我国为食醋生产和消费大国，诞生了山西老陈醋、镇江香醋、保宁麸曲醋、红曲醋四大名醋，区别于其他国家的苹果醋、香酯醋、雪梨醋、黑醋[1-3]，大部分食醋采用传统固态发酵方式，以大曲、药曲或麦曲为糖化发酵剂，通过开放式的发酵工艺，酿造了色香味俱佳的调味佳品[4-5]。由于开放式的生产工艺、复杂的原料种类、乙醇和乙酸转化率低的原因，导致原料利用率低、发酵周期长、劳动强度大[6-7]。而液态发酵方式快速酿造食醋具有原料利用率高、生产周期短、自动化程度高的优点，逐渐为我国企业所接受，但其酿造的食醋有机酸单一、刺激性强、风味差，因此提升食醋生产效率和品质成为研究热点[7-9]。随着人民生活水平的提高，消费者对醋的要求不仅仅是一种调味品，而是一种集营养、功能、风味于一体的果粮复合饮用醋。目前已有关于果粮酿醋的研究报道，王荣荣等[10]以燕麦和苹果为原料，制备的果粮醋具有较高的抗氧化性；苏佳等[11]研究了利用水果刺梨、野木瓜与大米、马铃薯组合酿造果粮醋，发现刺梨与大米糖化液以1∶2混合，制备的醋产品具有明显刺梨果香的果粮醋；全亮等[12]研究了苹果甘薯复合果粮醋，制备兼具双原料特征的风味醋。
葡萄因其糖分高，含有苹果酸、琥珀酸、酒石酸等多种有机酸，常被用来酿造果酒和果醋[13-14]。糯米支链淀粉含量高、易糊化和糖化，经酿造微生物作用后残留一定量的糊精而使得食醋的浓甜适口、酸味柔和，成为镇江香醋的主要酿醋原料[15-16]。
本研究以葡萄和糯米为原料，制备葡萄糯米香醋，以酒精度和感官评分为评价指标，采用正交试验设计优化其酒精发酵条件；以总酸含量和感官评分为评价指标，优化其醋酸发酵工艺条件，并对该产品挥发性成分、理化指标及感官品质进行分析。以期制备一种兼具葡萄果醋和糯米醋优点、具有葡萄果香气和酸甜宜人的果粮复合饮用香醋，为葡萄糯米果粮香醋工业化生产提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
糯米：镇江丹和醋业有限公司；赤霞珠葡萄（糖度为25%）：湖北省丹江口武当生物工程有限公司；黄酒高活性干酵母、葡萄酒高活性干酵母（Saccharomyces cerevisiae）RV002：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌（Acetobacter aceti）AS1.01：广东省微生物研究所菌种保藏中心。
1.1.2 试剂
白砂糖：市售；耐高温α-淀粉酶（4 000 U/g）、糖化酶（10万U/g）、果胶酶（500 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、无水乙醇、氯化钠、乙酸乙酯、氢氧化钠、乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
醋酸菌活化培养基：0.1g/L葡萄糖、0.1g/L酵母膏、0.2g/L琼脂，115 ℃灭菌15 min后冷却至50 ℃加入体积分数3%的乙醇。
醋酸菌液体种子培养基：0.1 g/L葡萄糖、0.1 g/L酵母膏、115 ℃灭菌15 min后冷却至50 ℃加入体积分数4%的乙醇。
1.2 仪器与设备
SPME手动进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头：美国Supelco公司；7890A/5975C气相色谱-质谱（gaschromatography-massspectrometer，GC-MS）联用仪、DB-WAX毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国安捷伦公司；PC-420磁力恒温搅拌器：美国Corning公司；NAR-3T爱拓阿贝折光仪：广州市爱宕科学仪器有限公司；MSF-S-50L自动型机械搅拌罐：南京汇科生物工程设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 葡萄糯米香醋加工工艺流程及操作要点
操作要点：
葡萄浆液的制备：挑选无霉烂的葡萄，去梗、清洗，榨汁机破碎、打浆，加入0.5%的果胶酶，40 ℃保温酶解2 h，得到葡萄浆液。
糯米糖化醪的制备：以糯米∶水（1∶4）的质量比加饮用水，加热至100 ℃，常压蒸煮20 min后，90～95 ℃保温，加入0.05%耐高温α-淀粉酶，保温15 min后降温至65 ℃，加入0.2%糖化酶，62～65 ℃保温4 h后，得到糯米糖化醪，迅速降温至40 ℃。
混合调配：根据葡萄与糯米的质量比，计算葡萄浆液和糯米糖化醪的混合比例为2∶5，搅拌均匀，用饮用水或白砂糖调整糖度为18%。
酒精发酵：取葡萄质量0.2%的葡萄酒高活性干酵母，葡萄酒高活性干酵母与2%的葡萄糖水按1∶5的质量比混合均匀，在37 ℃的水浴锅中活化20 min，活化好的葡萄酒高活性干酵母加入到调配好的糖化液中，30 ℃保温发酵51 h，至酒精度不再上升，酒精发酵结束，陈酿48 h，得到酒醪。
醋酸发酵：取甘油管保藏的醋酸菌100 μL，涂布到醋酸菌活化培养基上，培养20 h后，取接种环挑取1个菌落，接入醋酸菌种子培养基中，三角瓶装液量为50 mL/250 mL，转速120 r/min、30 ℃培养17 h获得醋酸菌种子液。对酒醪进行过滤除去果皮和米渣，加蒸煮5 min后的葡萄汁和饮用水调整酒精度。按5%的接种量加入醋酸菌种子液，三角瓶装液量为100 mL/500 mL，120 r/min、30 ℃发酵72 h，至总酸不再升高，醋酸发酵结束。四层纱布过滤，蒸煮15 min，即得葡萄糯米香醋。
1.3.2 葡萄糯米香醋酒精发酵工艺优化
单因素试验：以酒精度和感官评分为指标，分别考察葡萄与糯米的质量比（3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3），初始糖度（15%、17%、19%、21%、23%、25%），葡萄酒高活性干酵母添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%），发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）对酒醪品质的影响。
正交试验：以酒精度和感官评分为评价指标，以初始糖度（A）、葡萄酒高活性干酵母添加量（B）和发酵温度（C）为影响因素，在单因素试验的基础上，用L9（34）正交试验设计试验，因素与水平见表1。
表1 酒精发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments of alcohol fermentation process optimization
1.3.3 葡萄糯米香醋醋酸发酵工艺优化
固定装液量为100 mL/500 mL，转速120 r/min，发酵时间为72 h，分别考察初始酒精度（5%vol、6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol）、醋酸菌接种量（3%、4%、5%、6%、7%、8%）、发酵温度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）对总酸和感官评分的影响。
1.3.4 分析检测
酒精度的测定：参考GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中规定的方法。总酸、不挥发酸、还原糖、氨基酸态氮、可溶性固形物的测定：参考GB 18187—2000《酿造食醋》中规定的方法。总酯的测定：参考GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》中规定的方法。
1.3.5 挥发性成分的测定
气相色谱条件：DB-WAX毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.25 μm），载气为高纯氦气（He）（99.999%），进样量5 μL，流量1 mL/min，不分流，进样口温度250 ℃；升温程序起始温度40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升温至120 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升温至200 ℃，保持1 min，再以25 ℃/min升温至250 ℃。
质谱条件：接口温度250 ℃，离子源温度230 ℃，电离方式电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，四级杆温度150 ℃，传输线温度280 ℃，扫描质量范围33～450 amu。
定性、定量：通过与美国国家标准技术研究所（national instituteof standards and technology，NIST）14.0标准谱库自动检索各组分质谱数据，按照标准谱图及保留指数对机检结果进行定性，按峰面积归一化法确定葡萄糯米香醋中各挥发性成分的相对含量。
1.3.6 感官评价
参考GB 15037—2006《葡萄酒》，以色泽（15分）、香气（35分）、滋味（35分）和澄清程度（15分）作为感官评价项目，制定的酒醪上清液的感官评价标准见表2。
表2 酒醪的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of wine mash
参考GB/T 18623—2011《地理标志产品镇江香醋》，以色泽（15分）、香气（35分）、滋味（35分）和澄清程度（15分）作为感官评价项目，制定的葡萄糯米香醋的感官评价标准见表3。
表3 葡萄糯米香醋的感官评价标准
Table 3 Sensory evaluation standards of grape-glutinous rice aromatic vinegar
2 结果与分析
2.1 葡萄糯米香醋酒精发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 葡萄与糯米质量比的确定
糯米糖化发酵后残留糊精和低聚糖较多，会使得酿造的醋口味浓甜、香气佳，被用来酿造镇江香醋[14]。葡萄含糖量高，其香气成分种类多、含量高[17-18]。以葡萄和糯米为原料采用液态发酵酿造果粮香醋，酒精发酵的质量决定了醋的品质，其质量比将会影响酒醪的质量。葡萄与糯米质量比对酒醪品质的影响见图1。
图1 葡萄与糯米质量比对酒醪品质的影响
Fig.1 Effect of mass ratio of grape and glutinous rice on wine mash
由图1可知，葡萄与糯米质量比在1∶3～3∶1的范围内增加，酒醪酒精度由9.3%vol逐渐升高到10.5%vol；随着葡萄与糯米质量比在1∶3～2∶1范围内的增加，酒醪的感官评分逐渐增加，当葡萄与糯米质量比达到2∶1时，其感官评分达到最大值，为76.8分，当葡萄与糯米质量比＞2∶1之后，其感官评分有所下降，这时酒醪刺激性较强、微苦，发酵性糖含量过低，残存的糊精过少。另外，葡萄用量大会造成成本的增加，因此，葡萄与糯米的质量比为2∶1时较适宜。
2.1.2 初始糖度的确定
初始糖度对酒醪品质的影响见图2。由图2可知，随着初始糖度在15%～25%范围内的增大，酒醪酒精度由7.8%vol逐渐增加至10.8%vol，而当初始糖度＞21%时，酒精度增速减缓，这是由于糖度过高，影响了酵母的增殖和代谢活动[19]。当初始糖度在15%～23%范围内的增加，酒醪感官评分逐渐增加，初始糖度为23%时，酒醪的感官评分最高，为79.7分，当初始糖度＞23%时，感官评分逐渐下降，其原因主要是由于残糖过多，导致酒醪偏甜。考虑酿醋成本，因此，初始糖度为21%较适宜。
图2 初始糖度对酒醪品质的影响
Fig.2 Effect of initial sugar content on wine mash
2.1.3 葡萄酒高活性干酵母添加量的确定
葡萄酒高活性干酵母添加量对酒醪品质的影响见图3。由图3可知，随着葡萄酒高活性干酵母添加量在0.05%～0.20%范围内的增加，酒醪酒精度和感官评分均逐渐增加，当葡萄酒高活性干酵母添加量为0.20%时，酒精度及感官评分均达到最大值，分别为10.5%vol和77.9分，此时，当葡萄酒高活性干酵母添加量＞0.20%之后，酒精度及感官评分均下降。究其原因可能是，葡萄酒高活性干酵母接种量过小，酵母提前达到衰亡期[21]，造成糖转化率下降，酒精度较低，同时残糖较高会造成酒醪偏甜，影响感官评分；当酵母接种量过大时，酒精发酵过快，造成发酵性糖过度消耗，降低其转化率，酒精度也会随之降低，过多的酵母自溶物也会影响酒醪的滋味和体态[22]，降低了感官评分。因此，葡萄酒高活性干酵母的最适添加量为0.20%较适宜。
图3 葡萄酒高活性干酵母添加量对酒醪品质的影响
Fig.3 Effects of wine active dry yeast addition on quality of wine mash
2.1.4 发酵温度的确定
发酵温度对对酒醪品质的影响见图4。由图4可知，当发酵温度在24～30 ℃范围内的增加，酒精度及感官评分均上升，当发酵温度为30 ℃时，均达到最大值，此时，酒精度为10.5%vol，感官评分为79.4分，当发酵温度＞30 ℃之后，酒精度及感官评分均下降。因此，发酵温度为30 ℃较适宜。
图4 发酵温度对酒醪品质的影响
Fig.4 Effect of fermentation temperature on wine mash
2.1.5 葡萄糯米香醋酒精发酵工艺正交试验优化结果
根据酒精发酵单因素试验结果，以酒精度和感官评分为评价指标，选取初始糖度（A）、葡萄酒高活性干酵母添加量（B）和发酵温度（C）3个因素进行正交试验设计，正交试验结果与分析见表4，方差分析见表5。
表4 酒精发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal experiments of alcohol fermentation process optimization
表5 正交试验结果方差分析
Table 5 Variance analysis of orthogonal experiments results
注：“**”表示因素对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示因素对结果影响显著（P＜0.05）。
续表
由表5可知，根据F值，影响酒醪酒精度的主次因素为：初始糖度＞葡萄酒高活性干酵母添加量＞发酵温度，其最佳条件为A3B3C2；影响其感官评分的主次因素为：初始糖度＞葡萄酒高活性干酵母添加量>发酵温度，其最佳条件为A3B3C1。由表5亦可知，初始糖度对酒醪酒精度有极显著影响（P＜0.01），葡萄酒高活性干酵母添加量对其有显著影响（P＜0.05），发酵温度影响不显著（P＞0.05）；初始糖度对感官评分有极显著影响（P＜0.01），而葡萄酒高活性干酵母添加量对其有显著影响（P＜0.05），发酵温度影响不显著（P＞0.05）。
对于多个考核指标采用综合平衡法确定优方案，初始糖度和葡萄酒高活性干酵母添加量对酒精度和感官评分的影响一致，选A3B3，发酵温度对感官评分影响不显著，因此从节约能源的角度选C1，最后得出最优方案为A3B3C1。最优方案未出现在试验组，因此将最优方案与试验组A3B3C2进行验证，结果表明，二者酒醪酒精度分别为10.6%vol和10.4%vol，感官评分分别为82.8分和83.5分，结合酒醪的香气和滋味，综合考量能源节约问题，选取最优方案效果更佳，即初始糖度23%、葡萄酒高活性干酵母添加量0.22%、发酵温度28 ℃。
2.2 葡萄糯米香醋醋酸发酵工艺优化
2.2.1 初始酒精度的确定
液态醋酸发酵启动需要一定的总酸含量，葡萄中含有多种有机酸，为其启动发酵提供了底酸，同时酒醪酒精度过高也会抑制醋酸菌增殖与代谢，产酸缓慢，甚至不产酸[23]。因此，考察初始酒精度对葡萄糯米香醋品质的影响，结果见图5。由图5可知，随着初始酒精度由5%vol增大至7%vol，感官评分逐渐增加，当初始酒精度为7%vol时，感官评分达到最大值，为82.4分，当初始酒精度＞7%vol，感官评分逐渐下降；随着初始酒精度在5%vol～8%vol范围内的增加，总酸含量逐渐增加，初始酒精度为8%vol时，总酸最高，为5.21 g/100 mL，当初始酒精度＞8%vol，而总酸含量快速下降。究其原因可能是，过高的酒精度抑制了醋酸菌的增殖和代谢，导致产酸缓慢，未转化的酒精和过低的总酸导致醋的滋味差，感官品质下降。因此，最适初始酒精度为7%vol。
图5 初始酒精度对葡萄糯米香醋品质的影响
Fig.5 Effect of initial alcohol content on quality of grape-glutinous rice aromatic vinegar
2.2.2 醋酸菌接种量的确定
醋酸菌接种量对葡萄糯米香醋品质的影响见图6。由图6可知，随着醋酸菌接种量在3%～5%范围内增加，总酸含量及感官评分均呈上升趋势，当在醋酸菌接种量为5%时，均达到最大值，总酸含量为4.69 g/100 mL，感官评分为83.2分，醋酸菌接种量＞5%，两者均下降。其原因可能是，接种量过大，导致醋酸菌竞争性抑制，过度消耗乙醇，进而导致总酸转化率降低，糖酸比例不协调，过量的醋酸菌自溶也会影响醋汁的滋味和浑浊度[24]。因此，最适醋酸菌接种量为5%。
图6 醋酸菌接种量对葡萄糯米香醋品质的影响
Fig.6 Effect of Acetobacter aceti inoculum on quality of grape-glutinous rice aromatic vinegar
2.2.3 发酵温度的确定
过低的温度会导致醋酸发酵无法启动，使得发酵液易染杂菌而失败[25]。因此，考察发酵温度对葡萄糯米香醋醋品质的影响，结果见图7。由图7可知，随着温度在24～30 ℃范围内的升高，总酸含量及感官评分均增加，当发酵温度为30 ℃时，总酸含量及感官评分达到最高值，分别为4.71 g/100 mL、84.3分，当发酵温度高于30 ℃，总酸含量及感官评分均下降。因此，最适发酵温度为30 ℃。
图7 发酵温度对葡萄糯米香醋品质的影响
Fig.7 Effect of fermentation temperature on quality of grape-glutinous rice aromatic vinegar
因此，确定最佳的初始酒精度、醋酸菌接种量、发酵温度分别为7%vol、5%、30 ℃。在上述的工艺条件下制备葡萄糯米香醋进行后续试验。
2.3 葡萄糯米香醋品质评价
2.3.1 葡萄糯米香醋挥发性成分分析
按照优化后的工艺制备了葡萄糯米香醋，对其挥发性成分进行测定，结果见表6。
由表6可知，葡萄糯米香醋中共检测出31种挥发性成分，其中醇类7种、醛类3种、酸类7种、酯类13种、苯类1种，分别占总挥发性成分的27.69%、9.18%、24.42%、34.48%、0.23%。醇类含量较多的物质为苯乙醇（12.67%）、3-甲基丁醇（8.84%）、2,3-丁二醇（5.93%），醛类含量较多的为糠醛（8.30%），酸类含量较多的为乙酸（17.59%）、苯甲酸（3.82%）、3-甲基丁酸（2.41%），酯类含量较多的为乙酸乙酯（10.64%）、丁二酸乙酯（7.25%）、乙酸苯乙酯（5.86%）、丁二酸二乙酯（4.19%）、己酸苯乙酯（2.27%）。
表6 葡萄糯米香醋挥发性成分的GC-MS分析结果
Table 6 Results of volatile components of grape-glutinous rice aromatic vinegar analyzed by GC-MS
以葡萄和糯米为原料，经过葡萄酒酵母代谢产生了较多的苯乙醇、乙醇[26]，再经过醋酸发酵代谢的乙酸，混合葡萄原料中醇类、酸类和酯类等丰富的混合果香气成分，醋酸发酵前添加蒸煮的葡萄汁和成品醋的蒸煮形成了焦甜香的糠醛[13，27]，进而形成了葡萄糯米香醋以乙酸、糠醛、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸乙酯、乙酸苯乙酯等酸类、醛类、醇类和酯类物质为主体的浓郁似葡萄、苹果、菠萝、蜂蜜等的混合果香。
2.3.2 葡萄糯米香醋理化指标和感官评价
葡萄糯米香醋的理化指标见表7。由表7可知，总酸、不挥发酸和还原糖的含量分别为4.70 g/100 mL、0.46 g/100 mL和3.24 g/100 mL。由于葡萄糯米香醋为液态发酵，发酵微生物单一，其代谢产生不挥发酸少，但由于在醋酸发酵前选用葡萄汁调配酒精度，增加了醋的不挥发酸和还原糖的含量，还有糯米发酵后残留的糊精和低聚糖，提高了糖酸比和不挥发酸含量，降低了乙酸的刺激性，使酸味更柔和。相比于镇江香醋和山西老陈醋，葡萄糯米香醋的总酯含量更高[28-29]，氨基酸态氮、可溶性固形物、总酯含量分别为0.28 g/L、9.64 g/100 mL、3.18 g/100 mL，达到了以葡萄与糯米为原料酿造具有浓郁酯香香醋的目标。制备葡萄糯米香醋，红褐色、澄清透亮，口感醇厚、酸甜柔和，具有浓郁的果香和醋香气。
表7 葡萄糯米香醋的理化指标
Table 7 Physicochemical indexes of grape-glutinous rice aromatic vinegar
3 结论
本研究以葡萄和糯米为主要原料，以酒精度和感官评分为评价指标，采用单因素试验和正交试验优化得到葡萄糯米香醋酒精发酵工艺条件为：葡萄与糯米质量比2∶1、初始糖度23%、葡萄酒高活性干酵母添加量0.22%、发酵温度28 ℃；醋酸发酵工艺条件为：初始酒精度7%vol、醋酸菌接种量5%、发酵温度30 ℃。在此优化条件下制备的葡萄糯米香醋共检出31种挥发性成分，其中醇类7种、醛类3种、酸类7种、酯类13种、苯类1种，形成了以乙酸、糠醛、苯乙醇、乙酸乙酯、丁二酸乙酯、乙酸苯乙酯为主体的浓郁混合果香气。产品总酸含量达4.70 g/100 mL、总酯含量为3.18 g/100 mL，葡萄糯米香醋呈红褐色、澄清透亮，口感醇厚、酸甜柔和。
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