目前，由于生活方式的改变，高血压患病率在世界范围内增长迅速，已经为各国敲响了警钟。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）是体内调节血压的重要内分泌系统，该调节系统中血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是调控血压平衡的核心，AngⅡ通常与血管紧张素1型受体（angiotensin type 1 receptor，AT1R）结合诱发血管收缩，进而导致升高血压[1-3]。当Ang II与AT1R结合时，除了血管收缩外，还会引起钠和水潴留，以及醛固酮（aldosterone）分泌，导致血管收缩、炎症和纤维化，最终使血管内皮功能失调[4]。动物实验和临床研究结果表明，高血压患者体内的肾素、血管紧张素1型受体、类固醇11β-羟化酶基因CYP11B1、醛固酮合成酶基因CYP11B2等的表达水平会显著升高，同时也会出现尿液中钠、钾离子水平的紊乱，如尿液中钾含量的减少和钠钾腺呤核苷三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）酶α1基因NKAα1表达水平的下降[5-6]。
高脂高盐饮食的摄入会增加AngⅡ的分泌，导致RAAS的激活，进而引起血管的收缩，导致血压的升高[7-10]。目前，高血压的治疗除使用肾素抑制剂，血管紧张素抑制剂，醛固酮抑制剂等药物外，国际高血压联盟倡导使用食物预防和调节血压。酱油（soy sauce）作为一种日常调味料，含盐量约为22%～24%，是人体盐摄入的重要来源之一[11-14]。有研究表明，韩国的传统发酵酱油虽然含有高的盐分，但可以有效改善大鼠血压的升高[15]；日本的发酵酱油可以通过改善血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的表达调节大鼠血压的升高[16]。本课题组前期研究的结果也显示，中国的传统发酵酱油可以有效的调节高脂高盐饮食诱导的RAAS系统的激活，进而改善大鼠血压的升高[17]。
目前，我国对酱油功效的评价研究主要为传统发酵酱油，对鲜味酱油的功能性研究鲜见报道。因此本研究以酿造鲜味酱油为原料，通过动物实验，考察其对RAAS系统相关生物参数指标的调节，揭示酿造鲜味酱油对血压的调节机理，为我国大豆发酵食品的功效性研究提供新的思路，也为调节和预防高血压提供合理参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
SD大鼠：吉林大学；普通饲料（脂肪含量10%）、高脂饲料（脂肪含量60%）：美国research diets公司；酿造鲜味酱油（食品级）：吉林市某大型超市；氯化钠（分析纯）：沈阳化学试剂厂；总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三脂（triglycerides，TG）测定试剂盒：美国Mybiosource公司；醛固酮、血管紧张素Ⅱ测定试剂盒：美国Enzo Life Sciences公司；核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）提取试剂盒、互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）逆转录试剂盒：日本Takara公司；SYBR green聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒：日本TOYOBO公司。
1.2 仪器与设备
BP-2000无痛血压分析仪：美国Visitech system公司；大鼠代谢笼：河北睿腾金属制品有限公司；LightCycler96实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-FQ-PCR）仪：瑞士Roche公司；柏精-BioDrop μLite+超微量核酸蛋白分析仪：英国BioDrop公司；MiniAmp Plus Thermal Cycler cDNA 转录仪、Thermal K3酶标仪：美国Thermal公司；Agilent 7900电感耦合等离子体质谱仪：美国Agilent公司。
1.3 方法
1.3.1 酱油样品的制备
采用莫尔法测定酱油中的盐度[18]，并用蒸馏水将酱油的盐度调整为8%，用于高脂和酱油饮食组[15]，同时配制8%浓度的盐水用于高脂和高盐饮食组。
1.3.2 动物实验
24只6周龄雄性SD大鼠（约180 g）在室内温度为（24±1）℃、相对湿度为（65±2）%的条件下适应性喂养一周。将SD大鼠随机分成3组，每组8只，分别为普通饮食（normal diet，ND）组、高脂和高盐饮食（high-fat and high-salt diet，HFHS）组、高脂和酱油饮食（high-fat and soy sauce diet，HFSS）组，其中ND组饲喂普通饲料并灌胃蒸馏水，HFHS组饲喂高脂饲料并灌胃盐水，HFSS组饲喂高脂饲料并灌胃酱油，灌胃量均为10 mL/kg，连续灌胃10周。动物实验均符合吉林农业科技学院动物保护伦理委员会要求（批准号：2021013）。
1.3.3 基础代谢参数的测定
每天记录一次食物摄入量，每周测量一次体质量。实验最后两周，将大鼠饲养于代谢笼中24 h，记录饮水量，收集尿液，并记录尿液排出量。
1.3.4 血压的测量
采用无痛尾套法[7]每两周测量一次血压，记录大鼠收缩压的变化情况。
1.3.5 钠、钾离子含量的测定
采用电感耦合等离子体质谱法[19]测定尿液中钠、钾离子的含量。
1.3.6 血液参数的测定
灌胃处理10周后，将SD大鼠麻醉取血，血液在3000r/min、4 ℃条件下离心10 min，分离血清，按照试剂盒说明书测定血清中总胆固醇、甘油三酯、血管紧张素Ⅱ和醛固酮的含量。
1.3.7 肾脏中相关基因的表达分析
解剖时，取大鼠肾脏，放入-80℃冰箱保存。使用Trizol试剂提取肾脏组织的总RNA，将RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，肌动蛋白（β-actin）为内参，利用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-FQ-PCR）[7]测定肾脏组织中血管紧张素1型受体、类固醇11β-羟化酶、醛固酮合成酶和钠钾ATP酶α1基因的表达情况，本研究所用引物[17]见表1。
表1 本研究所用引物
Table 1 Primers used in the study
1.3.8 统计学分析
实验所得数值均表示为“平均值±标准差”，采用SPSS 22.0统计分析软件进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2.1 SD大鼠基础代谢参数的变化
SD大鼠每天的食物和水摄入量、尿液排出量及灌胃期间体质量的变化见图1。由图1A～1C可知，所有处理组SD大鼠每天的食物摄入量和初始体质量无显著性差异（P＞0.05）。与ND组（432.00 g）相比，HFHS组（544.87 g）和HFSS组（514.37g）SD大鼠的最终体质量显著升高（P＜0.05），但HFSS组SD大鼠的最终体质量显著低于HFHS组（P＜0.05）。由图1D可知，HFHS组（28.37 mL/d）和HFSS组（29.50 mL/d）SD大鼠每天的水摄入量显著高于ND组（21.12 mL/d）（P＜0.05），但HFSS组和HFHS组之间无显著性差异（P＞0.05）；HFHS组（20.25 mL/d）和HFSS组（22.46 mL/d）SD大鼠每天的尿液排出量显著高于ND组（15.00 mL/d）（P＜0.05），且HFSS组SD大鼠的尿液排出量显著高于HFHS组（P＜0.05）。结果表明，同等盐度摄入，酱油可以改善大鼠的基础代谢参数。
图1 不同处理组SD大鼠基础代谢特征参数的测定结果
Fig.1 Determination results of basal metabolic characteristic parameters of SD rats in different treatment groups
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
2.2 SD大鼠血清中总胆固醇和甘油三酯的变化
血清中总胆固醇和甘油三酯水平的增加，会增加血管紧张素和醛固酮的分泌[17]。SD大鼠血清中总胆固醇及甘油三酯的含量见图2。
图2 不同处理组SD大鼠血清脂质参数的测定结果
Fig.2 Determination results of serum lipid parameters of SD rats in different treatment groups
由图2可知，HFHS组和HFSS组SD大鼠血清中的总胆固醇、甘油三酯含量分别为121.87mg/100mL、121.62mg/100mL和79.12 mg/100 mL、78.62 mg/100 mL，均显著高于ND组（55.25 mg/100 mL和76.75 mg/100 mL）（P＜0.05），且HFHS组显著高于HFSS组（P＜0.05）。结果表明，相同盐度的酱油摄入对大鼠血清中的总胆固醇和甘油三酯具有一定调节作用。
2.3 SD大鼠血压的变化
不同处理组SD大鼠的收缩压变化见图3。由图3可知，各处理组SD大鼠的初始收缩压无显著差异（P＞0.05），灌胃第2周开始，HFHS组SD大鼠血压升高趋势明显；灌胃第4～10周，HFHS组SD大鼠血压表现出持续升高的状态，HFHS组SD大鼠血压显著高于HFSS组和ND组（P＜0.05），而HFSS组SD大鼠血压与ND组无显著性差异（P＞0.05）。因此，摄入酿造鲜味酱油不会引起血压的升高。
图3 不同处理组SD大鼠收缩压的变化
Fig.3 Changes of systolic blood pressure of SD rats in different treatment groups
2.4 SD大鼠尿液中钠、钾离子的浓度
肾脏在调节钠、钾离子平衡和血流动力学方面起到至关重要的作用，体内钠离子浓度升高，钾离子浓度降低是增加高血压的患病风险的重要因素之一，有研究表明，增加饮食中钾的摄入，可以有效改善血压的升高[20-21]。不同处理组SD大鼠尿液中的钠、钾离子的质量浓度见图4。
图4 不同处理组SD大鼠尿液中钠离子和钾离子质量浓度的测定结果
Fig.4 Determination results of Na+and K+mass concentration in urine of SD rats in different treatment groups
由图4可知，HFHS组和HFSS组SD大鼠尿液中的钠离子质量浓度分别为7 708.50 mg/L、7 652.12 mg/L，无显著差异（P＞0.05），但均显著高于ND组（1 252.37 mg/L）（P＜0.05）。由图4亦可知，HFHS组SD大鼠尿液中的钾离子质量浓度为7 542.75 mg/L，显著低于ND组（11 479.25 mg/L）和HFSS组（10 853.50 mg/L）（P＜0.05），且ND组和HFSS组无显著差异（P＞0.05），说明相较于食盐，酿造鲜味酱油有助于缓解食盐引起的SD大鼠尿液中钾离子浓度的降低，在一定程度上改善了钠、钾离子平衡状态，减轻了肾脏代谢压力，对血压平衡的调节起到重要作用。
2.5 SD大鼠血清中血管紧张素Ⅱ和醛固酮的含量
血管紧张素与醛固酮含量的升高，会导致血管收缩和水钠潴留，引起血压上升[7]，SD大鼠血清中血管紧张素Ⅱ和醛固酮的含量见图5。由图5可知，与ND组（1 153.75 pg/mL、767.75pg/mL）相比，HFHS组（2 443.25 pg/mL、1 262.87pg/mL）和HFSS组（1 717.95 pg/mL、875.50 pg/mL）SD大鼠血清中的血管紧张素Ⅱ和醛固酮含量均升高，但HFSS组SD大鼠血清中的醛固酮含量升高不显著（P＞0.05），且HFSS组SD大鼠血清中的血管紧张素Ⅱ和醛固酮含量均显著低于HFHS组（P＜0.05）。结果表明，与盐水摄入相比，酱油的摄入可以减少高血压的发病风险。
图5 不同处理组SD大鼠血清中血管紧张素Ⅱ和醛固酮含量的测定结果
Fig.5 Determination results of serum angiotensin Ⅱand aldosterone contents in serum of SD rats in different treatment groups
2.6 SD大鼠肾脏中相关基因的表达水平
血管紧张素Ⅱ表达量增加，会刺激肾小球动脉血管平滑肌，导致血管的收缩[22-23]。血管紧张素1型受体表达量增加，会介导大部分血管紧张素Ⅱ的反应，如血管收缩和醛固酮水平的升高[24]。醛固酮主要作用于肾脏远端小管和集合管，影响钠的吸收和钾的排泄[25]。钠钾ATP酶α1是重要的钠泵，可以有效的驱动体内的各种运输过程，通过调节钠、钾离子的运输，保持机体的健康[26]。不同处理组SD大鼠肾脏组织中相关基因的表达水平见图6。
图6 不同处理组SD大鼠肾脏组织中相关基因表达水平的测定结果
Fig.6 Determination results of related gene expression levels in kidney tissues of SD rats in different treatment groups
由图6可知，HFHS组SD大鼠的血管紧张素I型受体、类固醇11β-羟化酶及醛固酮合成酶的相对信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）水平显著高于ND组和HFSS组（P＜0.05），且除类固醇11β-羟化酶外，ND组和HFSS组无显著差异（P＞0.05）；HFHS组SD大鼠的钠钾ATP酶α1相对mRNA水平显著低于ND组和HFSS组（P＜0.05），且ND组和HFSS组无显著差异（P＞0.05）。基因分析结果显示，酿造鲜味酱油可以有效改善血管紧张素I型受体、类固醇11β-羟化酶、醛固酮合成酶和钠钾ATP酶α1基因的表达，这或许是酱油可以有效控制血压的重要机制。
3 结论
将雄性SD大鼠随机分成普通饮食（ND）组、高脂和高盐饮食（HFHS）组、高脂和酱油饮食（HFSS）组，连续灌胃10周，各组SD大鼠食物摄入量无显著差异（P＞0.05）。与HFHS组相比，HFSS组SD大鼠水摄入量无显著差异（P＞0.05），体质量、血压显著下降（P＜0.05），但尿液排出量显著增加（P＜0.05）；血清中总胆固醇、甘油三酯、血管紧张素Ⅱ和醛固酮含量显著下降（P＜0.05），尿液中的钾离子显著增加（P＜0.05）；肾脏中血管紧张素1型受体、类固醇11β-羟化酶及醛固酮合成酶基因的表达水平显著下降（P＜0.05），钠钾ATP酶α1基因的表达水平显著增加（P＜0.05），说明酿造鲜味酱油中虽然含有高的盐分，但可通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统对血压进行调节，进而维持血压正常。
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