发酵乳源于公元前3 000多年，目前主要指的是以鲜牛乳或者乳制品为主要原料，通过发酵加工制成的乳制品[1]。发酵乳中的益生菌，可以有效地防止有害细菌的繁殖，使人体的肠道内有毒的物质和细菌逐渐减少，并降低肿瘤的风险，从而可以达到调节人体肠道菌群作用，提高人们自身免疫力，对身体有健康和营养功能的作用[2]。黑枸杞（Lycium ruthenicum）属茄科，是中国西部的一种药用植物，味甘、性平和，含有脂肪、糖类、生物碱和维生素等多种成分，以及丰富的天然水溶性的原花青素，并被誉名为野生的“蓝色妖姬”[3-4]。它可以延缓衰老，防治糖尿病，易溶于水，属于天然的水溶性黄酮类，可以降血脂，还可以用于滋补身体、降血压和药用，并富含多种蛋白质[5]。红枣（Ziziphus jujuba）属李科枣[6]，维生素含量高，有“维生素王”的称誉，具有补血足气的效果，《本草纲目》有记载：枣味甘、性温和，能够补中气，清肝明目，治疗“脾虚弱、气血两虚、补血滋养”等疾病。红枣具有防治体弱多病、神经衰弱、脾胃不和、养肝护肝等功能，有“日食三颗枣，百岁不显老”之俗称。研究表明，红枣能促进白细胞的生成，降低胆固醇、延缓衰老、提高自身免疫力、防动脉硬化、温暖身体等作用[7]。目前，以黑枸杞为原料制备发酵乳的研究较少，且发酵原料仅只有黑枸杞[7]，但关于非发酵型饮料的研究较多[8]。红枣发酵乳饮料目前研究较多，其发酵原料主要为红枣和一些营养物质如紫薯、竹笋等[9-10]。将黑枸杞和红枣结合制备一种新型发酵型乳饮料，实现二者营养及药用价值的互补，使乳饮料营养及药用价值更加丰富，实用价值更大，具有很大的市场前景。
本研究以黑枸杞、红枣、鲜牛奶为主要原料制作出一款新型的黑枸杞红枣风味发酵乳，采用单因素试验来研究枸杞汁添加量、红枣汁添加量、白糖添加量、发酵时间、菌种量对发酵乳的影响，在此基础上，以模糊数学感官综合评价为响应值[8]，利用响应面法对黑枸杞红枣风味发酵乳的发酵工艺进行优化[11]，并对其感官、理化和微生物指标进行评价，旨在为黑枸杞红枣风味发酵乳的研究提供重要参考和研发依据，弥补目前研究空白，为其工业化生产鉴定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑枸杞：宁夏杞里香现代生态农业科技发展有限公司；红枣（新疆若羌红枣）：市售；白糖（食品级）：大丰英茂糖业有限公司；变性淀粉MLB-03A：宜瑞安食品配料有限公司；复配增稠剂BDS1005（食品级）：丹尼斯克（中国）有限公司；菌种ABY-10（200 U/袋）：科汉森（北京）贸易有限公司；新鲜牧场高品质鲜牛乳（蛋白质含量3.4 g/100 mL）：江苏光明银宝乳业有限公司。
氢氧化钠、乙酸铅、磷酸氢二钠、浓硫酸、硫酸铜、氨水、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠标准品、硫酸钾、乙醚、石油醚、甲醇、乙腈、辛烷磺酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；三聚氰胺标准品（纯度＞99%）：武汉中昌国研标物科技有限公司。
MRS、MC培养基：苏州海博生物技术有限公司；孟加拉红、平板计数琼脂培养基：北京陆桥技术股份有限公司。
1.2 仪器与设备
SPECORD 210紫外分光光度计：德国耶拿分析仪器股份有限公司；Kjeltec8400全自动凯氏定氮仪：丹麦福斯分析仪器有限公司；1260高效液相色谱仪、7890B气相色谱仪：美国安捷伦有限公司；PHB-4型pH计：上海精密科学仪器有限公司；XG1.CD-300M卧式灭菌锅：山东新华医疗器械有限公司；XPE205DR分析天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；N1-50全自动氮吹浓缩仪：广州仪德精密科学仪器股份有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博讯医疗生物器械有限公司；FT1乳品快速分析仪：丹麦福斯公司；DH3600B Ⅱ电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；BX53F显微镜：德国蔡司股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黑枸杞红枣风味发酵乳加工工艺流程及操作要点
操作要点：
黑枸杞汁的制备[12]：选取果实比较丰富饱满、外表无损坏的优质黑枸杞，清洗去除表面灰尘，按照料液比1∶20（g∶mL）加水煮沸，将料液于打浆机中打碎成浆，80目过滤塞过滤，即得黑枸杞汁，备用。
红枣汁的制备[13]：挑选外表光滑，果实饱满红润，并且无霉变和损坏的红枣，去除红枣中的杂质和干瘪成分，清水洗净红枣后，沥干水分后去核，按照料液比1∶7（g∶mL）加水煮沸，将料液于打浆机中打碎成浆，80目过滤塞过滤，即得到红枣汁，备用。
混合：以发酵乳的总质量为基准，在牛奶中添加10%红枣汁、11%黑枸杞汁、5%蔗糖，0.06%增稠剂，混匀。
灭菌、冷却：混合料与85 ℃灭菌25 min，并迅速冷却至40 ℃。
加入发酵剂：在灭菌、冷却至40 ℃混合液中加入菌种ABY-10 0.002%，搅拌均匀，覆盖保鲜膜隔氧。
发酵：将混合液置于43 ℃恒温条件下发酵5 h，待混合液由液态变为固态凝乳，滴定酸度达到70 T°完成发酵。
后熟：将发酵后的发酵乳放于4～6 ℃的冰箱中后熟12 h，即得到黑枸杞红枣风味发酵乳。
1.3.2 发酵工艺优化
（1）单因素试验[14]
设置黑枸杞汁添加量分别为5%、7%、9%、11%、13%；红枣汁添加量分别为6%、8%、10%、12%、14%；白砂糖的添加量分别为4%、5%、6%、7%、8%；菌种接种量分别为0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%；发酵时间分别为4.5 h、5.0 h、5.5 h、6.0 h、6.5 h，分别考察上述各因素对黑枸杞红枣风味发酵乳蛋白质含量及感官品质的影响。
（2）响应面试验
在单因素试验的基础上，固定黑枸杞汁添加量为11%，以红枣汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）、菌种添加量（C）和发酵时间（D）为影响因素，以感官评分（Y1）和蛋白质含量（Y2）为响应值，采用Design-Expert10.0.7软件设计4因素3水平响应面试验，Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments
1.3.3 感官评定方法
参考GB 19302—2010《食品安全国家标准发酵乳》，邀请10位经过感官培训的人员组成感官品评小组，然后按照顺序从产品的色泽、气味、滋味、组织状态这4个方面，以优、良、中、差这4个等级中对每次品尝完的样品进行评分，满分10分。感官评分标准见表2。
表2 黑枸杞红枣风味发酵乳感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented milk with black wolfberry and jujube flavor
续表
1.3.4 模糊数学感官评价法的建立
（1）因素集、评语集及权重集的建立
因素集是用黑枸杞和红枣发酵型乳饮料感官评价因素的集合，对气味（U1）、滋味（U2）、组织状态（U3）和色泽（U4）为指标建成的评价因素集，U={U1，U2，U3，U4}[15]。评语集是感官评价员对评价因素集的分数集合，评语集V={优V1，良V2，中V3，差V4}。权重集的确定采用用户调查法和二元对比的方法[16-17]，权重集W=（W1，W2，W3，W4）=（0.29，0.31，0.20，0.20），其中W1，W2，W3，W4分别是风味发酵乳饮料的气味、滋味、组织状态和色泽的权重。
（2）模糊矩阵的建立及评价结果的确定[18]
由10位感官评价员来按照黑枸杞红枣风味发酵乳的色泽、气味、滋味、组织状态这4个因素来进行感官综合评价，评价之后可统计出各个因素在各个等级中的票数，然后根据所得的票数结果可得出风味发酵乳的感官评价模糊关系矩阵M。
其中k=1，2，3，4，5，…n为样品的编号，里面的每一行都代表每一个的质量因素的评价数据结果。然后依照风味发酵乳模糊数学评价模型T=W×Mk（其中T评价集，W为权重系数，M为模糊矩阵）对第k号样品的感官评分进行计算。
1.3.5 理化和微生物指标检测
脂肪的测定：按照国标GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》中的碱水解法；蛋白质的测定：按照国标GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；乳糖、白糖的测定：按照国标GB 5413.5—2010《婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》中的莱茵-埃农氏法；酸度的测定：按照国标GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》中的酚酞指示剂法；水分的测定：按照国标GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中的直接干燥法；非脂乳固体的测定：按照国标GB 5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固体的测定》；亚硝酸盐的测定：按照国标GB 5009.33—2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的分光光度计法；三聚氰胺的检测：按照国标GB/T 22388—2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中的高效液相色谱法；乳酸菌测定：按照国标GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》；霉菌及酵母菌测定：按照国标GB 4789.15—2016《微生物学检验霉菌和酵母计数》。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
由图1a可知，随着黑枸杞汁添加量增大，感官评分呈先升高后降低的趋势；当黑枸杞汁的添加量为11%时，感官评分最高；当枸杞汁添加量＞11%之后，感官评分有所下降。蛋白质的含量稍有降低，但变化不大。因此，选择黑枸杞汁最适添加量为11%；由图1b可知，随着红枣汁添加量增大，蛋白质含量逐渐降低，但是变化不大。风味发酵乳的感官评分呈先升高后降低的趋势。当红枣汁添加量为6%～8%时，感官评分随之增高；当红枣汁添加量为8%时，感官评分为最高；当红枣汁添加量＞8%之后，感官评分有所下降。因此，红枣汁最适添加量为8%。由图1c可知，随着白砂糖添加量增大，风味发酵乳的感官评分及蛋白质含量均呈先升高后降低的趋势；当白砂糖的添加量为4%～7%时，感官评分及蛋白质含量随之增加；当白砂糖的添加量为7%时，感官评分及蛋白质含量均为最高；当白砂糖的添加量＞7%之后，感官评分及蛋白质含量均有所下降。因此，选择白砂糖的最佳添加量为7%。由图1d可知，随着菌种接种量增大，风味发酵乳的感官评分及蛋白质含量均呈先升高后降低的趋势；当菌种的接种量为0.001%～0.003%时，感官评分及蛋白质含量随之增加；当菌种的接种量为0.003%时，感官评分及蛋白质含量均为最高；当菌种的接种量＞0.003%之后，感官评分及蛋白质含量均有所下降。因此，选择菌种最佳接种量为0.003%。由图1e可知，随着发酵时间的延长，风味发酵乳的感官评分及蛋白质含量均呈先升高后降低的趋势。当发酵时间为4～5 h时，感官评分及蛋白质含量随之增加；当发酵时间为5 h时，感官评分及蛋白质含量均为最高；发酵时间＞5 h之后，感官评分及蛋白质含量均有所下降。因此，选择最佳发酵时间为5 h。
图1 各因素对黑枸杞红枣风味发酵乳感官品质及蛋白质含量的影响
Fig.1 Effect of various factors on sensory evaluation and protein contents of fermented milk with black wolfberry and jujube flavor
2.2 模糊数学评价法分析结果
采用模糊数学评价和响应面结合优化黑枸杞红枣风味发酵乳，各因素感官评价的投票结果见表3。
表3 黑枸杞红枣风味发酵乳感官评价投票结果
Table 3 Voting results of sensory evaluation of fermented milk with black wolfberry and jujube flavor
将表3中的数据建立模糊评价矩阵，将每个样品的各自影响因素的得票数除以总的参与评价人数10即可得到各个模糊矩阵M1～M29，以1号产品为例：滋味的评价人数分别为：8人选优，2人选良，0人选中，0人选差，则M气味=（0.5，0.4，0.1，0），M滋味=（0.6，0.2，0.2，0），M状态=（0.4，0.4，0.2，0），同理M色泽=（0.5，0.3，0.1，0.1），由此可得到矩阵M1：
根据模糊数学计算原理和权重集W=（W1，W2，W3，W4）=（0.29，0.31，0.20，0.20），按照矩阵相乘方法，感官评价结果T1=W×M1=（0.511，0.318，0.151，0.02），对于V中的各个量，分别赋予其相应分值，优V1、良V2、中V3、差V4分别为9分、7分、5分、3分，V中各个值分别乘以相应分值，再相加即可得到1号感官评分，即1号样品感官评分：Y1=0.511×9+318×7+0.151×5+0.02×3=7.640分，同理可以计算出2～29号样品的感官得分。
由计算结果可知各发酵乳感官评分分都介于7.0～9.0分，将评分划分等级分值区间，8.5～9.0分为“优”，8.0～8.5分为“良”，7.5～8.0分为“中”，＜7.5分为“差”。其中4#号样品的模糊数学评价感官评分最高，为8.8分，属于等级“优”；6#、12#、16#、17#、19#、21#、23#、25#、27#、28#样品的模糊数学感官评分为8.2分、8.1分、8.3分、8.5分、8.4分、8.0分、8.0分、8.1分、8.2分、8.3分属于等级“良”；1#、2#、3#、8#、9#、11#、13#、22#、24#、26#样品的模糊数学评价感官评分7.6分、7.6分、7.9分、7.8分、7.9分、7.6分、7.6分、7.8分、7.7分、7.6分，属于等级“中”；7#、15#、18#、20#、29#样品的模糊数学评价感官评分为7.4分、7.2分、7.4分、7.4分、7.4分，属于等级“差”。29个发酵乳样品模糊数学评价优劣排序为：4#＞5#分＞10#，14#＞17#＞19#＞28#＞16#＞6#＞27#＞25#＞12#＞23#＞21#＞3#＞9#＞22#＞8#＞24#＞13#＞1#，11#＞26#＞22#＞7#＞29#18#＞20#＞15#。采用模糊数学评价法得到的感官评分最高的是4#样品，其工艺条件与响应面优化法的试验结果相近。利用模糊综合评价法对影响黑枸杞红枣风味发酵乳品质的工艺条件进行计算和分析，能够降低人为主观因素影响，适合区分多样品感官质量评价差异。
2.3 发酵工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，固定黑枸杞汁添加量为11%，以红枣汁添加量（A）、白糖添加量（B）、菌种添加量（C）和发酵时间（D）为影响因素，以感官评分（Y1）和蛋白质含量（Y2）为响应值，采用Design-Expert10.0.7软件设计4因素3水平响应面试验，Box-Behnken试验设计结果见表4，方差分析结果见表5。
对表4试验数据结果回归拟合，分别得到回归方程为：
表4 Box-Behnken试验设计结果
Table 4 Results of Box-Behnken experiments design
由表5可知，模型的P＜0.000 1，说明试验所采用的二次模型是极显著的。失拟项P=0.652 3＞0.05，说明对模型是有益的，模型据有高度可靠性[19-20]。对试验模型的可信度进行分析，得到决定系数R2=0.942 5，表明响应值的变化94.25%来自于所选因素，方程的拟合度较好，方程的调整决定系数R2Adj=0.884 9，说明有88.49%的试验符合该模型，与实际情况符合良好[21-24]。变异系数（coefficient of variation，CV）=1.87%，在此试验中说明这个模型方程能较好的反映出其真实性，方程模型具有良好重现性[23]。一次项B、C及交互项BD、二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A、D及二次项AB对结果影响显著（P＜0.05）。根据F值，各因素对试验结果影响的先后次序为B＞C＞A＞D。
表5 以感官评分为响应值的回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model using sensory score as response value
续表
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响为极显著
（P＜0.01）。
红枣汁添加量（A）、白砂糖添加量（B）、菌种接种量（C）、发酵时间（D）对黑枸杞红枣发酵乳感官品质的影响的响应面及等高线见图2。
图2 各因素交互作用对黑枸杞红枣发酵乳感官评分影响的响应面及等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on sensory score of fermented milk with
black wolfberry and jujube flavor
响应面越陡峭，等高线越密集，表明该因素对结果影响越显著[25]。由图2可知，BD响应面较陡峭，影响最显著，这与方差分析结果一致。
利用Design-Expert 10.0.7对感官评价和蛋白质回归方程进行回归分析，黑枸杞红枣发酵乳的最佳发酵工艺为：红枣汁添加量6.6%，白砂糖添加量6.43%，菌种添加量0.002 4%，发酵时间4.88 h，感官评分理论值为8.78分，蛋白质含量理论值为3.15 g/100 g。考虑到实际工艺条件，调整最佳制作工艺条件为红枣汁添加量为6%，菌种接种量为0.002 4%，发酵时间5 h，白砂糖添加量为6%。在此优化条件下进行3次平行验证试验，感官评分实际值为8.72分；蛋白质含量实际值为3.16 g/100 g，与预测值接近，说明该模型可以用于优化黑枸杞红枣发酵乳发酵工艺，确定其最佳发酵工艺为：纯牛奶76%，黑枸杞汁11%，红枣汁添加量为6%，菌种接种量为0.002 4%，发酵时间5 h，白砂糖添加量为6%，增稠剂0.06%。
2.4 黑枸杞红枣发酵乳理化及微生物指标
黑枸杞红枣风味发酵乳脂肪含量为3.05 g/100 g，蛋白质含量为3.20 g/100 g，酸度78.0 °T，亚硝酸盐含量为0.006 28 g/100 g，非脂乳固形物含量为8.6 g/100 g，灰分0.68 g/100 g，总固形物含量17.76 g/100 g；乳酸菌数为2.21×109 CFU/mL，大肠菌群及致病菌均未检出；均符合GB 19302—2010《发酵乳》的要求。
3 结论
以黑枸杞、红枣及鲜牛乳为主要原材料制备发酵乳，以感官评价和蛋白质为评价指标，利用模糊数学感官评价法进行感官评价，采用单因素及响应面试验优化最佳发酵工艺为：纯牛奶76%，黑枸杞汁11%，红枣汁添加量6%，菌种接种量0.002 4%，发酵时间5 h，白砂糖添加量6%，增稠剂0.06%。在此优化工艺条件下，发酵乳的感官评分为8.72分，蛋白质含量为3.16 g/100 g，其感官、理化及微生物指标均符合相关国标要求。这款新型的风味发酵型乳饮料采用了红枣酸甜细腻的淡香和黑枸杞中的原花青素，利用了最佳辅料的辅助，呈现浅红咖啡色，组织状态稳定，无乳清析出，不分层，口感流顺，酸甜可口，从而提升了发酵乳的品质功能。
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