酱油是一种传统的调味品，由于其独特的香气、味道和营养价值，在世界各地获得了认可[1]。由于原料、工艺和人文的差异性，使得不同地区的酱油有着不同的滋味和风味[2]。但酱油的制作过程通常都是由两步发酵过程制成的：制曲和酱醪发酵。米曲霉（Aspergillus oryzae）是制曲阶段的常用菌株，可以产生蛋白酶和淀粉酶等多种酶系，将原料中的大分子物质降解成小分子以利于酱醪阶段微生物的发酵[3]。接下来将成熟的曲与含有18%～22%NaCl的盐水溶液混合进行酱醪发酵。而酱醪发酵过程，是在一个复杂的微生物体系中，这对于合成关键的挥发性化合物、氨基酸、多肽和糖是非常必要的[4]。
乳酸菌和酵母菌对酱油的品质发挥着重要作用[5]，是酱醪发酵阶段的重要菌种。乳酸菌是酱油发酵前期重要的菌种，它能够产生乳酸、乙酸等有机酸。这些有机酸既可以作为风味物质的前体，又可以抑制致病菌的生长，保证产品质量。现已有报道表明，植物乳杆菌可以改善发酵豆浆中豆腥味和青草味[6]。目前，在酱油添加嗜盐四联球菌（Tetragenococcus halophilus）的应用较多，而对植物乳杆菌的研究还较少。因此，植物乳杆菌在酱油中的应用存在着巨大的前景。具有耐盐性的鲁氏接合酵母能够促进蛋白降解[7]，从而利用各种氨基酸底物水解成各种醇，如异丁醇、异戊醇和2-苯乙醇[8]，这些都是酱油特有的风味。同时还能进一步发生酯类发酵和酸类发酵。通过鲁氏接合酵母的添加，改变了发酵群落结构也进一步影响了酱油的质量。而酱油品质的提升不止需要微生物的参与来产生营养物质和香气成分，添加外源的调味基料也可以改善酱油的品质。其中酵母抽提物（yeast extract，YE）是以酵母为原料经过发酵、提取、转化和浓缩等工艺制成的食品配料产品[9]，它由肽类、氨基酸类、维生素类、微量元素类、核酸类等物质组成[10]。不仅能提供酸、甜、苦、咸、鲜的基本味道，所富含的有效成分还能参与食品风味的形成，已经广泛应用于调味品、方便食品和冷冻食品等行业[11]。近年来酵母抽提物在食品领域已成为热门研究，但在酱油中的应用及对微生物菌群的影响等探讨还较少。
因此，本研究将以酵母抽提物、植物乳酸菌和鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）作为外源添加物加入到酱醪的发酵过程中，考察不同添加物对发酵结束的酱醪的理化指标、微生物的菌落结构、挥发性风味物质和感官评价的影响，揭示酱油酿造过程中菌种的发酵功能及酵母抽提物的应用价值，为提高酱油生产工艺提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
酵母抽提物（蛋白质：47.0 g/100 g；碳水化合物：16.9 g/100 g）和鲁氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）S1：安琪酵母股份有限公司提供；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CS3：为本实验室保藏菌株。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%；MRS肉汤培养基：英国Oxoid公司。
1.1.2 试剂
C7～C40正构烷烃（色谱纯）：美国AccuStandard公司；2-辛醇（色谱纯）：美国Sigma-Aldrich公司；葡萄糖（分析纯）：天津市汇杭化工科技有限公司；酵母膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京索来宝科技有限公司
soil试剂盒：美国Omega Bio-tek公司。
1.2 仪器与设备
DY04-13-00立式高压灭菌锅：上海博讯实业有限公司；AllegraTa25R型高速离心机：美国BeckMan公司；QP2010 Ultra型气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用仪：日本岛津公司；顶空-固相微萃取（headspace solid state microextraction，HS-SPME）装置，配75 μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷（CAR/PDMS）固相微萃取头、顶空瓶：上海安谱实验科技股份有限公司；ABI
9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：美国ABI公司；Illumina MiSeq平台：美国Illumina Scientific公司。
1.3 方法
1.3.1 菌株的培养
植物乳杆菌CS3的培养：从甘油管中取适量植物乳杆菌CS3的菌液，接种至MRS液体培养基中，37 ℃活化24 h，活化3次，备用。
鲁氏接合酵母S1的培养：从甘油管中取适量鲁氏接合酵母S1的菌液，接种至酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培养基中，30 ℃活化24 h，活化3次，备用。
1.3.2 酱油样品的制备
将脱脂豆粕和麦麸按质量比6∶4混合，并在121 ℃下灭菌20 min。冷却至室温后，将0.3%的米曲霉接种到发酵培养基中。在30 ℃条件下堆积培养，待曲表面变为白色进行第一次翻曲。然后继续培养，直到表面变黄进行第二次翻曲。待颜色变为绿色时停止培养。随后加入18%盐水进行酱醪发酵。在酱醪发酵初期温度从15 ℃升高到30 ℃（每天升温1 ℃），之后在30℃条件发酵75 d。
1.3.3 外源物添加方式
将无添加的酱醪记为样品S0；YE（S1）的添加：在酱醪发酵开始即加入1%YE；鲁氏接合酵母S1（S2）的添加：在酱醪发酵15 d时加入107 CFU/g的鲁氏接合酵母S1；植物乳杆菌CS3（S3）的添加：在酱醪发酵15 d时加入107 CFU/g的植物乳杆菌CS3。
1.3.4 理化指标的测定
氨基酸态氮、总酸和可溶性无盐固形物参照GB/T 18186—2000《酿造酱油》的检测方法测定[12]，还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法测定[13]。
1.3.5 细菌总DNA提取及PCR扩增
根据
soil试剂盒说明书进行总脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）引物对V3-V4可变区进行PCR扩增。扩增程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环27次。最后72 ℃延伸10 min。扩增体系为：4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ri bonucleoside triphosphates，dNTPs），0.8 μL引物（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。
1.3.6 高通量测序
上海美吉生物医药科技有限公司利用Illumina MiSeq平台进行构建PE 2×300的文库和测序。原始测序序列使用FLASH软件进行拼接，使用的UPARSE软件根据97%的相似度对序列进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类，将比对阈值设置为70%。与Silva数据库（SSU123）进行对比。
1.3.7 挥发性风味成分检测
将3 mL的酱油样品置于15 mL的顶空瓶中，并加入210 μL 20 mg/L的2-辛醇。将密封的顶空瓶在磁力搅拌器中于60 ℃平衡15 min。平衡结束后，将萃取头在60 ℃下顶空萃取30 min，于250 ℃下解吸15 min进行GC-MS进样。GC条件：初始温度40 ℃下保持3 min，以4 ℃/min升温至150 ℃保持1 min，再以8 ℃/min升温至250 ℃保持6 min。以氦气（He）为载气，250 ℃的进样温度，1 min的进样时间。MS条件：离子源温度200 ℃，接口温度220 ℃，电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，扫描速率为3.00 scans/s。根据保留时间定性，采用内标法定量。
1.3.8 感官评价
从天津科技大学的学生和员工中招募了10名受训的专家（5名女性和5名男性），年龄在21岁～30岁之间，既往有感官评价经验。将样品置于不透明的一次性纸杯中，每杯含有20 mL酱油，每个样本都用一个三位随机数编码。在隔离的隔间中小组成员进行室温评估，使用1～9的等级对样品的强度进行评分，评分标准见表1。
表1 酱油的感官评分标准
Table 1 Sensory evaluation standards of soy sauce
2 结果与分析
2.1 不同外源添加物对酱醪理化指标的影响
对发酵结束的酱醪进行了基本理化指标的测定，结果见表2。
表2 不同外源添加物对酱油关键理化指标的影响
Table 2 Effect of different exogenous additives on key physical and chemical indexes of soy sauce
注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
由表2可知，样品S1的氨基酸态氮含量比空白组有显著提升（P＜0.05），相比S0提高了21%。而外源添加物为乳酸菌和酵母菌的处理组对氨基酸态氮含量并无显著影响（P＞0.05）。这是因为酵母抽提物中富含的氨基氮和全氮等全水溶性营养物质在生产过程中被释放出来。氨基酸态氮不仅有助于酱油的营养成分的生成，而且对其感官特征也有显著影响[15]。总酸含量在样品组也呈现升高的趋势，所有的处理组都与样品S0有显著差异（P＜0.05）。其中，样品S3总酸含量最高，这是因为样品S3中的乳酸菌在发酵过程中产生了多种有机酸使得总酸含量升高。在较高的酸度下可抑制腐败菌的生长，从而减少不良代谢物，保证酱油的产品质量安全。发酵结束时S2和S3样品与样品S0在还原糖的含量上有显著差异（P＜0.05），这是因为乳酸菌和酵母菌在生长过程中以还原糖为基质进行了代谢作用。样品S1、S2和S3样品的可溶性无盐固形物含量均已超过国标（可溶性无盐固形物含量≥15.00 g/100 mL）中规定的高盐稀态特级酱油的标准。通过3种不同外源添加物在酱油发酵过程中的加入发现：YE可以显著提高酱油的氨基酸态氮、可溶性无盐固形物含量（P＜0.05）；乳酸菌对酱油的总酸含量影响更大；酵母菌与无盐固形物含量也有着紧密关系。因此，不管是微生物还是成品调味基料在酱醪期间的加入都可以提高酱油的品质。
2.2 不同外源添加物对酱醪微生物群落的影响
将发酵90 d的四组样品进行了细菌群落丰度的检测，在属水平上的多样性差异结果见图1。
图1 基于属水平酱油样品微生物群落结构
Fig.1 Microbial community structure of soy sauce samples based on genus level
由图1可知，四联球菌属和乳杆菌属是所有样品中的优势属，样品S0中的四联球菌属（Tetragencoccus）是菌落组成中最大的属，由于其耐盐性，是发酵食品中的常见菌株[16-17]，在此酱油中相对丰度达到了70%。样品S1中乳酸菌的总比例与对照组没有明显差异，但不同乳酸菌的相对丰度发生了明显的变化。这是因为乳酸菌对各种氨基酸具有营养缺乏性[10]，而YE中所富含的氨基酸由于不同的比例，使得不同乳酸菌属需求的差异从而使丰度区分开来。高比例的四联球菌属的降低，使得其他菌属含量的相对提高，可能会使酱油中的代谢物质更加饱满，风味更加多元化。但另外两个处理组在发酵结束相比空白组四联球菌属的占比都明显下降，特别是S3样品中，随着植物乳杆菌（Lactobacillus）CS3的加入，乳杆菌属为占比最大的属，其相对丰度增加到45%。乳杆菌属是存在于人类口腔和胃肠道中的重要益生菌，能够增强免疫系统并改善身体炎症[18-19]。而在加入鲁式接合酵母之后，乳酸菌的丰度已经超过了90%。推断酵母菌的加入，所产生的CO2、丙酮酸、维生素以及琥珀酸等代谢物刺激了乳酸菌的生长[20-21]。同时，S2和S3处理组中乳杆菌属比例提高，它所产生的有机酸、环二肽和细菌素等物质被认为可抑制腐败微生物，从而提高产品质量。正如肠球菌属（Enterococcus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）的含量有所降低，它们虽然是人体的条件致病菌，但有必要尽量减少食品中致病菌的含量和造成危险的可能性[22-23]。而在风味形成和生物活性中被认为起着重要作用的魏斯氏菌属比例增加[24]。因此，在酱醪发酵过程中外源添加物的加入改变了微生物的菌落组成。
2.3 不同外源添加物对酱醪挥发性风味成分的影响
2.3.1 对风味物质种类及含量的影响
风味是评价酱油品质的重要指标，将不同添加物的酱油的挥发性风味物质种类及含量测定，结果见图2。
图2 4种酱油样品风味物质种类（a）及含量（b）比较
Fig.2 Comparison of flavor substances (a) and contents (b) of 4 kinds of soy sauce samples
由图2a可知，从样品中检测出89种挥发性物质，样品S0、S1、S2、S3中分别检出50种、66种、56种和66种。说明外源添加物有助于提高酱油挥发物质的种类，更利于各种风味物质的形成，使酱油风味更加多样和醇厚。其中酯类、醇类和酮类在各样品中都较为丰富。酯类是构成酱油香气成分的主体，不仅能增强酱油的香味，还能缓和酱油的咸味。在外源添加物的处理组中明显增加，而醛类物质的减少可能是在发酵过程中被催化成了相应的醇或酸。
由图2b可知，酯类和醇类的含量与其他风味物质是断层式呈现的。与空白组相比，S3样品中酸类物质也提高了84%。这可能是由于额外添加的乳酸菌在发酵过程中有机酸的生成。豆制品的“豆腥味”被认为与醛类物质有着紧密的联系[6]，处理组的醛类浓度相比较于样品S0含量降低可能是外源添加物在发酵进程中产生的代谢物对醛类物质发生了转化。
2.3.2 挥发性成分聚类分析
酱油中主要挥发性风味成分与样品之间的聚类分析结果见图3。
图3 发酵结束的酱油样品中主要风味成分聚类分析
Fig.3 Cluster analysis of main flavor components in soy sauce samples after fermentation
结果表明，处理组与样品S0挥发性风味不相似。酯类作为酱油的重要组成部分，主要包括2-甲基丁酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊酸乙酯。其中具有香蕉风味特征的乙酸异戊酯赋予酱油浓郁而柔和的特征，它是由曲霉或酵母的脂肪酶将大豆中的脂肪分解成脂肪酸，随后转化为酯。因此样品S2中具有较高含量。4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚是酱油的特征香气的物质，提供了烟熏香气。原料中的木质素被曲霉酶降解为阿魏酸等酚酸类化合物，进一步被球拟酵母通过脱羧还原转化为4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚[25]。其中样品S1表现特别突出，这可能是来自YE中自身的营养物质，如有机酸、氨基酸、小分子肽，为发酵过程的酵母菌的生长提供了更充足的底物。样品S2醇类物质含量高，主要是由于酵母菌的加入，将醛类物质、糖和氨基酸等物质利用和转化而来的[26]。其中乙醇含量是样品S0的2.23倍，乙醇含量越高相对应高级醇和酯的含量也会升高，从而使酱油的整体风味增强。与S0组相比，样品S3中具有酸败和豆腥味的己醛和壬醛含量显著下降，根据之前的研究发现，这可能是植物乳杆菌具有醛脱氢酶所致[27]。将样品S3样品中的醛类转化为酸类和醇类，进而通过酯化反应转化为富含水果香气的酯类，如乙酸己酯、正己酸乙酯、乙酸异戊酯等开始生成并增加，使酱油中令人不悦的挥发性风味减少。
2.4 不同外源添加物对酱醪感官品质的影响
对4个不同处理的样品进行感官评价，绘制雷达图，见图4。由图4可知，添加外源物的酱油整体评分提高。样品S1的酱香是S0的1.2倍；样品S2的醇香是S0的1.24倍；样品S3的果香是S0的1.6倍。综上分析，添加YE使酱油的酱香味最为突出，且辅以酱油醇香、麦芽香和果香的香气，使酱油整体风味较为均衡，具有酱油的典型特征。S3样品组在酱香味高于空白的基础上，赋予了酱油较高的果香味。而S2样品只在酱油附属香气的醇香和酯香上较为突出，但酱油主体的风味与空白差异不大。
图4 4种酱油发酵结束后的感官评价结果
Fig.4 Sensory evaluation results of 4 kinds of soy sauce after fermentation
3 结论
本研究将酵母抽提物、鲁氏接合酵母和植物乳杆菌三种不同外源添加物加入酱油发酵过程中，探讨其对酱油品质的影响。外源物的添加显著提高了酱油的理化品质，微生物群落在添加物的影响下也发生了改变，从四联菌属主导变为乳杆菌属的比例占比最大，其中添加植物乳杆菌的样品是对照组的2.64倍。而微生物丰度的变化间接使得风味成分也有所不同，处理组的酱油样品比空白组的风味物质种类明显增多，醇类和酸类的含量升高。作为主体风味的酯类物质增加，酱油特有风味的4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚变得突出且令人不悦的挥发性风味减少。外源物添加使得酱油的风味变得更加饱满和多元化，尤其是酵母抽提物的加入。因此，向发酵过程中额外加入外源添加物可使得酱油的营养成分和香气物质都能显著改变，未来不同外源物的添加对酱油的创新发酵有着良好的前景。
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