纤维二糖得到葡萄糖；同时具有转苷活性，可以利用低分子质量的单糖合成纤维三糖和纤维四糖。两种酶的最适作用pH及温度均分别为6.0、60 ℃，均在pH 4～10和20～80 ℃条件下较稳定，Ag2+、Co2+、Cu2+、Hg2+对两种酶均有抑制作用，而Mn2+、Ca2+和Mg2+均有明显的激活作用，Zn2+和Ni+无明显影响。利用4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）为底物，两种酶的动力学常数Km和最大反应速率（Vmax）均分别为2.76 mg/mL、20.6 U/mg。本研究首次报道芽枝霉菌Lcxs9可以利用甘蔗蔗渣为碳源固态发酵产耐高温的β-葡萄糖苷酶。
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