亚硝酸盐作为护色剂或防腐剂在肉制品加工中被广泛应用。在一定条件下，亚硝酸盐与二级胺或三级胺相互作用生成N-亚硝基化合物。存在于食品中的N-亚硝基化合物主要为N-亚硝胺类[1]，是毒性很强的一类物质[2]。研究显示，多种食物中都含有一定量的N-亚硝胺，如N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亚硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亚硝基哌啶（N-nitrosopiperi dine，NPIP）[1]，是食品中重要的致癌物[3]。N-亚硝胺诱发人体癌变具有明显的器官亲和性，不同化合物具有不同的致癌靶器官[4]。如外源性NDMA随食物进入体内，主要在肠道被吸收[4]，因此肠道黏膜成为NDMA发挥毒性作用的靶向组织[5]。而体内亚硝化反应生成内源NDMA也发生在肠腔内，因此，NDMA成为肠道癌的诱变剂[6]，诱导肠道黏膜细胞的损伤[7-9]。
在我国肉制品加工中，除控制护色剂、防腐剂使用量之外，也制订了N-亚硝胺的限量标准。现行食品安全国家标准GB 2762—2017《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定肉制品中NDMA含量≤3 μg/kg，海产品中NDMA含量≤5 μg/kg。虽然对肉制品及海产品中NDMA含量有严格限定，但是随着食品产地、种类及加工方式的不同，NDMA的含量也显著不同。调查显示，NDMA在我国熏肉制品中仅含0.3～6.5 μg/kg，而在日本加工干鱿鱼中含量高达300 μg/kg[4]。因此，除了改进加工工艺及在加工过程中添加抗氧化剂外，适当增加亚硝化阻断剂，如维生素C（vitamin C，VC）、维生素E（vitamin E，VE）、酚类及黄酮类的摄入量也可降低NDMA对人体的毒性损伤。
目前研究证实，乳酸菌可降低N-亚硝胺的毒性作用[2]，可直接降低食品（如泡菜、香肠）中N-亚硝胺的含量。LIAO E等[10-11]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）120的添加可显著降低中国传统发酵鱼制品中的亚硝酸盐和NDMA含量，说明乳酸菌是抑制中国传统发酵鱼制品发酵过程中NDMA累积的一种有效方法。有研究发现，乳杆菌属中的植物乳杆菌、双歧杆菌（Bifidobacterium）、保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、噬酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）具有降低N-亚硝基化合物含量的能力[12]，有望与VC、VE和酚类等一同作为亚硝化阻断剂。前期研究显示，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）SB27作为发酵菌种具有较强的耐酸、耐胆盐性能，可定植于人体肠道上皮细胞[13]。因此，在前期研究的基础上，本研究以干酪乳杆菌SB27为研究对象，考察NDMA、NDEA、NPYR和NPIP（0～80 μg/mL）对其生长繁殖的影响，并以VC（50 μmol/L）为阳性对照，采用细胞计数试剂盒（cell counting kit，CCK）-8法分析干酪乳杆菌SB27（103～106 CFU/mL）降低NDMA、NDEA、NPYR和NPIP（0～80 μg/mL）对大鼠肠道黏膜细胞IEC-6毒性作用的能力，以期进一步明确干酪乳杆菌SB27降解N-亚硝胺及菌株发挥功能的关键成分提供理论研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 细胞和菌株
大鼠肠道黏膜细胞IEC-6：东北农业大学食品学院；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）SB27：分离自甘肃北部的牦牛乳，现保存于哈尔滨工业大学化学工程与技术学院。
1.1.2 化学试剂
N-二甲基亚硝胺、N-二乙基亚硝胺、N-亚硝基吡咯烷、N-亚硝基哌啶：美国Sigma-Aldrich公司；CCK-8试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司；胰酶消化液：美国Corning公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）：美国Thermo Fisher Scientific公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
DMEM（Dulbecco's modified eagle medium）：美国Corning公司。
MRS液体培养基[14]：蛋白胨10 g/L，牛肉膏8 g/L，酵母浸粉5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1.0 mL/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸氢二胺2 g/L，七水硫酸镁0.58 g/L，三水乙酸钠5 g/L，硫酸锰0.25 g/L，蒸馏水1 000 mL，调整pH 6.2～6.6，于121 ℃高压蒸汽灭菌15 min。MRS固体培养基中添加琼脂18 g/L。
1.2 仪器与设备
HEPA1100二氧化碳培养箱、Forma 102厌氧培养箱：美国Thermo Electron公司；CX31电子显微镜：日本Olympus公司；Sartorius AG PB-10 pH计：德国Sartorius公司；Bio-Rad-680酶标仪：美国Bio-rad公司。
1.3 实验方法
1.3.1 N-亚硝胺工作液的制备
将NDMA、NDEA、NPYR和NPIP溶于双蒸水中，配成质量浓度为10mg/mL的储备液[15]，4℃保存。实验中将10mg/mL储备液稀释成1 000 μg/mL工作液，4 ℃保存备用。
1.3.2 N-亚硝胺在MRS液体培养基中对菌株SB27生长的影响
取50 μL菌液接种于MRS液体培养基中，轻微振荡，37 ℃培养18 h，活化2代后备用。将N-亚硝胺工作液加入MRS液体培养基中，使终质量浓度分别为0、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL[1]，将已活化的干酪乳杆菌SB27以4%（V/V）的接种量加入培养基中，37 ℃条件下培养7 d，每隔24 h采用倾注平板法进行菌落计数[16]。
1.3.3 干酪乳杆菌SB27对IEC-6细胞存活率的影响
将IEC-6细胞悬于DMEM中，调整细胞浓度为5×104个/mL，将细胞悬液加入到96孔组织培养板中，每孔100 μL。待细胞完全贴壁后，移去细胞培养液，加入10 μL各剂量的干酪乳杆菌SB27，使其终浓度分别为0（空白对照组）、103 CFU/mL、104 CFU/mL、105 CFU/mL和106 CFU/mL。各孔最后用DMEM补至100 μL。96孔培养板放置CO2培养箱中（5%CO2，95%空气，100%相对湿度），37 ℃条件下分别培养至2 h、8 h、14 h和20 h时加入10 μL CCK-8溶液，再继续孵育4 h。采用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值，并计算细胞存活率，其计算公式如下：
式中：A0为具有DMEM和CCK-8溶液的孔的吸光度值；A1为具有DMEM、IEC-6细胞、CCK-8溶液和干酪乳杆菌SB27的孔的吸光度值；A2为具有DMEM、IEC-6细胞、CCK-8溶液的孔的吸光度值。
1.3.4 干酪乳杆菌SB27降低N-亚硝胺毒性作用的检测
通过对大鼠肠道黏膜细胞IEC-6的生长增殖分析干酪乳杆菌SB27降低N-亚硝胺的毒性作用。采用CCK-8法，细胞处理及干酪乳杆菌SB27的添加同1.3.3，再分别加入NDMA、NDEA、NPYR和NPIP，使其终质量浓度分别为0、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL和80 μg/mL，阳性对照组为VC（50μmol/L）。96孔培养板放置CO2培养箱中（5%CO2，95%空气，100%相对湿度），37 ℃条件下培养至20 h时加入10 μL CCK-8溶液，再继续孵育4 h。采用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度值，并计算细胞存活率，其计算公式如下：
式中：A0为具有DMEM和CCK-8溶液的孔的吸光度值；A3为具有DMEM、IEC-6细胞、CCK-8溶液、干酪乳杆菌SB27和N-亚硝胺的孔的吸光度值；A4为具有DMEM、IEC-6细胞、CCK-8溶液的孔的吸光度值。
1.3.5 数据处理及统计分析
实验重复3次，利用SAS 9.1软件进行方差分析，结果表示为“平均值±标准偏差”（X±SD），显著性水平设定为P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 N-亚硝胺在MRS液体培养基中对干酪乳杆菌SB27生长的影响
N-亚硝胺在MRS液体培养基中对干酪乳杆菌SB27生长的影响见图1。
图1 不同质量浓度的NDMA（a）、NDEA（b）、NPYR（c）和NPIP（d）对干酪乳杆菌SB27生长的影响
Fig.1 Effect of different mass concentrations of NDMA (a),NDEA (b),NPYR (c) and NPIP (d) on Lactobacillus casei SB27 growth
由图1可知，随着培养时间的延长，各实验组干酪乳杆菌SB27的活菌数均呈先升高后下降的趋势，且各剂量组之间干酪乳杆菌SB27活菌数的差异不显著（P＞0.05）。说明随着培养时间的变化，干酪乳杆菌SB27活菌数的显著差异是由菌株自身生长和繁殖周期所致，并非N-亚硝胺的毒性损伤。结果表明，N-亚硝胺在MRS液体培养基中对干酪乳杆菌SB27的生长增殖无显著影响，与NOWAK A等[16]的研究结果相似。
2.2 干酪乳杆菌SB27对IEC-6细胞存活率的影响
干酪乳杆菌SB27对IEC-6细胞存活率的影响见图2。
图2 干酪乳杆菌SB27对IEC-6细胞增殖的影响
Fig.2 Effect of Lactobacillus casei SB27 on IEC-6 cells proliferation
不同大写字母表示同一组内不同培养时间IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示不同组间同一培养时间IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）。
由图2可知，随着培养时间的延长，各组IEC-6细胞的存活率呈现增长的趋势，培养6h与培养24h差异显著（P＜0.05）。但是在相同培养时间内，空白对照组和干酪乳杆菌SB27各剂量组差异不显著（P＞0.05）。说明干酪乳杆菌SB27对大鼠肠道黏膜细胞IEC-6的存活率并未产生显著的影响，因此可进行后续研究。
2.3 干酪乳杆菌SB27降低N-亚硝胺毒性的作用
VC每日推荐摄取量（recommended dietary allowance，RDA）约为60 mg/d[17]。人体每天摄入100 mg的VC会使血浆VC的浓度略低于60 μmol/L，由此推测平衡膳食条件下人血浆VC水平范围为5～50 μmol/L[18]。研究也显示，VC（50 μmol/L）在NPIP和NPYR存在下，对人的白血病细胞HL-60和肝癌细胞HepG2发挥保护作用。由于VC具有抗氧化性，又可减少N-亚硝胺对机体的损伤[19]，因此本研究选用VC（50 μmol/L）作为阳性对照，选定干酪乳杆菌SB27的活菌体成分，分析其发挥降低N-亚硝胺对IEC-6细胞毒性作用的能力。
2.3.1 干酪乳杆菌SB27降低NDMA毒性的作用
由图3可知，当干酪乳杆菌SB27添加量分别为104CFU/mL、105 CFU/mL、106 CFU/mL时，NDMA剂量为20～80 μg/mL时的IEC-6细胞存活率显著高于空白对照组（P＜0.05），NDMA剂量为0～10 μg/mL时的细胞存活率与空白对照组差异不显著（P＞0.05），以上各组与阳性对照组差异均不显著（P＞0.05）。当干酪乳杆菌SB27添加量为103 CFU/mL时，NDMA剂量为80 μg/mL时的IEC-6细胞存活率显著高于空白对照组（P＜0.05），NDMA剂量为0～40 μg/mL时的IEC-6细胞存活率与空白对照组差异不显著（P＞0.05）。
图3 干酪乳杆菌SB27降低NDMA对IEC-6细胞毒性作用
Fig.3 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NDMA to IEC-6 cells
不同大写字母表示同一组内不同NDMA剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示不同组间同一NDMA剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）。
有研究表明，NDMA会导致肝脏、胃肠道黏膜的损伤或形成肿瘤，100 mg的NDMA会导致人体腹泻、呕吐、肝毒性或死亡[20]。乳酸菌作为功能性益生菌，可通过生物的方式对抗N-亚硝胺的遗传毒性，抑制肠道黏膜的DNA损伤，如乳杆菌和双歧杆菌可剂量依赖性地保护人体肠道细胞系（HT-29或Caco-2）的遗传毒性作用[21]。本研究结果表明，干酪乳杆菌SB27（103～106 CFU/mL）可降低NDMA对大鼠肠道黏膜细胞IEC-6的毒性作用，可抑制NDMA诱导IEC-6细胞的损伤，分析原因可能是干酪乳杆菌SB27降低了NDMA的含量。乳酸菌发挥降低NDMA毒性的作用可能是通过吸收或降解有毒化学物的含量[2]，减少有毒化学物合成前体物或是乳酸菌抗氧化功能发挥的作用[22-23]。
2.3.2 干酪乳杆菌SB27降低NDEA毒性的作用
由图4可知，当干酪乳杆菌SB27添加剂量为104、105和106 CFU/mL时，NDEA剂量为40～80 μg/mL时的IEC-6细胞存活率显著高于空白对照组（P＜0.05），而NDEA剂量为0～20 μg/mL时的IEC-6细胞存活率与空白对照组差异不显著（P＞0.05），但以上各组均与阳性对照组差异不显著（P＞0.05）。当干酪乳杆菌SB27添加剂量为103 CFU/mL时，NDEA剂量为80 μg/mL时的IEC-6细胞存活率显著高于空白对照组（P＜0.05），NDEA剂量为0～40 μg/mL时的细胞存活率与空白对照组差异不显著（P＞0.05）。
图4 干酪乳杆菌SB27降低NDEA对IEC-6细胞毒性的作用
Fig.4 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NDEA to IEC-6 cells
不同大写字母表示同一组内不同NDEA剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示不同组间同一NDEA剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）。
有研究表明，乳酸菌可降低泡菜中亚硝酸盐的含量，且在MRS培养基中也有相似的研究结果[24]。戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）R3、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）R6、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）P1等五株乳酸菌在MRS培养液中可显著降低NDEA的浓度[11]。NDEA属于二级A类环境致癌物，会导致组织细胞活性氧的堆积，从而导致细胞的氧化应激和毒性损伤[25]。由于L.pentosus可降低N-亚硝胺的含量[26]，其可作为潜在的提高肉制品质量安全的一种发酵剂。本研究结果也说明，随着NDEA添加剂量的增加，其对大鼠肠道黏膜细胞IEC-6的毒性损伤作用增强，而高剂量的干酪乳杆菌SB27（104～106 CFU/mL）可显著抑制NDEA对IEC-6细胞的毒性损伤。
2.3.3 干酪乳杆菌SB27降低NPYR毒性的作用
由图5可知，当干酪乳杆菌SB27添加量为104、105、106 CFU/mL时，NPYR剂量为40～80 μg/mL时的IEC-6细胞存活率显著高于空白对照组（P＜0.05），NPYR剂量为0～20 μg/mL时的IEC-6细胞存活率与空白对照组差异不显著（P＞0.05），以上各组与阳性对照组差异均不显著（P＞0.05）。当干酪乳杆菌SB27添加剂量为103 CFU/mL时，NPYR剂量为80 μg/mL时的IEC-6细胞存活率显著高于空白对照组（P＜0.05），NPYR剂量为0～40 μg/mL时的IEC-6细胞存活率与空白对照组差异均不显著（P＞0.05）。结果显示，干酪乳杆菌SB27具有降低NPYR毒性的作用，减小了NPYR对IEC-6细胞存活的抑制作用。
图5 干酪乳杆菌SB27降低NPYR对IEC-6细胞毒性的作用
Fig.5 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NPYR to IEC-6 cells
不同大写字母表示同一组内不同NPYR剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示不同组间同一NPYR剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）。
2.3.4 干酪乳杆菌SB27降低NPIP毒性的作用
由图6可知，当干酪乳杆菌SB27添加量为103、104、105CFU/mL时，NPIP剂量为80 μg/mL时的IEC-6细胞存活率显著高于空白对照组（P＜0.05），NPIP剂量为0～40 μg/mL时的IEC-6细胞存活率与空白对照组差异不显著（P＞0.05），以上各组与阳性对照组差异均不显著（P＞0.05）。当干酪乳杆菌SB27添加量为106 CFU/mL时，NPIP各剂量组（0～80 μg/mL）的IEC-6细胞存活率与空白对照组差异不显著（P＞0.05）。
图6 干酪乳杆菌SB27降低NPIP对IEC-6细胞毒性的作用
Fig.6 Effect of Lactobacillus casei SB27 on reducing the toxic of NPIP to IEC-6 cells
不同大写字母表示同一组内不同NPIP剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）；不同小写字母表示不同组间同一NPIP剂量IEC-6细胞存活率差异显著（P＜0.05）。
由于NPIP是食品中普遍存在的致癌物[27]，而乳酸菌可降低食品中NPIP的含量，如弯曲乳杆菌（Lactobacillus curvatus）可显著降低哈尔滨红肠中NPIP的含量达14.6%[28]。本研究结果显示，干酪乳杆菌SB27可在肠道内发挥亚硝化阻断的作用，抑制NPIP诱发肠道黏膜细胞的损伤。
3 结论
本研究分析了四类N-亚硝胺（NDMA、NDEA、NPYR和NPIP）对干酪乳杆菌SB27生长影响及干酪乳杆菌SB27降低N-亚硝胺对大鼠肠道黏膜细胞IEC-6毒性的作用。结果显示，N-亚硝胺在MRS培养基中对干酪乳杆菌SB27的生长无显著影响（P＞0.05），干酪乳杆菌SB27可降低N-亚硝胺对大鼠肠道黏膜细胞IEC-6的毒性作用。
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