桑黄（Phellinus igniarius）作为一种珍贵的药用真菌，具有抗癌、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗肺炎、抗氧化和抑菌消炎等医用价值[1-5]。桑黄在药理作用及化学成分等方面研究的非常多，但在桑黄营养保健价值方面还有很大的开发空间。作为药食两用的中药，几乎无毒副作用且富含多种次级代谢产物和抗氧化性物质的桑黄，是保健食品加工的良好原料，有着巨大的市场需求。
与普通牛奶相比，酸奶风味独特、口感好，能够减弱人体乳糖不耐受症，改善胃肠功能[6-12]。随着人们对健康饮品的关注，保健型酸奶产品逐渐受到大众欢迎。
我国目前报道的保健酸奶品种有草莓酸奶、灵芝酸奶、红枣酸奶等[13]，鲜见桑黄酸奶的相关报道。本试验将桑黄发酵液和酸奶制作相结合，通过研究为制作桑黄风味酸奶提供科学依据，以期开发出新的酸奶产品，充分挖掘桑黄的食用价值，丰富酸奶产品类型，对桑黄深加工产品的开发提供帮助。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
高蛋白脱脂高钙奶粉：杜尔伯特伊利乳业有限责任公司；白砂糖（食品级）：北京古松经贸有限公司；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、乳双歧杆菌（Bifidobacterium）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：西安绿腾生物科技有限公司；桑黄发酵液[14-16]：菏泽学院E208实验室提供。
葡萄糖、硫酸镁、硫酸锰、无水乙醇（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；牛肉膏（生化试剂），蛋白胨、琼脂粉（均为分析纯）：北京奥博星生物科技有限责任公司；磷酸氢二钾（分析纯）：西陇化工股份有限公司；柠檬酸三铵、氢氧化钠、酚酞（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；石油醚（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；乙醚（分析纯）：莱阳经济开发区精细化工厂；吐温-80（分析纯）：天津市光复精细化工研究所；伊红美兰琼脂（生化试剂）：北京双旋微生物培养基制品厂。
1.2 仪器与设备
mLS-3780高压蒸汽灭菌器：日本三洋电机株式会社；GL224l-1SCN电子天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；YJ-VS-2双人垂直超净工作台：无锡一净净化设备有限公司；HH-W-420数显恒温水箱、HT113ATC糖度计：金坛市江南仪器厂；MJ-250-1恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；HR/T20M台式高速冰冻离心机：湖南赫西仪器装备有限公司；C*21FS1显微镜：日本东京奥林巴斯公司；ZQZY-C8紫外分光光度计：上海知楚仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混合发酵菌剂的制备
（1）乳酸菌的活化：首先梯度稀释保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和乳双歧杆菌的菌种，在37 ℃条件下培养，进行3次接种纯化，并观察3种乳酸菌的菌落及细胞形态[17]。
（2）发酵菌剂制备：将纯化的菌种分别接入12mL/100mL的灭菌乳液中，于42 ℃条件下扩大培养3次至奶液凝固，在4 ℃冰箱中保存，3种乳酸菌按照1∶1∶1的比例混合（8.4×108 CFU/mL）使用[18]。
1.3.2 桑黄风味酸奶制作工艺流程
桑黄发酵液、白砂糖、脱脂奶粉混合均匀→加水→搅拌溶解→灭菌（100 ℃、20 min）→冷却（42 ℃）→接种发酵菌剂→发酵→冷却→冷藏（4 ℃、18 h）→成品
1.3.3 桑黄风味酸奶发酵条件优化单因素试验[19]
（1）桑黄发酵液添加量的影响：固定白砂糖添加量6 g/100 mL、奶粉添加量16 g/100 mL、发酵菌剂接种量5 mL/100 mL，在42 ℃条件下发酵4 h，考察桑黄发酵液添加量（0、5 mL/100 mL、10 mL/100 mL、15 mL/100 mL、20 mL/100 mL、25 mL/100 mL、30 mL/100 mL）对桑黄风味酸奶感官评价和酸度的影响。
（2）奶粉的添加量的影响：固定白砂糖添加量6g/100mL、桑黄发酵液添加量15 mL/100 mL、发酵菌剂接种量5 mL/100 mL，在42 ℃条件下发酵4 h，考察奶粉添加量（14 g/100 mL、15 g/100 mL、16 g/100 mL、17 g/100 mL、18 g/100 mL）对桑黄风味酸奶感官评价和酸度的影响。
（3）白砂糖添加量的影响：固定奶粉添加量16g/100mL、桑黄发酵液添加量15 mL/100 mL、发酵菌剂接种量5 mL/100 mL，在42 ℃条件下发酵4 h，考察白砂糖添加量（2g/100mL、4g/100mL、6g/100mL、8g/100mL、10g/100mL）对桑黄风味酸奶感观评价和酸度的影响。
（4）发酵菌剂接种量的影响：固定白砂糖添加量6 g/100 mL、奶粉添加剂量16 g/100 mL、桑黄发酵液添加量15 mL/100 mL，在42 ℃条件下发酵4 h，考察发酵菌剂接种量（1 mL/100 mL、3 mL/100 mL、5 mL/100 mL、7 mL/100 mL、9 mL/100 mL）对桑黄风味酸奶感官评价和酸度的影响。
（5）发酵时间的影响：固定奶粉添加量16 g/100 mL、白砂糖添加量6 g/100 mL、发酵菌剂接种量5 mL/100 mL、桑黄发酵液添加量15 mL/100 mL，在42 ℃条件下分别发酵4 h、5 h、6 h、7 h、8 h，考察发酵时间对桑黄风味酸奶感官评价和酸度的影响。
（6）发酵温度的影响：固定奶粉添加量16 g/100 mL、白砂糖添加量6 g/100 mL、发酵菌剂接种量5 mL/100 mL、桑黄发酵液添加量15 mL/100 mL，分别在38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃条件下发酵4 h，考察发酵温度对桑黄风味酸奶感官评价和酸度的影响。
1.3.4 桑黄风味酸奶发酵条件优化正交试验
根据单因素试验结果，设计6因素3水平正交试验，以感官评分为考察指标优化桑黄风味酸奶的发酵条件，正交试验的因素与水平见表1。
表1 桑黄风味酸奶发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization of Phellinus igniarius flavor yogurt
1.3.5 测定方法
感官评价：选取10位具有感官评价经验的同学组成评价小组，根据感官评价标准[19-21]分别从组织形态、口感、色泽风味3个方面对桑黄风味酸奶进行评分，满分为100分，取10人的平均分。桑黄风味酸奶感官评价标准见表2。
表2 桑黄风味酸奶感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation criteria of Phellinus igniarius flavor yogurt
酸度：参照文献[20]的NaOH标准溶液滴定法测定；糖度：使用HT113ATC糖度计测定[21]；持水力：参照文献[22]的离心称质量法测定；总固形物：参照文献[23]的质量法测定；蛋白质：参照文献[24]的考马斯亮蓝法测定；脂肪：参照文献[25]的碱水解法测定。
乳酸菌数：参照文献[26]的血球计数板计数法测定；大肠杆菌：参照文献[27]的伊红美兰平板计数法测定；金黄色葡萄球菌：参照文献[28]的BP平板计数法测定。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率：参照文献[29]的方法测定。
2 结果与分析
2.1 桑黄风味酸奶发酵条件优化单因素试验
2.1.1 桑黄发酵液添加量对桑黄风味酸奶品质的影响
由图1可知，随着桑黄发酵液添加量的增加，桑黄风味酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度呈上升的趋势。桑黄发酵液添加量＜20 mL/100 mL时桑黄风味不明显；桑黄发酵液添加量为20 mL/100 mL时，酸奶既有独特的桑黄香味又具有浓郁的酸奶风味，感官评分最高为83.2分，酸度为86°T；此后感官评分下降，桑黄发酵液添加量＞30 mL/100mL时酸奶较粗糙，过于黏稠，且桑黄味过重，影响口感。因此，选择桑黄发酵液添加量为20 mL/100 mL比较适宜。
图1 桑黄发酵液添加量对桑黄风味酸奶品质的影响
Fig. 1 Effects of Phellinus igniarius fermentation broth on Phellinus igniarius flavor yogurt
2.1.2 奶粉添加量对桑黄风味酸奶的影响
由图2可知，随奶粉添加量的增加，桑黄风味酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度则呈上升趋势。奶粉添加量＜17 g/100 mL时凝乳不均匀，有气泡，有乳清析出，口感较差；奶粉添加量为17 g/100 mL时，酸奶风味浓郁，质地均匀，口感好，感官评分最高为86.5分，酸度为85°T；奶粉添加量＞17 g/100 mL时，酸奶口感粗糙，色泽不均匀，无桑黄味道。因此，选择奶粉添加量为17 g/100 mL比较适宜。
图2 奶粉添加量对桑黄风味酸奶品质的影响
Fig. 2 Effects of milk powder addition on Phellinus igniarius flavor yogurt
2.1.3 白砂糖添加量对桑黄风味酸奶的影响
由图3可知，随白砂糖添加量的增加，桑黄风味酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度则呈缓慢上升趋势。白砂糖添加量＜6 g/100 mL时，酸奶口感过酸，桑黄味道过重，有少量乳清析出；白砂糖添加量为6 g/100 mL时，酸奶风味口感适中，色泽鲜亮，有良好的桑黄及酸奶的香气，无乳清析出，感官评分最高为82.6分，酸度为84°T；白砂糖添加量＞6 g/100 mL时，酸奶口感过甜且粗糙，无桑黄味道，凝乳差，有大量乳清析出。因此，选择白砂糖添加量为6 g/100 mL比较适宜。
图3 白砂糖添加量对桑黄风味酸奶品质的影响
Fig. 3 Effects of sugar content on Phellinus igniarius flavor yogurt
2.1.4 发酵菌剂接种量对桑黄风味酸奶的影响
由图4可知，随发酵菌剂添加量增加，桑黄风味酸奶的感官评分呈先上升后下降的趋势，酸度随着发酵菌剂接种量的增加而上升。发酵菌剂添加量＜5 mL/100 mL时，酸奶凝乳差，不能成形，有大量乳清析出；发酵菌剂接种量在5 mL/100mL左右比较适宜，此时酸奶凝固较好，酸甜适宜，口感最好，感官评分最高为83分，酸度为84 °T；发酵菌剂接种量＞5 mL/100 mL时，酸奶口感过酸，无桑黄味道。因此，选择发酵菌剂接种量为5 mL/100 mL比较适宜。
图4 发酵菌剂接种量对桑黄风味酸奶品质的影响
Fig. 4 Effects of fermentation agent inoculum on Phellinus igniarius flavor yogurt
2.1.5 发酵时间对桑黄风味酸奶的影响
由图5可知，随发酵时间不断延长，桑黄风味酸奶的感官评分呈先上升后下降趋势，而酸度则随发酵时间增加而上升。发酵时间＜5 h时酸奶凝固较差，不成形，无色泽，口感较甜；发酵时间在5 h左右比较适宜，此条件下，酸奶凝固好，口感细腻，酸甜适中，有桑黄及酸奶的香气，感官评分最高为86.4分，酸度为89°T；此后感官评分下降，发酵时间＞5 h时酸奶较粗糙，过于黏稠，有少量乳清析出，表面无光泽，酸奶过酸，影响口感。因此，选择发酵时间为5 h比较适宜。
图5 发酵时间对桑黄风味酸奶品质的影响
Fig. 5 Effects of fermentation time on Phellinus igniarius flavor yogurt
2.1.6 发酵温度对桑黄风味酸奶的影响
由图6可知，随发酵温度升高，桑黄风味酸奶的感官评分呈先上升后下降趋势，而酸度则不断上升。发酵温度＜42 ℃时酸奶凝固较差，不成形，有大量乳清析出，口感较甜；发酵温度在42 ℃左右比较适宜，此条件下，酸奶酸度、黏稠度适宜，口感好，有桑黄及酸奶的香气，感官评分最高为82.4分，酸度为85°T；发酵温度＞42 ℃时酸奶较粗糙，表面无光泽，有少量乳清析出，酸奶过酸，口感差。因此，选择发酵温度为42 ℃比较适宜。
图6 发酵温度对桑黄风味酸奶品质的影响
Fig. 6 Effects of fermentation temperature on Phellinus igniarius flavor yogurt
2.2 桑黄风味酸奶发酵条件优化正交试验
由表3可知，影响桑黄风味酸奶品质的因素及其影响程度依次为发酵菌剂接种量＞发酵温度＞白砂糖添加量＞发酵时间＞桑黄发酵液添加量＞奶粉添加量。桑黄风味酸奶的最佳发酵条件为A1B2C2D2E2F3，即桑黄发酵液添加量15 mL/100 mL、白砂糖添加量7 g/100 mL、奶粉添加量17 g/100 mL、发酵菌剂接种量5 mL/100 mL，在42 ℃条件下培养5 h。在此条件下，桑黄风味酸奶的感官评分为92.2分。
表3 桑黄风味酸奶发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of Phellinus igniarius flavor yogurt
续表
2.3 桑黄风味酸奶产品指标
在最佳条件下发酵得到的桑黄风味酸奶色泽鲜亮，凝固均匀无杂质，没有乳清析出；口感细腻爽口，兼有桑黄特有的甘味和牛乳特有的奶香味，酸甜适中，没有异味；感官评分为92.2分，酸度为85°T，糖度为8.2%，持水力为79.54%，总固形物含量为20.65 g/100 g，蛋白质含量为1.86 g/100 g，脂肪含量为0.6 g/100 g。
桑黄风味酸奶乳酸菌数为2.2×109 CFU/mL，未检出大肠菌群、金黄色葡萄球菌；对DPPH自由基清除率为46%。
3 结论
本试验将桑黄发酵液加入奶粉中共同发酵，制成具有桑黄口感的桑黄风味酸奶。通过单因素及正交试验得到桑黄风味酸奶的最佳发酵工艺条件为奶粉添加量17 g/100 mL、桑黄发酵液添加量15 mL/100 mL、白砂糖添加量7g/100 mL、混合发酵菌剂接种量5 mL/100 mL，于42 ℃条件下发酵5 h，得到的桑黄风味酸奶色泽鲜亮，凝固均匀无杂质，没有乳清析出；口感细腻爽口，兼有桑黄特有的甘味和牛乳特有的奶香味，酸甜适中，没有异味。感官评分为92.2分，酸度为85°T。
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