豇豆（Vigna unguiculata（L.）Walp.）又叫长豆角、饭豆等，富含蛋白质、胡萝卜素、花青素等营养成分，口感佳，是我国南北方广泛栽培的大众化蔬菜之一[1-3]。嫩荚采收后因其生命活动并未停止而容易产生腐烂变质，要延长保鲜或保存期，必须采取相应的保鲜或加工手段，豇豆的加工方式主要包括腌制、脱水和制备饮料。以豇豆为原料经乳酸发酵制成的加工制品，具有多种营养和保健作用[4-5]。
传统腌制蔬菜一般是利用高含量（＞10%）食盐腌制，再经脱盐、脱水、调味等一系列工序制成[6]。但是高食盐含量带来了许多的负面影响：首先，长期食用高盐食品会增加心脏、肾脏的负担，易引起心脏病、高血压等心脑血管疾病，不利于人体的健康[7-9]；其次，传统发酵蔬菜生产过程中产生大量高盐含量的废水对环境造成很大的污染，治理难度很大；再次，大量的食盐添加也增加了发酵蔬菜的生产成本和生产周期，为本就利润不高的发酵蔬菜产业发展造成沉重的经济负担[10-11]。随着健康饮食要求的提高，腌菜应向低盐化、低糖化、小包装化、多元化的方向发展。国外近年来出现了被称之为“浅渍菜”的低盐浸渍菜，国内也开始了对低盐腌制菜加工工艺及腌制过程中化学成分变化规律的研究[12-15]。
为延长豇豆产业链，提高豇豆加工技术，开发低盐化发酵豇豆产品，本研究利用两株具有抗氧化和降解亚硝酸盐功能的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）作为复合发酵剂，研究不同的发酵条件对浅渍法发酵豇豆品质的影响，在此基础上，利用Box-Behnken中心组合试验对其发酵工艺进行优化，提高发酵豇豆的感官品质，为浅渍法发酵豇豆的工业化生产提供理论基础和技术指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
复合发酵剂（降解亚硝酸功能植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）SD-7：抗氧化功能副干酪乳杆菌（Lactobacillus plantarum）FM-LP-9=1∶1）∶菌体密度为5.02×108 CFU/mL，保藏于江苏省农业科学院农产品加工研究所食品生物工程研究室。
豇豆、花椒、辣椒、冰糖、蔗糖、泡菜盐：市售。MRS液体培养基和MRS固体培养基：青岛海博生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
UV-P5紫外分光光度计：上海美普达科技有限公司；雷磁ZD-2型自动点位滴定仪：上海精密科学仪器有限公司；SW-CJ-1C型双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；YS6060色差计：深圳市三恩时科技有限公司；TMWSTOUCH质构分析仪：美国Food Technology Corporation。
1.3 试验方法
1.3.1 浅渍发酵豇豆工艺流程及操作要点
豇豆挑选清洗→晾晒→浅渍液制备（泡菜盐、香辛料、辣椒等）→接种发酵→泡菜汁杀菌→杀菌冷却→成品
操作要点：
豇豆挑选、清洗与晾晒：挑选新鲜嫩脆的豇豆，用清水清洗干净，放置在带漏水孔的容器中进行晾晒，过程中翻动，晾晒至表面无水。
浅渍液制备：在1 L水加入45 g泡菜盐、2 g 花椒、30 g冰糖、30 g蔗糖，煮沸后保温10 min，降至室温（25 ℃）备用。降温后的浅渍液中加入0.15%的氯化钙作为保脆剂，加入0.05%的柠檬酸和0.03%的抗坏血酸钙作为护色剂。
接种发酵：按照浅渍液和豇豆的质量比为4∶3加入晾晒完毕的豇豆，使豇豆完全没入浅渍液中，按照浅渍液和豇豆总质量的百分比接种发酵剂，混匀。密封后放置在一定的温度条件下进行发酵。
泡菜汁杀菌：当pH达到3.5左右时[16]结束发酵，捞出豇豆、沥干，浅渍液用60目筛过滤除去残渣，加热至90～95 ℃，放入沥干的浅渍法发酵豇豆，30～60 s后捞出，尽可能保持泡制原味。
1.3.2 浅渍发酵豇豆工艺优化单因素试验
接种量对浅渍法发酵豇豆品质的影响：按照工艺流程，豇豆洗净晾晒后加入浅渍液中，分别接种3%、4%、5%、6%、7%的复合发酵剂，在25 ℃的条件下发酵，在发酵过程中每天取样，测定泡菜汁的pH值，当pH值达到3.5左右时结束发酵，记录发酵结束时间，测定豇豆的硬度、色值、咀嚼性和总酸含量并对产品进行感官评价。在此基础上，依次考察温度（19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃和37 ℃）、发酵时间（48 h、72 h、96 h、120 h、144 h和168 h）对浅渍法发酵豇豆品质的影响。
1.3.3 浅渍发酵豇豆工艺优化响应面试验
在单因素试验的基础上，选取接种量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）为3个因素，利用响应面优化试验设计Design-Expert.8.0.6软件Box-Behnken中心组合原理进行设计。以浅渍法发酵豇豆的硬度（Y1）和感官评分（Y2）为响应值进行3因素3水平的响应面优化试验，响应面试验因素与水平见表1。
表1 浅渍法发酵豇豆工艺优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment for process optimization of fermented cowpea by low-salt curing method
1.3.4 测定方法
总酸和pH值测定[17]：开始发酵后每天取5 mL的发酵水，用pH计直接测定其pH值。总酸的测定：参照GB 12456—2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中pH 计电位滴定法进行测定。
硬度和咀嚼性测定[18]：利用TMWS-TOUCH质构分析仪对浅渍法发酵豇豆进行硬度测试。
色度测定：参照文献[19]方法测定。
感官评价：选择对发酵蔬菜感兴趣且对浅渍法发酵豇豆味道有一定识别能力的食品专业研究生10人为感官评定小组成员。对参加评定的成员事先接受训练，明确评分标准。品尝样品后，温水漱口后再品尝下一个样本。每一个样本进行3次重复评定，取10人的平均分，满分为100分。感官评分标准见表2。
表2 浅渍法发酵豇豆感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented cowpea by low-salt curing method
1.3.5 数据统计分析
采用SPSS13.0软件进行统计分析数据间差异比较采用t 检验，差异显著水平为P＜0.05。
2 结果与分析
2.1 接种量对浅渍法发酵豇豆发酵进程及品质的影响
豇豆在发酵过程中，经过乳酸菌代谢作用，对豇豆的质构、风味和感官有影响。陈玲等[20]对3种豇豆品种发酵后的总酸、还原糖和感官品质进行研究，发现各指标之间均有差异，周情操[21]发现湖北地区9个豇豆品种经泡制后产品风味和质构也有较大不同。这些风味和质构的不同主要受不同品种蔬菜自身的差异之外，发酵过程中微生物的生长代谢情况也对其产生影响[22-23]。接种量对豇豆酸度、硬度、色泽和感官品质的影响结果见表3。由表3可知，随着接种量增加，总酸含量也增加，豇豆发酵周期缩短。但是，浅渍法发酵豇豆的色泽饱和度、硬度、咀嚼性和感官评分随接种量的增加呈现先升高后降低的趋势，在接种量为5%和6%时，豇豆的感官评分、咀嚼性均最高且没有显著差异（P＞0.05）；在接种量为5%时，硬度和色泽饱和度显著高于其他接种量（P＜0.05）。综合接种量对豇豆硬度和感官评分的影响，选择5%的接种量为宜。
表3 接种量对浅渍法发酵豇豆发酵进程及品质的影响
Table 3 Effect of inoculum on fermentation process and quality of fermented cowpea by low-salt curing method
注：不同处理间同列字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 发酵温度对浅渍法发酵豇豆发酵进程及品质的影响
PARK S E等[24]研究表明，温度对于微生物的生长和代谢都有着重要的影响，低温条件下微生物活性较低，代谢产物积累缓慢，产生的代谢产物也较为丰富，产品适口性较好，但发酵所需时间的较长，而发酵温度提高能增加微生物活性有效缩短发酵时间，而代谢产物的快速积累，会造成发酵风味单一，也容易造成有机酸积累量过高，导致pH降低，降低产品适口性。发酵温度对豇豆酸度、硬度、色泽和感官品质的影响结果见表4。由表4可知，随着发酵温度的升高，总酸含量增加，豇豆发酵周期缩短。但是，浅渍法发酵豇豆的色泽饱和度、硬度、咀嚼性和感官评分随着发酵温度的升高呈现先升高后降低的趋势。在发酵温度为25 ℃和28 ℃时，豇豆的色泽饱和度、咀嚼性、硬度和感官评分均最佳且没有显著差异（P＞0.05）；但从测定数值上看，25 ℃条件下各指标值更高一些。综合发酵温度对豇豆硬度和感官评分的影响，发酵温度以25 ℃为宜。
表4 发酵温度对浅渍法发酵豇豆发酵进程及品质的影响
Table 4 Effect of fermentation temperature on fermentation process and quality of fermented cowpea by low-salt curing method
2.3 发酵时间对浅渍法发酵豇豆发酵进程及品质的影响
随着发酵时间的延长，有机酸和代谢产物浓度及种类增多，对产品的品质产生不同影响[25-28]，同样有研究表明，在不同的发酵时间点，产品的色泽有着明显的差异，尤其是在发酵初期色泽的变化尤为明显[29]。本研究中发酵时间对豇豆酸度、硬度、色泽和感官品质的影响结果见表5。随着发酵时间的延长，总酸含量增加，发酵豇豆的色泽、饱和度、硬度和咀嚼性呈现下降趋势，在发酵时间为96 h和120 h时，色泽饱和度、硬度和咀嚼性之间没有显著差异（P＞0.05）。感官评分随着发酵时间的延长呈现先升高后降低的趋势。在发酵120 h时感官评分值最高。感官评分时包括色泽、质地、滋味多种指标，而硬度主要体现为质地变化。因此综合发酵时间对豇豆硬度和感官评分的影响，发酵时间以120 h为宜。
表5 发酵时间对浅渍法发酵豇豆发酵进程及品质的影响
Table 5 Effect of fermentation time on fermentation process and quality of fermented cowpea by low-salt curing method
2.4 浅渍法发酵豇豆发酵工艺优化响应面试验结果
利用软件对表6数据进行二次多元回归拟合，得到发酵豇豆硬度预测值（Y1）对A、B和C的二次多项回归方程：Y1=47.32-0.74A-2.72B-4.56C+0.50AB-0.58AC-0.30BC-5.25A2-4.27B2-3.98C2；得到发酵豇豆感官评分预测值（Y2）对A、B和C的二次多项回归方程Y2=90.07+3.31A+1.66B+5.45C+0.33AB-1.75AC-0.59BC-3.40A2-4.19B2-8.88C2。
表6 浅渍法发酵豇豆工艺优化响应面试验结果与分析
Table 6 Results and analysis of response surface test for process optimization of fermented cowpea by low-salt curing method
由表7可知，该模型的F值为134.04，P＜0.000 1，说明该模型极显著，且失拟项不显著（P＞0.05），说明方程具有良好的拟合性和实用性，试验误差较小。另外，该模型的决定系数R2=0.991 8，校正决定系数R2Adj=0.984 4，说明该模型能解释98.44%的浅渍法发酵豇豆硬度的变化。各因素对浅渍发酵豇豆硬度的变化的贡献大小顺序为发酵时间＞发酵温度＞接种量。由回归方差分析可知，发酵温度和发酵时间对浅渍发酵豇豆硬度的变化的影响有极显著的影响（P＜0.01）。接种量对浅渍法发酵豇豆硬度变化的影响有显著的影响（P＜0.05）。从以感官评分响应值的回归模型方差分析结果（表8）可知，该模型的F值为80.55，P＜0.000 1，说明该模型极显著（P＜0.01）；且失拟项不显著（P＞0.05），说明方程具有良好的拟合性和实用性，试验误差较小。另外，该模型的决定系数R2=0.986 4，校正决定系数R2Adj=0.974 1，说明该模型能解释97.41%的浅渍法发酵豇豆感官评分的变化。各因素对浅渍法发酵豇豆感官评分的变化的贡献大小顺序为发酵时间＞接种量＞发酵温度。由回归方差分析可知，接种量和发酵时间对浅渍法发酵豇豆感官评分的变化的影响有极显著的影响（P＜0.01）。发酵温度对浅渍法发酵豇豆感官评分的变化的影响有显著的影响（P＜0.05）。
表7 以硬度为响应值的回归模型方差分析
Table 7 Variance analysis of regression model with hardness as response value
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。下同。
表8 以感官评分为响应值的回归模型方差分析
Table 8 Variance analysis of regression model with sensory score as response value
用Design Expert 8.0.6软件做出两因子交互作用显著的响应面及其等高线，接种量和发酵温度的交互作用见图1。从图1可以看出，发酵时间从96 h增至144 h时，接种量从4%增至6%，发酵豇豆的感官评分呈现先增加后降低的趋势，曲面的定点为发酵豇豆感官评分的最大值。从等高线图中可以看出，发酵温度和接种量交互作用显著（P＜0.05）。
图1 接种量与发酵时间交互作用对浅渍法发酵豇豆感官评分影响的响应曲面与等高线
Fig.1 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between inoculum and fermentation time on sensory score of fermented cowpea by low-salt curing method
2.5 模型验证
由感官评分的模型可得最佳发酵条件的预测值为发酵温度25.12 ℃，接种量5.15%，发酵时间125 h，在此条件下发酵豇豆硬度理论值为47.3 N，感官评分的理论值为91.21分。为方便实际操作，修改发酵条件为发酵温度25 ℃，接种量5%，发酵时间125 h，为证实预测结果，在此条件下进行3次重复试验，得到的发酵豇豆硬度实际值47.31 N，感官评分实际值为90.98分，与预测值接近，说明该试验模型可操作性高。
3 结论
通过单因素试验及响应面试验获得豇豆浅渍发酵的最佳条件为发酵温度25 ℃，接种量5%，发酵时间125 h，在此条件下得到的浅渍法发酵豇豆的硬度为47.31 N，感官评分为90.98分，回归分析和验证试验都表明该试验模型的合理性和可行性，研究结果为浅渍法发酵豇豆提供技术支持和科学依据，在豇豆的发酵腌制生产过程中避免了高盐废水的大量产生。
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