酱油是中国老百姓家庭中必备的调味品之一，含食盐、氨基酸、糖类、有机酸、色素及香料成分，其风味形成是有微生物参与且非常复杂的过程。微生物的协同作用使之发生一系列的生化反应，把原料中的不溶性高分子物质分解成低分子化合物，这些物质的相互结合形成了种类繁多的呈味物质。这些呈味物质主要是氨基酸[1-4]。酱油中这些游离氨基酸本身呈现一定的甜味或苦味，如脯氨酸和丙氨酸呈现甜味，异亮氨酸和亮氨酸呈现苦味等。酱油的风味并不单纯由谷氨酸提供，它是各种游离氨基酸共同作用的结果[5]。因此对酱油中游离氨基酸进行测定是十分必要的。
目前酱油中游离氨基酸的主要检测方法有红外光谱法[6]、分光光度计法[7]、毛细管电泳法[8]、电位法[9]、离子色谱法[10-11]、氨基酸分析仪法[12-15]、高效液相色谱法[5，16-20]、气相色谱-质谱联用法[21]、高效液相色谱-质谱联用法[22-23]。其中高效液相色谱-质谱联用法检测游离氨基酸无需衍生，前处理简单，具有高选择性和高精度，但仪器成本昂贵；高效液相色谱法得到最广泛运用，但前处理复杂，部分衍生产物稳定性较差；气相色谱-质谱联用法衍生条件苛刻，不同氨基酸衍生反应速度不同或衍生试剂不同；离子色谱法细菌干扰性强，基质影响大；红外光谱法、分光光度法及电位法重现性较差，氨基酸分析仪法所需样品衍生化时间短、衍生条件对检测结果精确度影响较小，而且具有样品的耐受性较高、所需的样品量较少的特点。由于衍生化试剂并没有直接注入到色谱柱内部，还能使色谱柱的使用寿命能够得到有效的延长[24]。
现阶段针对采用全自动氨基酸分析仪测定酱油中游离氨基酸不确定度的相关分析研究较少。为了真实反映检测酱油中游离氨基酸结果的准确性，减少分析过程中的误差，本研究参照CNAS—GL 006—2019《化学分析中不确定度的评估指南》[25]和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[26]等对全自动氨基酸分析仪测定酱油中游离氨基酸含量进行不确定度分析，以期发现可能影响测定结果的因素，为日常实验检测质量控制提供科学可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
无水乙醇（分析纯）：莱阳市康德化工有限公司；盐酸（优级纯）：西陇化工试剂有限公司；17种氨基酸标准溶液（GBW（E）10062，100 nmol/mL）：德国曼默博尔公司；缓冲液A、B、C、D、E、F，反应液R，清洗液W（锂盐体系）：德国曼默博尔公司；酱油（淮安本地某品牌酿造酱油）：市售。
1.2 仪器与设备
A300全自动氨基酸分析仪：德国曼默博尔公司；112900台式超速冷冻离心机：美国赛默飞世尔公司；Milli-Q超纯水仪：美国Millipore公司；MS105DM电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品前处理
用电子天平称取酱油2.00g于50mL离心管中，加入30mL无水乙醇，涡旋振荡2 min后定容至50 mL，置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min，4 ℃、12 000 r/min离心20 min。取1 mL上清液用0.02 mol/mL盐酸定容至10 mL，摇匀后过膜待测[27]。
1.3.2 仪器参数条件
阳离子交换树脂锂盐色谱柱；色谱柱工作温度40 ℃；流动相：缓冲液A、B、C、D、E、F，反应液R，清洗液W（锂盐体系）；衍生系统流速为0.1mL/min，缓冲系统流速为0.2mL/min；进样体积：20 μL；检测波长：440 nm（脯氨酸）、570 nm（其余氨基酸）。仪器为双流路，梯度洗脱条件见表1，梯度柱温程序见表2。
表1 梯度洗脱条件
Table 1 Conditions of gradient elution
表2 梯度柱温程序
Table 2 Program of gradient column temperature
Eluent Press数值为50～80 MPa，Reagent Press数值为5～12 MPa。以保留时间定性，单点外标法定量。试样中氨基酸的峰面积应在标准溶液相应峰面积的30%～200%。
1.3.3 建立数学模型
酱油中游离氨基酸测量不确定度数学模型见公式（1）：
式中：X为酱油中某种游离氨基酸的含量，g/100 g；c为测定液里某种游离氨基酸的浓度，nmol；M为该游离氨基酸的摩尔质量，g/mol；m为酱油的质量，mg；D为酱油的稀释倍数。
1.3.4 测定酱油中游离氨基酸的不确定度来源分析
通过对检测过程和数学模型的分析，影响测定酱油中游离氨基酸不确定度的来源有：酱油称量的不确定度、氨基酸标准溶液的不确定度、定容酱油的不确定度、酱油稀释的不确定度、全自动氨基酸分析仪的不确定度、氨基酸摩尔质量的不确定度、酱油重复性测量的不确定度。
2 结果与分析
2.1 不确定度分量的分析
2.1.1 酱油称量的不确定度
酱油的称量天平为MS105DM电子天平（精密度为0.000 01 g），根据淮安市计量测试中心出具的检定证书（编号：918066090），当称样量为0～5 g时，该天平的最大允许误差为±0.5e（e=0.1 mg/1 mg），取平均分布，酱油称量2 g时，其不确定度计算如表3所示。
表3 酱油称量的不确定度
Table 3 Uncertainty of soy sauce weighing
2.1.2 氨基酸标准溶液的不确定度
购买的氨基酸标准溶液的U=±0.02，标准不确定度u（std）=
=0.011 55，标准溶液的浓度是100 nmol/mL，相对标准不确定度
。
2.1.3 定容酱油的不确定度
由JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[28]可知，50 mL A级容量瓶的容量允差为±0.05 mL，根据三角分布，
，其引入的标准不确定度为：
=0.020 42 mL；实验室温度范围为（20±5）℃，无水甲醇的体积膨胀系数为7.5×10-4/℃，取温度变化均匀分布，
，则标准不确定度为：
=0.002 165 mL。因此，定容酱油引入的合成标准不确定度为：
=0.020 53 mL，酱油定容的相对标准不确定度为
=0.000 410 6。
2.1.4 酱油稀释的不确定度
在测定过程中，为了减小称量引入的误差，因此对酱油进行了二次稀释。二次稀释倍数为10倍。稀释时使用了1 mL A级单标线吸量管和10 mL A级容量瓶，由JJG 196—2006[28]可知，1 mL A级单标线吸量管容量允差为±0.007 mL，取均匀分布，k=
，则其引入的标准不确定度为
=0.004 042 mL；实验室温度范围为（20±5）℃，0.02 mol/mL盐酸溶液的体积膨胀系数为0.455×10-3/℃，取温度变化均匀分布，k=
，则标准不确定为：
=0.001 314 mL。1 mL A级单标线吸量管合成标准不确定度为u（V吸1）=
，相对标准不确定度为
。
10 mLA级容量瓶最大容量允差为±0.020 mL，取三角分布
，则其定容体积引入的标准不确定度为
=0.008 165 mL；实验室温度波动范围为（20±5）℃，温度变化引入的标准不确定同①中的0.001 314 mL。合成标准不确定度
=0.008 270 mL，相对标准不确定度为
=0.000 827 0。
因此，酱油稀释引入的相对标准不确定度为：urel（Vdil）=
。
2.1.5 全自动氨基酸分析仪的不确定度
江苏省计量科学研究院出具的校准证书（编号：C2020-3028896）中全自动氨基酸分析仪的相对标准不确定度为
。
2.1.6 氨基酸摩尔质量的不确定度
氨基酸分子的摩尔质量的不确定度可以通过合成各组成元素原子量的不确定度得到。对于每一个元素，标准不确定度可按矩形分布处理，即不确定度除以
。从原子量表（2009 IUPAC）[29]中查得元素的原子量和不确定度，计算元素的不确定度，结果见表4。
表4 元素的原子量及其不确定度
Table 4 Atomic mass of the element and its uncertainty
由表4可知，碳、氢、氧、氮、硫5种元素的标准不确定度分别为0.000 58、0.000 081、0.000 21、0.000 24、0.004 9，根据此结果可得到氨基酸分子的摩尔质量的不确定度，结果见表5。
表5 氨基酸摩尔质量的不确定度
Table 5 Uncertainty of amino acid molar mass
2.1.7 酱油重复性测量的不确定度
重复条件下对酱油进行6次平行试验，测量结果见表6。
表6 酱油中游离氨基酸的实验结果
Table 6 Experimental results of free amino acids in soy sauce
注：“ND*”表示未检出。
本实验中的酱油未检测出胱氨酸，故在后续不对胱氨酸进行不确定度分析。
将重复性测定的平均值
，标准偏差SRep结果分别代入公式，
，重复性测量的不确定度urel（Rep）如表7所示。
表7 重复性测量的不确定度
Table 7 Uncertainty of repeatability measurements
2.2 合成不确定度与扩展不确定度
由urel（
计算得出合成不确定度，如表8所示。
表8 全自动氨基酸分析仪测定酱油中游离氨基酸不确定度的合成不确定度
Table 8 Synthetic uncertainties of free amino acid uncertainty in soy sauce determined by automatic amino acid analyzer
由表8可知，仪器本身的相对标准不确定度（0.06）和酱油重复性测量的相对不确定度（0.029 49～0.139 5）对于合成不确定度的贡献较大，酱油稀释过程带入的相对不确定度0.004 330，贡献一般，称量、氨基酸标准溶液、定容、摩尔质量引入的相对不确定度在10-4～10-5，贡献相对较小。
酱油中游离氨基酸的标准不确定度为urel（C）×
，在95%置信概率下，取包含因子k=2，扩展不确定度为u×k，如表9所示。
表9 酱油中游离氨基酸的标准不确定度和扩展不确定度
Table 9 Standard and extended uncertainties of free amino acids in soy sauce
由表9可知，在包含因子k=2时，酱油中游离氨基酸的扩展不确定度范围为0.02 g/100 g～0.6 g/100 g。
3 结论
本研究对采用全自动氨基酸分析仪测定酱油中游离氨基酸的检测结果进行了评价，评估了实验过程中产生的不确定度组成，发现不确定度的主要来源为仪器本身的不确定度和酱油重复性测量的不确定度，其次是酱油稀释过程带入的不确定度，称量、氨基酸标准溶液、定容、摩尔质量引入的不确定度均较小。结果表明，在实验过程中，应保证仪器良好的工作状态，保证其较高的灵敏度，定期对仪器进行维护和保养，从而达到良好的重复性，这样结果的测量不确定度就可以减少，结果的准确性更高。
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