黄秋葵（Abelmoschus esculentus）又名羊角豆、毛茄、咖啡黄葵，被称为“绿色人参”[1]、“美人指”[2]，据研究调查表明，每100 g秋葵果荚中含蛋白质2.10 g，碳水化合物8.20 g，脂肪0.20 g，粗纤维1.70 g，钙84.00 mg，铁1.20 mg，维生素B2 0.08 mg，维生素B1 0.04 mg，维生素C 47.00 mg[3]；秋葵果荚和秋葵籽中含有丰富的多酚类化合物，主要由黄酮醇衍生物和低聚儿茶酚组成，包括芦丁、儿茶素、表儿茶素等，具有抗氧化、抗发炎性和抗菌等生理活性[4]；黄秋葵果荚中特有的黏液状物质主要由水溶性果胶、半乳聚糖和阿拉伯树胶等多糖和少量糖蛋白组成[5]，不仅使其肉质柔嫩、口感爽滑、风味特殊，还可以刺激中枢神经，加速血液循环、促进新陈代谢，并能与胆固醇和胆汁酸结合，促进有害物质转入肝脏代谢[3]。因此，黄秋葵作为一种食疗蔬菜，长期食用具有健胃、保肝、强肾、抗氧化、降血脂、降胆固醇等作用，其特殊的营养价值和保健功效使其具有很好的市场开发前景。黄秋葵的收获季节集中在7、8月份，处理不及时易褐变、纤维老化、肉质粗老、失去食用价值，因此，为提高黄秋葵的利用率，以其为原料制作成泡菜具有重要的意义。
泡菜是我国的传统美食，作为流行较广的传统民间食品，其历史悠久、生产成本低、制作工艺简单。但是，我国传统家庭自制泡菜生产大多停留在自然发酵工艺上，这种工艺以复杂的微生态环境为基础，不仅生产周期长，而且产品的品质和安全性也得不到保证。受传统工艺的限制，泡菜中的亚硝酸盐含量居高不下，这一直是泡菜困扰大众的食用安全问题，也是全民关注的焦点。关于泡菜中亚硝酸盐含量的控制方法，目前有许多相关研究[6-8]。由于亚硝酸盐主要是发酵初期杂菌生长繁殖产生的硝酸盐还原酶所引起，因此，如何控制杂菌生长是关键。其中，筛选合适菌种、改变发酵方法是当前研究的重点和热点。国内外对乳酸菌降解亚硝酸盐做了较多的研究[9-15]，有研究表明，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）、肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）等[16-23]都可以改变不同蔬菜泡菜亚硝峰的出现时间以及减少亚硝酸盐的含量。
本研究以黄秋葵为主要原料，采用人工接种结合自然发酵工艺，利用植物乳杆菌发酵制作黄秋葵泡菜，研究亚硝酸盐含量的变化，并研究发酵条件对亚硝酸盐含量的影响，以期通过发酵工艺参数的控制减少亚硝酸盐的含量来保证产品的安全，以期为工业化、标准化生产营养、安全并具有保健作用的黄秋葵泡菜提供一定的理论基础，也为广大农户提供一种简单且成本低的黄秋葵加工贮藏方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
黄秋葵、食盐、白糖、花椒、辣椒、生姜、蒜等：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CICC 21805：上海保藏生物技术中心。
1.1.2 主要试剂
亚硝酸钠、四硼酸钠、乙酸锌、亚铁氰化钾、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、冰醋酸等（均为分析纯）：西陇化工股份有限公司；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
MRS液体培养基[19]：蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，酵母粉4.0 g，葡萄糖20.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，柠檬酸二铵2.0 g，乙酸钠5.0 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，吐温80 1.0 g，蒸馏水1 000 mL，调节pH 6.2～6.4，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
UV-5800紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；SHP-250型生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；HVE-50型压力蒸汽灭菌器：厦门柏嘉生物科技有限公司；SW-CJ-1F型超净工作台：苏州净化设备有限公司；FA1004B电子天平：上海越平科学仪器有限公司；JYL-C19V料理机：九阳股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜的制作工艺流程及操作要点[24-26]
操作要点：
清洗：选择质地脆嫩、无病虫害的黄秋葵，清洗干净。
整形、适度晾晒：除去果蒂等不宜食用的部分，适度晾晒去掉原料表面的明水后即可入坛泡制。
植物乳杆菌的扩大培养：于超净台中将冻干菌粉甩至安瓿瓶底部，尖头一侧用酒精棉消毒后敲开，取0.2～0.3 mL无菌水至菌种管中，使菌粉溶解、混匀，用无菌吸头吸出溶解液，接入5 mL MRS液体培养基中，37 ℃静置培养2 d；将活化后的植物乳杆菌接入100 mL MRS液体培养基中，于37 ℃条件下扩大培养2～3 d，使得发酵液中的活菌数达到108～109 CFU/mL。
入坛：将准备就绪的黄秋葵装入坛内，装至半坛时放入香料包，再装黄秋葵至距坛口6 cm为止。在水中加入6%食盐、2%糖和2%料酒，配制盐卤水，为了保脆，加入0.8%的乳酸钙，同时按2%的接种量加入已活化的植物乳杆菌发酵液，混合均匀。将配制的盐卤水1 000 mL注入泡菜坛，淹没黄秋葵。
水封：在泡菜坛水槽中加注15%食盐水，盖上坛口小碗。
发酵：将泡菜坛置于常温（28 ℃）下发酵7 d，得到成品。
1.3.2 植物乳杆菌对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响
以自然发酵的黄秋葵泡菜为对照组（CK组），以接种植物乳杆菌发酵的黄秋葵泡菜为试验组（Lp组），发酵过程中，每24 h取样测定亚硝酸盐含量。
1.3.3 植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜工艺参数的优化
为了减少亚硝酸盐的含量，首先采用单因素试验，分别研究接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d）、盐卤水食盐浓度（0、2%、4%、6%、8%、10%、12%）对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响。然后在单因素试验的基础上，以亚硝酸盐含量（Y）为响应值，接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）及食盐水浓度（D）为自变量，采用响应面试验优化黄秋葵泡菜的发酵工艺参数，以期通过控制发酵条件减少黄秋葵泡菜亚硝酸盐的产生，使之含量在食用安全范围之内，同时缩短发酵周期。
1.3.4 亚硝酸盐含量的测定
参照GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的紫外分光光度法测定亚硝酸盐含量。
1.3.5 数据处理
采用Excel 2007、SPSS 20.0软件处理试验数据并作图，试验数据均为3次重复试验结果的平均值，结果以“平均值±标准差”表示；响应面试验采用Design-Expert 10.0.7软件分析处理并作图。
2 结果与分析
2.1 植物乳杆菌对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响
不同发酵组黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量的变化见图1。由图1可知，CK组在发酵后的第4天，黄秋葵泡菜中的亚硝酸盐含量达到最高，为17.58 mg/kg，发酵后期缓慢降低；Lp组发酵第2天时，黄秋葵泡菜中的亚硝酸盐含量达到最高，为9.78 mg/kg，随后迅速下降。与CK组相比，亚硝峰出现时间（4 d）较早，峰值较低，发酵周期较短，说明采用植物乳杆菌发酵可以使黄秋葵泡菜中的亚硝峰出现时间提前，缩短发酵期，同时降低亚硝酸盐的含量，分析原因可能是接种植物乳杆菌发酵能使乳酸菌从发酵开始就成为优势菌，既能抑制其他杂菌的生长，同时生成的乳酸又降低了pH值，即使有亚硝酸盐产生，在酸性条件下也能加速其还原和降解[26-27]。
图1 黄秋葵泡菜发酵过程中亚硝酸盐含量的变化
Fig.1 Changes of nitrite contents during pickled okra of fermentation groups process
2.2 植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜工艺优化单因素试验结果
2.2.1 接种量对亚硝酸盐含量的影响
植物乳杆菌接种量对黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量的影响见图2。由图2可知，随着植物乳杆菌接种量的升高，黄秋葵泡菜中的亚硝酸盐含量呈先下降后趋于平缓的趋势，分析原因可能是接种量过低，植物乳杆菌降解亚硝酸盐的能力弱，导致产品亚硝酸盐残留量较高；当接种量＞3%之后，植物乳杆菌降解亚硝酸盐的能力达到一定的极限，亚硝酸盐含量不再下降。此外还有研究表明[24]，接种量还会影响黄秋葵泡菜的风味，接种量过小，产品酸味不足，滋味和香气较差；接种量过大，产品酸味过重，风味不协调。因此，接种量选择2%～4%较好。
图2 接种量对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响
Fig.2 Effect of inoculum on nitrite contents in pickled okra
2.2.2 发酵温度对亚硝酸盐含量的影响
发酵温度对黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量的影响见图3。由图3可知，随着发酵温度的升高，黄秋葵泡菜中的亚硝酸盐含量先下降后升高，分析原因可能是当发酵温度为20 ℃时，植物乳杆菌生长慢，导致细胞数量少，产酸少，因此抑制杂菌的作用小，降解亚硝酸盐的能力弱，最终泡菜的亚硝酸盐残留较高；当发酵温度在20～30 ℃范围内，乳酸菌生长繁殖就能达到一定的速度，亚硝酸盐含量明显降低；当发酵温度在30～35 ℃范围内，乳酸菌生长繁殖达到一定极限，亚硝酸盐含量降低不明显；随温度的继续升高，当发酵温度高于35 ℃之后，亚硝酸盐含量又有所回升，可见高温抑制了植物乳杆菌的生长。因此，发酵温度选择25～35 ℃为宜。
图3 发酵温度对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on nitrite contents in pickled okra
2.2.3 发酵时间对亚硝酸盐含量的影响
发酵时间对黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量的影响见图4。由图4可知，随着发酵时间的延长，黄秋葵泡菜中的亚硝酸盐含量先上升后下降。发酵时间为2 d时，黄秋葵泡菜中亚硝酸盐出现峰值，达到8.78 mg/kg；随着发酵时间的延长，亚硝酸盐含量不断下降，当发酵时间＞4 d后，下降幅度变得缓慢，考虑到生产周期的成本，发酵时间选择4～6 d为宜。
图4 发酵时间对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响
Fig.4 Effects of fermentation time on nitrite contents in pickled okra
2.2.4 食盐水浓度对亚硝酸盐含量的影响
食盐水浓度对黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量的影响见图5。由图5可知，随着食盐水浓度的增加，黄秋葵泡菜中的亚硝酸盐含量呈先下降后上升的趋势。当食盐水浓度为4%～8%时，亚硝酸盐含量较低。分析原因可能是泡菜不加盐，发酵早期会有大量的细菌杂菌快速生长繁殖，比乳酸菌生长更快，大量杂菌繁殖分泌较多的硝酸盐还原酶，将硝酸盐还原成亚硝酸盐，从而导致泡菜亚硝酸盐含量高。杂菌一般不耐盐，添加一定浓度的食盐即可抑制蔬菜表面附着的杂菌；但是当食盐浓度过高时，其产生的高渗透压也会抑制乳酸菌的生长。食盐不仅具有调节微生物生长的作用，还有调味的作用，食盐浓度过高时，产品咸味重。因此，选择适宜的食盐水浓度在4%～8%。
图5 食盐水浓度对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响
Fig.5 Effect of salt content in water on nitrite contents in pickled okra
2.3 植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜工艺优化响应面试验结果
2.3.1 响应面试验设计及结果
在单因素试验结果的基础上，以亚硝酸盐含量（Y）为响应值，接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）、食盐水浓度（D）为自变量，采用Design-Expert 10.0.7软件设计响应面试验，试验因素与水平见表1，试验设计及结果见表2，方差分析结果见表3。
表1 植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜工艺优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of pickled okra by Lactobacillus plantarum
表2 植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜工艺优化响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of pickled okra by Lactobacillus plantarum
续表
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
采用Design-Expert 10.0.7软件对表2的数据进行二次多项回归拟合，得到响应值与各因素之间的回归方程：
由表3可知，回归模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），说明该模型方程与实际情况拟合程度良好，4个因素对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响的主次顺序依次为C（发酵时间）＞A（接种量）＞D（食盐水浓度）＞B（发酵温度）；该模型方程的决定系数R2=0.966 2，校正决定系数R2Adj=0.932 5，说明该模型方程中4个因素对黄秋葵泡菜亚硝酸盐含量的影响是可信的，用该方程进行分析和预测，预测值和实际测定值之间相关性较高。由表3亦可知，一次项A、B、C、D、交互项AD及二次项A2、B2、C2对结果影响极显著（P＜0.01），交互项AC、BC、CD对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。
2.3.2 响应面分析
一般来说，响应面曲面越陡、等高线形状越接近椭圆形，则因素之间的交互作用越显著[28]。各因素间的交互作用对黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量影响的响应曲面及等高线见图6。由图6可知，AC、AD、BC和CD交互作用的曲面较陡，等高线较密集且呈椭圆形或马鞍形，说明接种量与发酵时间、接种量与食盐水浓度、发酵温度与发酵时间、发酵时间与食盐水浓度的交互作用对亚硝酸盐含量的影响更显著，这与方差分析的结果基本一致。
图6 各因素间交互作用对黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量影响的响应面及等高线
Fig.6 Response surface plots and contour lines of interaction between each factor on nitrite contents in pickled okra
根据回归模型方程得到植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜最佳发酵工艺为：植物乳杆菌接种量3.32%，发酵温度30.05 ℃，发酵时间5.41 d，食盐水浓度4.00%，此时亚硝酸盐含量的理论值最低，为3.06 mg/kg。为便于实际操作，将最佳发酵工艺条件适当调整为：接种量3.5%，发酵温度30 ℃，发酵时间5.5 d，食盐水浓度4.0%。在此最优发酵工艺条件下发酵制作的黄秋葵泡菜中亚硝酸盐含量实际值为（2.98±0.02）mg/kg，低于GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》腌渍蔬菜亚硝酸盐的限量标准（≤20 mg/kg），且与理论值3.06 mg/kg接近，说明模型方程拟合程度良好，采用响应面法优化得到的发酵工艺条件对减少和控制黄秋葵泡菜亚硝酸盐的产生基本准确可靠。
3 结论
本研究以新鲜黄秋葵为主要原料，采用植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜，不仅可以使亚硝峰提前，缩短发酵期，还可以降低亚硝酸盐的含量。为减少和控制亚硝酸盐产生，采用单因素及响应面试验优化确定植物乳杆菌发酵黄秋葵泡菜的最佳工艺条件为：植物乳杆菌接种量3.5%，发酵温度30 ℃，发酵时间5.5 d，食盐水浓度4.0%。采用最优工艺制备的黄秋葵泡菜的亚硝酸盐含量为2.98 mg/kg，低于国家酱腌菜亚硝酸盐的限量标准（≤20 mg/kg），比优化前降低1.21 mg/kg。本试验提供了一种营养、安全并具有一定保健作用的大众餐桌食品，也给广大农户提供了一种操作简单、成本低的黄秋葵加工贮藏方法。
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