我国白酒是世界蒸馏酒的典型代表，其主要成分为乙醇（体积分数38%～65%）和水，呈香呈味物质的含量约占2%左右，这些微量成分种类和含量的差异以及不同物质之间的相互作用决定了不同香型白酒的典型风格[1-2]。不同香型白酒的主体风味物质各异，基于化合物含量和其香气强度分析，浓香型白酒的关键呈香物质为己酸乙酯，它和乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯及其相应的有机酸（即己酸、乳酸、乙酸和丁酸）共同形成了浓香型白酒的典型风格，业界称为“四大酸四大酯”，优质浓香型白酒取决于四大酸四大酯和其他香气成分的含量与比例和谐平衡[3-5]。酯类、醇类、酸类、醛类、酮类等挥发性物质是泸型酒酒醅风味的主要来源[6-7]，它们通过蒸馏进入原酒中，形成了泸型酒的独特风格[8-9]。
浓香型白酒的风味形成是多菌种协同发酵的结果，泥窖池生香发酵是其典型的工艺特征，前期研究表明，以乳酸杆菌属（Lactobacillus）为优势菌的酒醅菌群和以梭菌纲（Clostridia）为优势菌的窖泥菌群通过“分工合作，协同发酵”形成了浓香型白酒的主体风味物质[10-13]。纷繁复杂的微生物将以高粱为主要原料的酒醅中的淀粉等大分子逐步水解，在发酵过程中形成大量的富含营养底物和风味物质的水解液，称作黄水[14]，其在重力的作用下逐渐聚集在窖池中下部，造成不同层酒醅风味物质积累的空间异质性。目前，关于泸型酒酒醅的研究集中在酒醅中微生物群落方面[15-16]。而四大酸和四大酯是酒醅挥发性风味物质研究的焦点[17]；在探究酒醅整体或不同层次酒醅挥发性风味物质的研究中，往往通过测定发酵结束时的最终含量来研究酒醅、窖泥与基酒的关系，从而指导生产[18-19]。但对整个发酵过程中不同层级酒醅挥发性风味物质变化的研究相对较少，通过对发酵过程中不同层次酒醅中挥发性风味物质相对含量进行横向和纵向对比，能更全面地探究发酵过程中不同层次酒醅的挥发性风味物质积累的特点和规律。
本研究采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase micro-extraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）联用技术[20]，对泸型酒上、中、下层酒醅发酵过程中的主要挥发性化合物的变化规律进行分析，对比不同层酒醅中主要挥发性物质的变化差异，并采用主成分分析（principal component analysis，PCA）解析不同发酵时期酒醅中的酯类特征风味物质，通过研究浓香型白酒酿造过程中不同位置酒醅挥发性物质的特点，以期为分层馏酒工艺提供基础数据参考，为后续探究浓香型白酒酿造机理奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料
酒醅样品：自酒醅入泥窖后开始取样，将酒醅从窖顶至窖底平均分为上、中、下3层，每层取3个平行样品，放入无菌自封袋后尽快转入-80 ℃冰箱保存。在泸型酒整个发酵过程中每隔3 d取样，共发酵39 d，共取117个样品。
1.1.2 试剂
2-辛醇、甲醇（均为色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
Bruker SCIONSQ456气相色谱-质谱联用仪：德国Bruker公司；DB-Wax色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；DVB/CAR/PDMS（50/30 μm）顶空固相萃取头、手动SPME进样器：美国Supelco公司。
1.3 方法
1.3.1 酒醅中挥发性风味物质的测定[21]
样品前处理：称取2 g酒醅样品至20 mL规格HS-SPME样品瓶中，加入2.88 g氯化钠和8 mL蒸馏水，振荡均匀后加入10 μL质量浓度为2.2 g/L的2-辛醇作为内标。采用顶空固相微萃取方法进行风味物质富集，吸附温度为50 ℃，时间为40 min，随后在250 ℃下解吸5 min后进行GC-MS分析。
GC条件[22]：使用DB-Wax色谱柱（30 m×0.32 mm×0.25μm），载气为高纯氦气（He）（≥99.999%）；流速1.0mL/min，气化室温度250 ℃；升温程序为起始温度40 ℃，维持3 min后再以5 ℃/min的速率升至60 ℃，然后以10 ℃/min速率升至230 ℃，最后维持8 min，共计32 min。
MS条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子倍增器电压为350 V，发射电流200 μA，电子能量为70 eV，离子源和接口温度分别为200 ℃和250 ℃，扫描方式为全扫描，扫描范围33～450 amu。
定性定量分析：挥发性风味化合物经计算机检索，与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）谱库相匹配，结合保留指数（retention index，RI）对酒醅中的挥发性风味物质进行定性，采用内标法计算各挥发性风味物质的含量，以干醅质量计。
1.3.2 主成分分析[23-24]
选取巴特利特球形检验（Bartlett Test of Sphericity）和KMO（Kaiser-Meyer-Olkin）检验验证所选的21种挥发性酯类物质（即变量）是否适用于主成分分析。基于21个变量的协方差矩阵，选取特征值＞1以及累计方差贡献率＞80%的主成分进一步分析[25]。通过主成分的载荷图和得分图解析造成各样本差异的主要变量。
1.3.3 数据处理
本研究采用R3.6.3软件对GC-MS下机数据进行处理，通过Graphpad Prism 8.0软件绘制折线图、堆积柱状图。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中上层酒醅挥发性风味物质变化
在上层酒醅发酵过程中共检测到99种挥发性风味物质，其中包括54种酯类、12种醇类、15种酸类、7种醛酮类、5种酚类和6种其他化合物。上层酒醅中，醇、酸和酯3类挥发性物质含量之和占挥发性风味物质总含量的99%。对发酵过程中上层酒醅的醇类、酸类、酯类化合物含量的变化进行分析，结果见图1。
由图1a可知，在整个发酵过程中，上层酒醅的醇类、酸类、酯类含量的变化具有很强的相似性。在第0～15天有较大的波动性；在发酵末期（第36～39天）增长较迅速。醇类物质的含量在发酵终止（11.5 μg/g干醅）比发酵起始（0.8 μg/g干醅）提高10倍以上；酸类物质含量在发酵终止（95.8 μg/g干醅）比发酵起始（8.9 μg/g干醅）提高10倍以上；酯类物质含量在发酵终止（457.6 μg/g干醅）比发酵起始（9.4 μg/g干醅）增加约50倍。综合来看，在上层酒醅特有的发酵环境中，各类物质的产生、积累和消耗具有相似性和统一性。
图1 发酵过程中上层酒醅醇、酸、酯三类化合物总量（a）与相对含量（b）变化规律
Fig. 1 Changes rule of the total contents (a) and relative contents (b)of alcohols,acids and esters in upper layer of fermented grains during fermentation process
由图1b可知，在上层酒醅中，在第0～15天范围内，酯类物质含量从49.0%增加至80.4%；发酵时间＞15 d后，酯类物质含量变化小幅度波动；发酵起始时，上层酒醅中酸类物质相对含量为46.9%，在第15天，其相对含量减少至15.4%，发酵时间＞15 d后，酸类物质相对含量变化趋势较平稳；而醇类物质在整个发酵过程中相对含量的变化幅度较小（1.7%～8.5%）。这可能是由于在发酵前期微生物产生酯化酶，催化醇类和酸类物质生成多种酯类化合物，随着酸类物质相对含量的减少，酯化速度逐渐变缓，到后期这些酯类化合物稳定积累，或者重新分解、合成，形成更高级脂肪酸酯类化合物，在整个发酵过程中醇类物质相对含量在产生与消耗中保持动态平衡[26]。
2.2 发酵过程中中层酒醅中挥发性风味物质变化
泸型酒发酵过程中，中层酒醅中共检测到98种挥发性风味物质，其中包括54种酯类、14种醇类、8种酸类、9种醛酮类、6种酚类和7种其他类物质，其中，醇、酸和酯三类挥发性含物质的含量之和占总含量的99%。对发酵过程中中层酒醅的醇类、酸类、酯类化合物进行分析，分析结果见图2。
图2 发酵过程中中层酒醅醇类、酸类、酯类化合物总量（a）与相对含量（b）变化规律
Fig. 2 Changes rule of the total contents (a) and relative contents (b)of alcohols,acids and esters in middle layer of fermented grains during fermentation process
由图2a可知，在整个发酵过程中，酸类物质的变化较平稳，而醇类和酯类物质都是在发酵第0～24天和第24～39天表现出先上升后下降的变化趋势，与上层酒醅发酵过程中醇、酸、酯类物质的变化趋势不同。酸类物质含量在整个发酵过程中的含量范围在8.9 μg/g干醅～9.2 μg/g干醅范围内；从发酵起始到发酵终止，醇类物质含量从0.8 μg/g干醅增长到2.8 μg/g干醅；发酵终止酯类物质含量（77.1 μg/g干醅）比发酵起始（9.4 μg/g干醅）增加约8倍。综合比较中层酒醅发酵过程中醇类、酸类、酯类化合物的变化发现，中层酒醅中的挥发性风味物质相对含量相较于上层酒醅都明显减少，可能是由于中层酒醅未接触封窖泥，较少被窖泥中微生物利用所致。
由图2b可知，中层酒醅与上层酒醅在发酵过程中的主要挥发性风味物质相对含量变化趋势相同，在发酵第0～15天，酯类物质相对含量从49.0%迅速上升至87.7%，当发酵时间＞15 d，酯类物质相对含量变化小幅度上升；在发酵第0～15天，酸类物质相对含量迅速下降，从46.9%下降至10.9%，当发酵时间＞15 d，酸类物质相对含量小幅度下降；在整个发酵过程中，醇类物质相对含量变化趋于平稳（1.6%～4.2%）。
2.3 发酵过程中下层酒醅中挥发性风味物质变化
泸型酒发酵过程中，下层酒醅中检测到97种挥发性风味物质，其中包括49种酯类、16种醇类、9种酸类、12种醛酮类、4种酚类和7种其他化合物。下层酒醅中醇类、酸类、酯类挥发性物质含量之和占挥发性风味物质总含量的99%。对发酵过程中中层酒醅的醇类、酸类、酯类化合物进行分析，分析结果见图3。
图3 发酵过程中下层酒醅醇类、酸类、酯类化合物总量（a）与相对含量（b）变化规律
Fig. 3 Changes rule of the total contents (a) and relative contents (b)of alcohols,acids and esters in lower layer of fermented grains during fermentation process
由图3a可知，在整个发酵过程中，醇类、酸类、酯类化合物的变化趋势表现出极高的一致性，在发酵第0～12天和第15～27天表现出先上升后下降的变化趋势，在发酵后期（第36～39天）呈上升趋势，与上层和中层酒醅中此三类物质的变化有一定区别。醇类物质含量在发酵终止（4.0 μg/g干醅）比发酵起始（0.8 μg/g干醅）提高5倍；酸类物质含量在发酵终止（43.8 μg/g干醅）比发酵起始（8.9 μg/g干醅）提高约5倍；酯类化合物含量在发酵终止（196.0 μg/g干醅）比发酵起始（9.4 μg/g干醅）增长20倍以上。
由图3b可知，与上层和中层酒醅相同，泸型酒发酵过程中，下层酒醅中醇类、酸类和酯类化合物相对含量变化差异明显。在下层酒醅发酵过程中，酯类物质相对含量在0～15 d范围内，从49.0%增加至84.5%，当发酵时间＞15 d后，酯类物质含量小幅度波动；酸类物质相对含量在0～15 d范围内，从46.9%减少至11.5%，当发酵时间＞15 d后，相对含量变化相对稳定；与上、中层酒醅相同，醇类物质占比在下层酒醅整个发酵过程中变化幅度较小（1.4%～7.1%）。
上述结果表明，泸型酒窖池内不同层酒醅的理化环境不尽相同，导致生长在酒醅中的微生物所处微环境不同，由代谢活力的差异影响了代谢物在酒醅中积累的含量[27]。在整个发酵过程中，上层酒醅中主要挥发性风味物质的含量最高，中层酒醅次之，下层酒醅最低。通过对比发酵过程中三层酒醅的相对含量可知，各类化合物的含量占比在不同层酒醅中变化趋势较一致，说明不同层酒醅中微生物代谢规律具有一定的相似性，但有待进一步研究。
2.4 主成分分析
酯类物质是白酒风味的主要组成部分，具有多种水果香气，在浓香型白酒中是种类和含量最多的风味物质[26，28]。选择相对含量最高的酯类物质进行主成分分析。在发酵过程中，不同层酒醅中酯类物质变化规律相似，酯类物质的变化包括2个阶段：含量占比上升的第0～15天以及变化较为平稳的第18～39天，但仍不清楚这两个阶段的特征酯类物质。因此，选择在整个发酵过程＞75%检出率的酯类，最终确定了21种酯类物质，编号为Z1～Z21，作为主成分分析的21个变量。
首先考察所取的21个变量是否适合进行主成分分析，采用的检验方法是Bartlett球度检验（相伴概率＜0.05）和KMO检验（KMO值＞0.6）。结果显示，相伴概率为0.00，KMO值为0.64，证明了21个酯类物质可作为主成分分析的代表性变量。
对21个酯类物质进行主成分分析，原始信息被降为4个主成分，F1、F2、F3和F4的方差贡献率分别为35.64%、20.87%、12.54%和8.04%，累计方差贡献率为77.092%，说明这4个主因子对21个变量的解释度为77.092%。基于主成分分析的21种酯类物质的成分矩阵见表1。
由表1可知，对第一主成分F1来说，乳酸乙酯（Z2）、丁二酸二乙酯（Z4）、戊酸乙酯（Z6）、己酸丙酯（Z8）、己酸丁酯（Z9）、庚酸乙酯（Z12）、反油酸乙酯（Z16）、亚油酸乙酯（Z17）、棕榈酸乙酯（Z19）和苯乙酸乙酯（Z20）表现出较高的载荷值，说明这些物质与F1相关性较强；丁酸异戊酯（Z5）、己酸乙酯（Z7）、己酸异戊酯（Z10）、辛酸乙酯（Z13）、壬酸乙酯（Z14）、癸酸乙酯（Z15）和月桂酸乙酯（Z18）在第二主成分F2上有较高的载荷值，表明F2与其有很强的相关性；在第三主成分F3上，乙酸乙酯（Z1）、丁酸乙酯（Z3）和己酸己酯（Z11）载荷值较高，表明F3与这三个变量相关性较强；同理，第四主成分F4与苯丙酸乙酯（Z21）有很强的相关性。通过考察泸型酒发酵过程酒醅样本挥发性物质的特征差异以及21个变量的贡献度，获得21个变量的得分图与载荷图，结果见图4。
图4 泸型酒发酵过程酒醅中21种酯类物质的得分图（a）与载荷图（b）
Fig. 4 Score diagram (a) and load diagram (b) of 21 esters in fermented grains during strong-flavor Baijiu fermentation process
▲表示中短链脂肪酸酯（C＜10）；○表示长链脂肪酸酯或芳香族脂肪酸酯（C＞10）。
表1 基于主成分分析的21种酯类物质的成分矩阵
Table 1 Composition matrix of 21 esters based on principal component analysis
由图4a可知，发酵过程酒醅风味特征可以以第15天为界限，被明显地区分为两个发酵阶段。由图4b可知，21种酯类物质在主成分1（principal component1，PC1）轴上区分度良好，所有长链脂肪酸酯或芳香族脂肪酸酯都分布在PC1轴的正向区域，除乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯之外，其他的中短链脂肪酸酯都分布在PC1轴的负向区域。
由图4b可知，在发酵前期（第0～15天）的特征酯类化合物中，出现了白酒四大酯中的乙酸乙酯和丁酸乙酯；戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯和壬酸乙酯4种其他乙酯；以及丁酸异戊酯、己酸丙酯、己酸丁酯、己酸异戊酯、己酸己酯5种其他酯类；发酵后期（第18～39天）的特征酯类化合物出现了四大酯中的己酸乙酯和乳酸乙酯，以及丁二酸二乙酯和癸酸乙酯这两种乙酯。结合己酸乙酯在酒醅发酵过程中的相对含量变化，发现发酵后期为己酸乙酯积累的主要时期，推测适当延长发酵时间对泸型酒主体风味特征的突出有重要的正向作用。
3 结论
本研究聚焦于泸型酒酿造过程中的酒醅发酵工艺环节，通过HS-SPME/GC-MS分析技术对窖池内不同层酒醅挥发性风味物质的组成和变化规律进行了分析发现，上、中、下三层酒醅中的主要挥发性风味物质为醇类、酸类和酯类，在整个发酵过程中，不同层酒醅中醇类、酸类和酯类的变化趋势相似，其中，醇类物质相对含量的变化在整个发酵过程中变化不明显；酯类物质相对含量在发酵前期（第0～15天）呈上升趋势，而酸类物质相对含量逐渐下降，在发酵后期（第18～39天），这两类物质相对含量相对稳定；发酵结束时，上层酒醅中醇类、酸类、酯类物质总量最多，下层酒醅次之，中层酒醅最低。通过PCA分析，确定了泸型酒发酵过程的两个不同阶段（发酵第0～15天和18～39天）酒醅中的特征酯类物质。通过以上分析发现，适当延长发酵时间对泸型酒主体风味特征的突出有重要的正向作用。本研究初步确定了酒醅中的特征风味物质，为后续探究浓香型白酒酿造机理奠定了基础。
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