青钱柳（Cyclocarya paliurus）又名摇钱树，是中国特有、国家二级保护的珍惜树种，广泛分布于浙江、江西、湖北和湖南等地[1-2]。青钱柳叶中含有黄酮、多糖、三萜、有机酸类等多种天然功能性活性物质[3-4]，在降血糖、降血压、降血脂、抗氧化等方面具有一定的功效[5-7]。基于青钱柳叶的药食兼用的价值，青钱柳叶茶已通过美国食品药品管理局的认证，青钱柳叶已列入中国新资源食品原料目录[8-9]。青钱柳干燥叶片中多糖含量范围为0.93%～5.36%[10-11]，青钱柳多糖是青钱柳叶中主要的活性物质之一，也是目前研究较多的青钱柳活性物质[12-14]。谢建华等[15]利用热水浸提法提取青钱柳多糖，其提取率为6.54%。李彦坡等[1]利用超声波辅助微波提取法提取青钱柳多糖，提取率为10.02%。胡文兵等[16]利用超声波辅助复合酶（纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶）法提取青钱柳多糖，其提取率为7.18%。鲁青等[17]采用微生物发酵法（黑曲霉（Aspergillus oryzae）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis））同步提取青钱柳多糖，其提取率为7.57%，较优化前增加50.50%。
酶菌协同发酵是指原料经酶解工艺后，再经微生物菌种发酵的过程[18]。酶解是利用纤维素酶和半纤维素酶的高效专一性破坏分解植物细胞等组织结构，提高目标天然活性物质的溶出量[19]，但不能解决青钱柳特有的苦涩味问题[17]。微生物发酵是通过菌种生长过程中产生各种酶系提高目标天然活性物质的溶出量[20]，此外，益生菌等菌种发酵不仅会产生功能性代谢产物和风味物质，也可以去除青钱柳的苦涩味[21]，但存在发酵酶系活力和酶量不足的问题。
本研究以产自江西九江修水县的青钱柳叶为原料，选用纤维素酶和半纤维素酶对青钱柳叶进行酶解，以高产纤维素酶的粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为发酵菌种对其酶解液进行发酵，以青钱柳多糖的含量为评价指标，通过单因素试验及响应面试验对酶菌协同发酵产青钱柳多糖的发酵工艺进行优化。以期获得青钱柳多糖含量较高、适口性好的发酵型青钱柳饮品，为青钱柳叶的精深加工和高值化利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
青钱柳叶：产自江西九江市修水县；粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：由江西省食品发酵研究所菌种保藏中心提供。
1.1.2 试剂
半纤维素酶（酶活100 000 U/g）、纤维素酶（酶活20 000 U/g）：宁夏和氏璧生物技术有限公司；硫酸、苯酚（均为分析纯）：天津金汇太亚化学试剂有限公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
营养肉汤培养基、马铃薯葡萄糖液体（potato dextrose broth，PDB）培养基：默克化工技术（上海）有限公司。
1.2 仪器与设备
T6紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：南通三思机电有限公司；FA1204电子天平：上海精科天美有限公司；YDJ-200B恒温摇床：英检达仪器（重庆）有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 种子液的制备
挑取4环斜面保藏的粗糙脉孢菌接种到装液量为80 mL/250 mL的PDB培养基中，摇床（30 ℃，140 r/min）培养24 h，制备粗糙脉孢菌种子液；挑取4环斜面枯草芽孢杆菌接到装液量为80 mL/250 mL的营养肉汤培养基中，摇床（35 ℃，140 r/min）培养18 h，得到枯草芽孢杆菌种子液。
1.3.2 青钱柳多糖的制备
取干燥粉碎后过20目筛的青钱柳叶，设置装料量为6.0 g/250 mL，按照料液比6∶100（g∶mL），加入蒸馏水后摇匀。按照青钱柳叶细粉质量的0.6%添加复合酶（纤维素酶和半纤维素酶质量比为1∶1），在55 ℃下恒温水浴酶解3.0 h后，在100 ℃下灭酶活20 min。按照酶解液后原料总质量的8%添加蔗糖，经121 ℃高压灭菌20 min后冷却，按照酶解液原料总质量的4%接种混合菌（粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌质量比为1∶1）种子液，置于恒温摇床（32℃，140 r/min）培养48 h。发酵液在5 ℃、8 000 r/min条件下离心15 min后，取上清液，检测发酵液中青钱柳多糖的含量。
1.3.3 青钱柳多糖的酶菌协同发酵工艺优化单因素试验
按照1.3.2的工艺条件，固定单因素试验条件为：料液比6∶100（g∶mL）、复合酶（纤维素酶和半纤维素酶）质量比1∶1、复合酶添加量0.6%、酶解时间3.0 h、蔗糖添加量8%、混合菌（粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌）质量比1∶1、混合菌接种量4%、发酵时间48 h。
以青钱柳多糖含量为评价指标，分别考察料液比（2∶100、4∶100、6∶100、8∶100、10∶100、12∶100（g∶mL））、纤维素酶和半纤维素酶质量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、复合酶添加量（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%）、酶解时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、蔗糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、粗糙脉孢菌与枯草芽孢杆菌质量比（1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1）、混合菌接种量（2%、3%、4%、5%、6%）和发酵时间（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h）对青钱柳多糖含量的影响。
1.3.4 青钱柳多糖的酶菌协同发酵工艺优化响应面试验
（1）Plackett-Burman试验设计
在单因素试验基础上，以青钱柳多糖含量为响应值，选取8个影响因素料液比（X1）、复合酶添加量（X2）、纤维素酶和半纤维素酶质量比（X3）、酶解时间（X4）、蔗糖添加量（X5）、混合菌添加量（X6）、混合菌质量比（X7）、发酵时间（X8），对8个因素的最优发酵条件范围分别取高、低两个水平，运用Plackett-Burman试验设计筛选对发酵液中青钱柳多糖含量影响显著的因素。Plackett-Burman试验设计因素及水平见表1。
表1 酶菌协同发酵工艺优化Plackett-Burman试验设计因素及水平
Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe
（2）Box-Behnken试验
根据Plackett-Burman试验结果，以发酵液中青钱柳多糖的含量（Y）为响应值，选择对结果显著性影响的因素纤维素酶和半纤维素酶质量比（A）、蔗糖添加量（B）和混合菌添加量（C）为自变量，进行Box-Behnken试验优化，Box-Behnken试验因素及水平见表2。
表2 酶菌协同发酵工艺优化Box-Behnken试验设计因素及水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbe
1.3.5 青钱柳多糖含量的测定
采用苯酚-硫酸法[22]测定多糖含量。
1.3.6 数据处理采用Design-Expert 8.0.6软件进行Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计，采用Design-Expert 8.0.6和SPSS 22.0软件对试验数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 青钱柳多糖的酶菌协同发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 料液比对青钱柳多糖含量的影响
料液比对青钱柳多糖含量的影响见图1。由图1可知，随着料液比在2∶100～8∶100（g∶mL）范围内的逐渐增加，发酵液中的青钱柳多糖含量呈增加的趋势；当料液比为8∶100（g∶mL）时，发酵液中青钱柳多糖含量达到最高值，为2.46 mg/mL；当料液比为8∶100～12∶100（g∶mL）时，青钱柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，料液比太小不利于青钱柳的充分发酵，而随着料液比的增加，有利于多糖从组织细胞内溶出到周围溶液中，但过大的料液比也会造成有效成分损失，青钱柳叶干燥粉浓度相对降低进而导致青钱柳多糖含量的减少[23]。因此，选择最适的料液比为8∶100（g∶mL）。
图1 料液比对青钱柳多糖含量的影响
Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus
2.1.2 复合酶添加量对青钱柳多糖含量的影响
复合酶添加量对青钱柳多糖含量的影响见图2。由图2可知，随着复合酶添加量在0.2%～0.8%范围内的增加，发酵液中的青钱柳多糖含量呈现先增加的趋势；当复合酶添加量为0.8%时，发酵液中的青钱柳多糖含量达最大值，为2.43 mg/mL；当复合酶添加量＞0.8%之后，青钱柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，复合酶添加量低时酶解不充分，青钱柳多糖和其他活性物质等溶出较少，发酵液中营养元素不是发酵菌的最佳生长条件，导致发酵液中青钱柳多糖含量较少；随着复合酶添加量的增加，酶解效果较好，青钱柳多糖和其他活性物质等溶出较高，但发酵菌生长较快，多糖等营养物质消耗也较快，导致发酵液中青钱柳多糖含量缓慢下降[24]。因此，选择最适复合酶（纤维素酶与半纤维素酶）添加量为0.8%。
图2 复合酶添加量对青钱柳多糖含量的影响
Fig.2 Effect of compound enzyme addition on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus
2.1.3 复合酶质量比对青钱柳多糖含量的影响
纤维素酶和半纤维素酶质量比对青钱柳多糖含量的影响见图3。由图3可知，随着复合酶（纤维素酶与半纤维素酶）质量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1的变化，发酵液中青钱柳多糖含量呈上升趋势；当复合酶质量比为2∶1时，青钱柳多糖含量达最大值，为2.35 mg/mL；当复合酶质量比高于2∶1时，青钱柳多糖含量略有下降。分析原因可能是随着纤维素酶质量占比的增加，酶解出的青钱柳多糖含量等营养活性物质逐渐增加，发酵菌在较低的纤维素酶质量占比时，生长较慢，水解出的青钱柳多糖较少，但纤维素酶质量占比较高时，发酵菌生长较快，消耗青钱柳多糖等营养物质较快，青钱柳多糖含量略有降低[25]。因此，选择最适纤维素酶与半纤维素酶质量比为2∶1。
图3 纤维素酶和半纤维素酶质量比对青钱柳多糖含量的影响
Fig.3 Effect of cellulase and hemi cellulase mass ratio on polysaccharide contents of Cyclocarya paliurus
2.1.4 酶解时间对青钱柳多糖含量的影响
酶解时间对青钱柳多糖含量的影响见图4。由图4可知，随着酶解时间在1.0～2.5 h范围内的增加，发酵液中青钱柳多糖的含量呈现增加的趋势；当酶解时间为2.5 h时，青钱柳多糖含量达最大值，为2.26 mg/mL。酶解时间＞2.5 h之后，青钱柳多糖含量下降。其原因可能是，青钱柳多糖会受酶解作用的影响发生部分水解，导致青钱柳多糖含量降低[26]。因此，选择最适酶解时间为2.5 h。
图4 酶解时间对青钱柳多糖含量的影响
Fig.4 Effect of enzymolysis time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus
2.1.5 蔗糖添加量对青钱柳多糖含量的影响
蔗糖添加量对青钱柳多糖含量的影响见图5。由图5可知，随着蔗糖添加量在4%～8%范围内的增加，发酵液中青钱柳多糖的含量呈先增加的趋势；当蔗糖添加量为8%时，青钱柳多糖含量达最大值，为2.22 mg/mL；当蔗糖添加量＞8%之后，青钱柳多糖含量下降。分析原因可能是，作为培养基的蔗糖浓度过高，发酵菌种细胞的渗透压过大，菌体生长缓慢，导致青钱柳多糖含量降低[27]。因此，选择最适的蔗糖添加量为8%。
图5 蔗糖添加量对青钱柳多糖含量的影响
Fig.5 Effect of sucrose addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus
2.1.6 混合菌添加量对青钱柳多糖含量的影响
混合菌添加量对青钱柳多糖含量的影响见图6。由图6可知，随着混合菌添加量在2%～4%范围内的增加，发酵液中青钱柳多糖含量增加；当混合菌添加量为4%时，青钱柳多糖含量达最大值，为2.22 mg/mL；当混合菌添加量＞4%之后，发酵液中青钱柳多糖含量下降。分析原因可能是，混合菌添加量过高，会使培养基中营养物质不能满足发酵菌种的生长，同时消耗培养基中的多糖等活性物质满足菌种的生长，导致发酵液中的青钱柳多糖含量降低[28]。因此，选择最适的混合菌（粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌）添加量为4%。
图6 混合菌添加量对青钱柳多糖含量的影响
Fig.6 Effect of mixed microbes addition on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus
2.1.7 混合菌质量比对青钱柳多糖含量的影响
混合菌质量比对青钱柳多糖含量的影响见图7。由图7可知，随混合菌（粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌）质量比在1∶3、1∶2、1∶1、2∶1范围内的变化，发酵液中青钱柳多糖含量呈现先增加的趋势；当混合菌质量比为2∶1时，发酵液中
图7 粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌质量比对青钱柳多糖含量的影响
Fig.7 Effect of Neurospora crassa and Bacillus subtilis mass ratio on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus
青钱柳多糖含量达到最高值（2.36 mg/mL）；当混合菌质量比＞2∶1时，发酵液中青钱柳多糖含量下降。究其原因可能是，粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌在生长过程中，会分泌大量有利于粗纤维和木质素降解的纤维素酶系和其他水解酶，有利于细胞组织结构中多糖的释放到发酵液中[29]。混合菌质量比的不同，菌种自身生长和代谢所需要的营养物质不一样，菌种间相互生长和代谢的制约程度不一样[30]。因此，选择最适的混合菌（粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌）质量比为2∶1。
2.1.8 发酵时间对青钱柳多糖含量的影响
发酵时间对青钱柳多糖含量的影响见图8。由图8可知，随着发酵时间在24～60 h范围内的延长，青钱柳多糖含量呈现先增加的趋势；当发酵时间为60 h时，青钱柳多糖含量达最大值，为2.56 mg/mL；发酵时间＞60 h后，发酵液中的青钱柳多糖含量有所下降。分析原因可能是，发酵菌种进入生长的衰老期，分泌的酶量不再增加，同时发酵菌产生了能降解青钱柳多糖的酶，使青钱柳多糖含量逐渐减低[31]。因此，选择最适的发酵时间为60 h。
图8 发酵时间对青钱柳多糖含量的影响
Fig.8 Effect of fermentation time on polysaccharide content of Cyclocarya paliurus
2.2 青钱柳多糖的酶菌协同发酵工艺优化响应面试验结果
（1）Plackett-Burman试验结果
在单因素试验基础上，以青钱柳多糖含量（Y）为响应值，选取8个因素料液比（X1）、复合酶添加量（X2）、纤维素酶和半纤维素酶质量比（X3）、酶解时间（X4）、蔗糖添加量（X5）、混合菌添加量（X6）、粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌质量比（X7）、发酵时间（X8），按照Plackett-Burman试验设计，在不同发酵条件下进行试验，结果见表3，运用Design-Expert 8.0.6对表3的数据进行处理，结果见表4。
表3 酶菌协同发酵工艺优化Plackett-Burman试验设计结果与分析
Table 3 Results and analysis of Plackett-Burman tests design for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes
由表4可知，模型的P值为0.015 1，表示该模型显著（P＜0.05）；模型的决定系数R2=0.982 2，调整决定系数R2Adj=0.934 7，说明存在93.47%的试验数据可用该模型解释。从各因素的P值可以看出，纤维素酶和半纤维素酶质量比（X3）对发酵液中青钱柳多糖含量的影响极显著（P＜0.01），蔗糖添加量（X5）和混合菌添加量（X6）对发酵液中青钱柳多糖含量的影响显著（P＜0.05）。因此，选择纤维素酶和半纤维素酶质量比、蔗糖添加量和混合菌添加量3个因素进行Box-Behnken试验设计。
表4 Plackett-Burman试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman tests results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。下同。
（2）Box-Behnken试验结果
在上述试验的基础上，固定不显著影响因素分别为料液比8∶100（g∶mL）、复合酶添加量0.8%、酶解时间2.5 h、粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌质量比2∶1、发酵时间60 h。以青钱柳多糖含量（Y）为响应值，以纤维素酶和半纤维素酶质量比（A）、蔗糖添加量（B）和混合菌添加量（C）3个因素进行Box-Behnken试验设计。Box-Behnken试验设计及结果见表5，方差分析结果见表6。
表5 酶菌协同发酵工艺优化Box-Behnken试验设计及结果
Table 5 Design and results of Box-Behnken tests for process optimization of co-fermentation with enzyme and microbes
表6 回归模型方差分析
Table 6 Variance analysis of regression model
运用Design-Expert 8.0.6软件对表5数据进行统计分析，经多元回归拟合，得到模型的二次多项式方程为：
由表6可知，该模型P＜0.000 1，表明建立的模型极显著（P＜0.01）；失拟项P值=0.401 2，不显著（P＞0.05），表明建立的模型拟合度较好[32]；模型的决定系数R2为0.988 1，调整决定系数R2Adj为0.972 9，表明97.29%的响应值变化能由该模型进行解释，实际试验与模型建立的方程拟合度较好，能用于分析和预测发酵液中青钱柳多糖的工艺优化。由P值可知，一次项A、C，交互项AB、BC，二次项A2、B2和C2对发酵液中青钱柳多糖含量的影响极显著（P＜0.01），其他因素均不显著（P＞0.05）。模型的F值越大对青钱柳多糖含量的影响越大[33]。由F值可知，各因素对酶菌协同发酵青钱柳多糖含量的影响程度为：C（混合菌添加量）＞A（纤维素酶和半纤维素酶质量比）＞B（蔗糖添加量）。
各因素交互作用对酶菌协同发酵产青钱柳多糖影响的响应面及等高线见图9。
图9 各因素间交互作用对酶菌协同发酵产青钱柳多糖含量影响的响应面及等高线
Fig.9 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the contents of polysaccharide from Cyclocarya paliurus
自变量因素对响应值的影响与响应面坡度陡峭程度呈正相关[34]；等高线呈椭圆形的程度与两个自变量交互作用的程度呈正相关[35]。由图9可知，AB和BC的交互作用对响应值的影响较大，随着各因素数值的增大，青钱柳多糖含量呈现先增大后减少的趋势，响应面呈凸型陡峭曲面，对应的等高线呈椭圆形，表明AB和BC的交互作用显著（P＜0.05），青钱柳多糖含量存在极大值；而AC有交互作用，但不显著（P＞0.05），这与方差分析结果一致。
2.3 验证试验
根据模型的回归方程分析，获得最佳的酶菌协同发酵产青钱柳多糖工艺条件为：纤维素酶和半纤维素酶质量比1.8∶1.0、蔗糖添加量8.33%、混合菌添加量4.91%。在此最佳条件下，青钱柳多糖含量理论值可达3.35 mg/mL。考虑具体试验的可操作性，修正最佳工艺条件为：复合酶添加量0.8%、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%。在此优化条件下，青钱柳多糖含量的实际值为3.34 mg/mL，与预测值的相对误差为0.30%，说明该模型准确度良好。
3 结论
以发酵液中青钱柳多糖含量为响应值，采用单因素试验结合响应面试验优化酶菌协同发酵产青钱柳多糖的工艺条件。最终确定最佳工艺条件为：料液比8∶100（mg∶mL）、复合酶添加量0.8%、纤维素酶和半纤维素酶质量比1.8∶1.0、酶解时间2.5 h、蔗糖添加量8.0%、混合菌添加量5.0%、粗糙脉孢菌和枯草芽孢杆菌质量比2∶1、发酵时间60 h。在此优化条件下，发酵液中青钱柳多糖含量为3.34 mg/L。该方法结合了酶解法和微生物发酵法，酶菌协同发酵克服了单一酶解时青钱柳有苦涩味问题和单一微生物发酵酶系不足等问题，显著提高了青钱柳多糖的含量，可为青钱柳精深加工提供物质基础，为青钱柳的高效利用开创了新的途径，对制备适口性强和高含量青钱柳多糖的产品有一定的产业化意义。
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