果醋是以水果或果品加工下脚料为主要原料，经微生物发酵酿制而成的一类酸性调味品或饮品。果醋中的有机酸以醋酸为主，此外，还有草酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、酒石酸、富马酸、苹果酸等[1]。除了含有丰富的有机酸，果醋中还含有多种矿物元素，如钾、钙、锌、钠以及花青素、黄酮、酚酸等活性成分[1]，具有降血脂[2]、调节人体酸碱平衡[1]、抗氧化、防癌变[3]等保健功效，在功能保健品市场拥有较大的开发潜力，市场前景广阔。
蓝莓是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium Linn.）多年生植物[4]，果实中富含维生素A（vitamin A，VA）[5-6]、维生素E（vitamin E，VE）[5-7]、花青素[8]、酚酸[7-9]和超氧化物歧化酶[10-11]等多种活性成分，尤其是花青素含量极其丰富[12]。花青素是一种类黄酮类色素[13]，酸性环境下相对比较稳定，具有抗氧化[14]、抗肿瘤[15]、消炎[16]和保护视力[17]等功效，现已成为药学及营养学等领域的研究热点。酸樱桃（Cerasus valgaris）是蔷薇科（Rosaceae）李属（Prunus L.）植物[18]，其果实酸味突出，营养丰富，花青素[19-20]、褪黑激素[21]、槲皮素[18]等活性成分含量较高。
目前已有利用蓝莓酿制果醋的相关报道。荣智兴[22]对固定化发酵条件下的蓝莓果醋加工工艺进行了研究，确定了最适工艺条件。陈曦等[23]采用液态发酵法，结合响应面分析软件，优化了蓝莓果醋的发酵工艺条件。朴银子等[24]总结了蓝莓果醋的制备工艺，并综合分析了其品质。已有关于樱桃果醋的研究报道，冯志彬等[25]通过对比试验分析，确定了樱桃果醋的生产工艺及其饮料的优化配比。杨小姣等[26]以樱桃酒糟为原料，利用多菌种发酵制得了醋香浓郁的樱桃果醋。刘宝祥等[27]研究了樱桃果醋的深层液态发酵工艺，并通过高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）检测了果醋的有机酸组成。蓝莓、酸樱桃鲜果皆属于不能耐长时间储运的小浆果，适于通过食品加工延长贮藏时间，而将二者混合发酵制成蓝莓-酸樱桃复合果醋，不仅克服了采用一种原料酿制果醋色、香、味单一的缺陷，还能充分发挥二者花青素含量均较高的营养特色，起到风味互补和营养强化的作用。
因此，本研究以总酸含量为评价指标，采用单因素试验和响应面试验考察了沪酿1.01（巴氏醋杆菌）（Acetobacter pasteurianus）接种量、酒精度、发酵温度和发酵时间对复合果醋品质的影响，确定蓝莓-酸樱桃复合果醋最佳的醋酸发酵工艺条件，并对复合果醋的品质指标与抗氧化性进行研究。以期丰富果醋的产品种类，增加两种水果的应用途径，提高食用附加值，为深加工利用提供理论基础和技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
酸樱桃：吉林省蛟河试验林场，预冷后放入冰箱内冷冻贮藏；蓝莓：吉林省临江蓝莓基地，预冷后放入冰箱内冷冻贮藏；安琪果酒酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；沪酿1.01（巴氏醋杆菌）（Acetobacter pasteurianus）：上海迪发酿造生物制品有限公司。
1.1.2 试剂
果胶酶（100 000 U/g）：北京索莱宝科技有限公司；蔗糖（一级）：市售；亚硫酸氢钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析纯）：美国Sigma公司；维生素C（Vitamine C，VC）（分析纯）：天津市北辰方正试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、琼脂、酵母膏（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；碳酸钙、氢氧化钠（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。
1.1.3 培养基
醋酸菌斜面培养基：10%葡萄糖、2%碳酸钙、2%琼脂、1%酵母膏和100 mL水。0.1 MPa、121 ℃灭菌30 min。灭菌后的试管摆成斜面，待培养基凝固，放入30 ℃培养箱中培养48 h，无杂菌即可。
1.2 仪器与设备
BS-1E型恒温振荡培养箱：金坛市华城开元实验仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅：江苏省金坛市科技仪器有限公司；LDZX-40 Ⅱ型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；FA2004A电子天平：上海精天电子仪器有限公司；精密酒精计（精度0.1）：河间市振岩仪器仪表厂；雷磁PHSJ-5精密酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；JYL-C16T榨汁机：九阳股份有限公司；WYT-G型手持糖度计：成都豪创光电仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 蓝莓-酸樱桃复合果醋加工工艺流程及操作要点
蓝莓、酸樱桃的预处理：去除蓝莓果和酸樱桃鲜果中的杂质及有病虫害和霉烂的坏果，将挑选出来的果实冲洗干净，沥去水分。
混合、破碎：将蓝莓与去核后的酸樱桃按质量比1∶1混合，充分破碎、搅拌，使两种果浆能均匀的混合在一起。
酶解、榨汁过滤、成分调整：向经过破碎处理的混合果浆中加入0.09 g/L的果胶酶，40～45 ℃酶解3～4 h，然后用榨汁机榨汁，所得混合果汁用200目滤布过滤，再向过滤后的混合汁中添加23%蔗糖，同时加入0.03%的亚硫酸氢钠，抑制起始发酵时的有害微生物，保证酵母菌的正常生长繁殖。
杀菌：混合果汁经过成分调整后，于70～75 ℃保温30 min，进行杀菌处理[28]。
酵母活化：将安琪果酒酵母按1∶10（g∶mL）的料液比加入到2%蔗糖溶液中，在35 ℃条件下活化30 min[29]。
酒精发酵：将酵母活化液按0.06%接种量接种到杀菌后的蓝莓和酸樱桃复合汁中，搅拌均匀后，在22 ℃条件下发酵13 d，每隔24 h检测一次发酵液的糖度，当糖度降至6%以下时，停止发酵，此时复合果酒酒精度达到（13.4±0.11）%vol。
醋酸菌活化：在斜面培养基上接入醋酸菌，于30 ℃培养72 h。利用接种环从斜面长出的醋酸菌中取1环接入100 mL、灭菌后的5%vol蓝莓-酸樱桃复合果酒中，于30 ℃、120 r/min恒温振荡培养30 h[27]，连续扩培2次，至瓶内有菌膜产生，培养基变浑浊，达到醋酸菌对数生长期即可。
醋酸发酵：将发酵好的蓝莓-酸樱桃复合果酒在68 ℃保持30 min，以除去酒液中的酵母菌。待温度降至室温后，将酒精度调整至9%vol，并按10%的接种量接入活化后的醋酸菌，用医用纱布封口并置于恒温振荡培养箱发酵，温度控制在30 ℃，转速120 r/min[27]，待发酵至第8天总酸不再上升时停止发酵，此时复合果醋的总酸含量可达（5.01±0.17）g/100 mL。
过滤、澄清：用2%壳聚糖溶液澄清复合果醋液。将澄清后的复合果醋液密封放在避光阴凉的地方陈酿1个月。用200目滤布过滤，得到蓝莓-酸樱桃复合果醋成品[28]。
1.3.2 蓝莓-酸樱桃复合果醋醋酸发酵工艺优化
（1）单因素试验[30-31]
以总酸含量、花青素含量和感官评分为评定指标，分别考察醋酸菌接种量（4%、6%、8%、10%、12%），酒精度（5%vol、7%vol、9%vol、11%vol、13%vol），发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）和发酵时间（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d）对蓝莓-酸樱桃复合果醋品质的影响。
（2）响应面试验
在单因素的基础上，固定醋酸菌接种量为10%，以酒精度（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）为试验因素，以总酸含量（Y）为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken试验设计，优化蓝莓-酸樱桃复合果醋醋酸发酵工艺条件，Box-Behnken试验因素与水平见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design
1.3.3 分析检测
总酸的测定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的电位滴定法[32]；酒精度的测定：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法[32]；花青素含量的测定：采用pH示差法[33]。
1.3.4 感官评价
参照GB/T 30884—2014《苹果醋饮料》中感官评分要求[34]，结合蓝莓-酸樱桃复合果醋的特点设定感官评分标准，见表2。
表2 蓝莓-酸樱桃复合果醋的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of blueberry and sour cherry compound fruit vinegar
依据评分标准，请8位专业人员从色泽、气味、口感和状态四个方面对复合果醋进行感官评价，满分为100分，取平均值作为最终结果。
1.3.5 抗氧化性试验
（1）DPPH自由基清除率的测定[35]
将蓝莓-酸樱桃复合果醋分别稀释0、1、3、5、7倍，各取1 mL，加入2 mL的0.2 mol/L DPPH，混匀后于20 ℃条件下反应30 min，然后在波长517 nm处测其吸光度值，以稀释相同倍数的市售苹果醋和VC溶液（100 mg/L）为阳性对照，计算DPPH自由基清除率，其计算公式如下：
（2）还原力的测定[36]
将蓝莓-酸樱桃复合果醋分别稀释0（原液）、1、3、5、7倍，各取1 mL于比色管中，依次加入0.2 mol/L磷酸缓冲溶液2.5 mL和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，于50 ℃水浴中保温20 min后迅速冷却，然后加入10%三氯乙酸溶液2.5mL，以4000r/min离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入蒸馏水2.5 mL、0.1%三氯化铁溶液0.5 mL，振荡摇匀，静置10 min后在波长700 nm处测其吸光度值（OD700nm值）。以稀释相同倍数的市售苹果醋和VC溶液（100 mg/L）为阳性对照。采用普鲁士蓝法测定还原性时，吸光度值越大，表示待测物的还原力越强。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果
2.1.1 醋酸菌接种量的确定
接种量对复合果醋品质的影响见表3。由表3可知，随着醋酸菌接种量在4～12%范围内的增加，复合果醋的总酸含量逐渐增大。当接种量在4～10%范围内的增加，花青素含量逐渐增加，并当接种量为10%时，达到最高值，为（97.83±0.49）mg/100 mL，继续增加接种量，花青素含量下降。其原因可能是随着复合果醋酸度的增加，其所含花青素的含量逐渐增大，但由于醋酸菌的过度繁殖消耗了体系中的花青素，导致含量下降。当接种量在4～10%范围内的增加，感官评分逐渐增加；当接种量为10%时，感官评分值最高，为（71.00±0.42）分；继续增加接种量，感官评分下降。因此，确定适宜的醋酸菌接种量为10%。
表3 醋酸菌接种量对复合果醋品质的影响
Table 3 Effect of acetic acid bacteria inoculum on the quality of compound fruit vinegar
2.1.2 酒精度的确定
酒精度对复合果醋品质的影响见表4。由表4可知，当酒精度在5%vol～9%vol范围内时，总酸含量逐渐增加；当酒精度为9%vol时，总酸达到最大值，为（4.35±0.19）g/100 mL；随着酒精度继续增加，总酸含量下降。当酒精度在5～13%vol范围内时，花青素含量逐渐增加。酒精度在5～9%vol范围内时，感官评分逐渐增加；当酒精度为9%vol时，感官评分达到最大值，为（76.00±0.39）分；当酒精度＞9%vol，感官评分有所下降。因此，确定适宜的酒精度为9%vol。
表4 酒精度对复合果醋品质的影响
Table 4 Effect of alcohol content on the quality of compound fruit vinegar
2.1.3 发酵温度的确定
发酵温度对复合果醋品质的影响见表5。由表5可知，随着发酵温度在26～30 ℃范围内的增加，总酸含量逐渐升高；当发酵温度为30 ℃时，总酸含量达到最大值（4.51±0.21）g/100 mL；继续增加发酵温度，总酸含量下降，其原因是由于醋酸菌提前进入老化阶段，产酸能力下降。当发酵温度在26～34 ℃范围内的增加，花青素含量逐渐下降。随着发酵温度在26～30 ℃范围内的增加，感官评分逐渐增加；当发酵温度为28 ℃、30 ℃时，感官评分值最高，为（78.00±0.46）分、（78.00±0.47）分，之后再继续升高发酵温度，感官评分下降，其原因是由于高温发酵的蓝莓-酸樱桃复合果醋颜色偏暗，口感较差，感官品质下降。因此，确定适宜的发酵温度为30 ℃。
表5 发酵温度对复合果醋品质的影响
Table 5 Effect of fermentation temperature on the quality of compound fruit vinegar
2.1.4 发酵时间的确定
发酵时间对复合果醋品质的影响见表6。由表6可知，随着发酵时间在3～9 d范围内的增加，总酸含量逐渐增加；当发酵时间为9 d时，总酸含量达到最高值，为（4.84±0.21）g/100 mL；继续增加发酵时间，总酸含量逐渐下降。当发酵时间为3～11 d时，花青素含量逐渐下降，其原因是由于花青素不稳定易分解，发酵时间越长，其分解越多，所得蓝莓-酸樱桃复合果醋中的花青素含量就越少。当发酵时间为3～7 d时，感官评分逐渐增加；当发酵时间为7 d时，感官评分最高，为（79.00±0.41）分；继续增加发酵时间，感官评分逐渐下降，其原因主要是由于发酵时间越长，蓝莓-酸樱桃复合果醋的果香味越淡，发酵11 d的蓝莓-酸樱桃复合果醋甚至还有些微苦味，风味变差。因此，确定适宜的发酵时间为7 d。
表6 发酵时间对复合果醋品质的影响
Table 6 Effect of fermentation time on the quality of compound fruit vinegar
2.2 蓝莓-酸樱桃复合果醋发酵工艺优化响应面试验
2.2.1 响应面试验结果及方差分析
根据单因素试验结果，以总酸含量为响应值（Y），以酒精度（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，进行响应面试验优化，Box-Behnken试验设计及结果见表7，方差分析见表8。
表7 Box-Behnken试验设计及结果
Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments
表8 回归模型方差分析
Table 8 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
利用Design-Expert 8.0.6软件对表7的试验结果进行回归拟合，得到蓝莓-酸樱桃复合果醋的总酸含量（Y）对应酒精度（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）的二次多项回归方程为：
由表8可知，回归模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.755 0＞0.05），说明所建立的二次回归方程可以代替真实点对试验结果进行分析，误差较小[37]；回归模型的决定系数R2=0.993 4，调整决定系数R2adj=0.984 9，表明回归方程可信度高，拟合度好[38]。综上所述，响应面试验分析所得回归方程可用于优化蓝莓-酸樱桃复合果醋的发酵工艺条件。由F值可知，影响蓝莓-酸樱桃复合果醋总酸含量的主次因素顺序为酒精度（A）＞发酵温度（B）＞发酵时间（C）。由P值可知，一次项A、B，交互项AC、二次项A2、B2、C2对总酸含量影响极显著（P＜0.01），一次项C、交互项AB、BC对总酸含量对总酸含量影响显著（P＜0.05）。
2.2.2 响应面交互作用分析
酒精度（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）因素交互作用对总酸含量影响的响应曲面及等高线见图1。
由图1可知，各交互作用的试验点范围内都出现了极大值，说明三个工艺参数所选水平范围合理，能反映出对复合果酒总酸含量的影响趋势。酒精度（A）与发酵时间（C）交互作用的响应曲面陡峭，对复合果醋的总酸含量具有极显著的影响（P＜0.01）；发酵温度（B）与酒精度（A）交互作用的响应曲面较陡峭，对复合果醋的总酸含量具有显著的影响（P＜0.05）；发酵温度（B）与发酵时间（C）交互作用响应曲面较陡峭，对复合果醋的总酸含量具有显著的影响（P＜0.05），说明这两种交互作用对总酸的影响程度要小于前者。这与方差分析的结果一致。
图1 各因素交互作用对总酸含量影响的响应曲面及等高线
Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on total acid contents
通过响应面试验得出蓝莓-酸樱桃复合果醋的最佳醋酸发酵工艺条件为酒精度8.64%vol，发酵温度29.73 ℃，发酵时间7.24d，该条件下，总酸含量理论值为（4.99±0.00）g/100 mL。为方便实际操作，将优化醋酸发酵工艺条件修正为酒精度9%vol，发酵温度30 ℃，发酵时间8 d。按照修正后的醋酸发酵工艺条件进行3次平行验证试验，测得蓝莓-酸樱桃复合果醋的总酸含量平均实际值为（5.01±0.17）g/100 mL，与理论值相差不大，说明响应面所确定条件可作为优化后的发酵工艺条件。
2.3 蓝莓-酸樱桃复合果醋的品质指标
蓝莓-酸樱桃复合果醋感官评分为（87.00±0.42）分，成品为深红色，具有明显的果香和醋香，酸味柔和，口感清爽，澄清透明，无悬浮物和浑浊现象。产品总酸含量为（5.01±0.17）g/100 mL，花青素含量为（102.26±0.89）mg/100 mL。
2.4 蓝莓-酸樱桃复合果醋的抗氧化性
2.4.1 清除DPPH自由基能力
复合果醋对DPPH自由基清除率的影响见表9。由表9可知，蓝莓-酸樱桃复合果醋原液的DPPH·清除率可达到（94.1±0.22）%，高于质量浓度为100 mg/L VC溶液（81.2±0.35）%，远高于市售苹果醋（30.1±0.17）%。随着稀释倍数的增加，蓝莓-酸樱桃复合果醋对DPPH·的清除率迅速降低，当稀释7倍时，对DPPH清除率降至（25.3±0.15）%，略低于VC溶液，但仍高于市售苹果醋。
表9 复合果醋对DPPH自由基清除率的影响
Table 9 Effect of compound fruit vinegar on scavenging rate of DPPH radical
2.4.2 还原力
复合果醋对还原力的影响见表10。由表10可知，蓝莓-酸樱桃复合果醋原液的OD700nm值为（2.21±0.27），略高于质量浓度为100 mg/L的VC溶液（OD700nm值为（2.13±0.24）），说明蓝莓-酸樱桃复合果醋原液的还原能力要强于VC溶液。随着复合果醋稀释倍数的增加，吸光度值迅速降低，当稀释7倍时，其OD700nm值降至（0.47±0.13）。同一稀释倍数下，VC溶液的OD700nm值为（0.87±0.29），说明此时VC溶液的还原力要强于蓝莓-酸樱桃复合果醋，而市售苹果醋的OD700nm值远低于复合果醋和VC溶液，说明其还原性能是三者中最低的。
表10 复合果醋对还原力的影响
Table 10 Effect of compound fruit vinegar on reducing power
3 结论
本研究通过单因素试验和响应面试验，确定蓝莓-酸樱桃复合果醋的最佳醋酸发酵工艺条件为：醋酸菌接种量10%，发酵前的酒精度9%vol，发酵温度30 ℃，发酵时间8 d。此优化条件下，蓝莓-酸樱桃复合果醋的总酸为（5.01±0.17）g/100 mL，花青素含量为（102.26±0.89）mg/100 mL，感官评分为（87±0.42），成品呈深红色，具有明显的果香和醋香，无悬浮物和浑浊现象。抗氧化实验结果表明，蓝莓-酸樱桃复合果醋具有较强的清除DPPH·能力（94.1±0.22）%和还原能力（2.21±0.27）（OD700nm值），具有一定的抗氧化性。
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