近年来，随着生活水平的逐渐提高，人们对食品的要求已从美味可口转向为改善人体健康。因此，食品中的一些生物活性成分，如多糖、多酚等因其突出的功能活性，如抗氧化、降血糖、抗肿瘤和增强免疫力的作用，使其成为食品研究的热点[1]。多糖在动植物和微生物中广泛存在[2]，是组成细胞膜和抗体的主要成分，在机体免疫系统中不可缺少，且多糖还具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性功能[3]，对人体健康有着至关的重要作用。王元军等[4]研发的糯米莲藕黄酒多糖含量达3.4 g/L，酒精度为15.8%vol，总酸含量为4.2 g/L。酒体金黄透亮，香味独特，口感清爽，具有突出的强胃健脾保健作用。李秀秀等[5]研究的发酵型石榴枸杞酒，多糖含量为1.15 g/L，多酚和黄酮含量都较高，经研究表明，多糖等活性成分对心血管疾病的防治具有一定的疗效[6]。汪涛等[7]研制的新型黄精黄酒营养丰富，具有独特的黄精香味，多糖含量高达5.01 g/L，显著高于传统黄精黄酒和传统黄酒，增强了其功能性。吉正梅等[8]研发出的狭果茶藨子果酒，多糖含量为4.36 g/L，酒体金黄透亮，有独特的狭果茶藨子香气，是一种有明显养生效果的饮品。
板栗（Castanea mollissima）有“干果之王”之称，果实中有碳水化合物、蛋白质、维生素E和类胡萝卜素等成分，但不含麸质和胆固醇，是一种健康食物。板栗中多糖含量丰富，是板栗的主要生物活性成分之一，具有抗氧化、清除自由基、抗凝血、抗疲劳等多种生物活性[9-10]。龙眼（Ferocactus viridescens）是一种药食同源的水果。龙眼果肉中含碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素和矿物质等营养成分，营养价值高，经常被人们作为保健品和滋补药品。龙眼中有多种生物活性成分如多糖、多酚等，其中多糖含量最为丰富，是龙眼抗氧化功能性主要来源[11-12]。
板栗和龙眼都属药食同源的农产品，二者因其独特的口感和丰富的营养深受人们喜爱。但是板栗和龙眼的鲜果都存在不易保存、原料资源易受季节限制、深加工产品较少的问题[13-14]。糖类是龙眼和板栗中的基本营养成分，且板栗和龙眼中多糖含量均较高，若将板栗和龙眼作为辅料引入黄酒发酵，不仅能开发其深加工产品，而且可以显著增加黄酒中的多糖含量，并改善其功能性。因此，本研究以板栗和龙眼为辅料，糯米为主料，以感官评分和多糖含量为评价指标，采用单因素结合正交试验优化板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺。并通过对比板栗糯米黄酒、传统黄酒的多糖含量，探讨板栗龙眼等辅料对黄酒中多糖含量的影响，以期为通过辅料调配开发高多糖含量黄酒奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
早丰板栗：河北唐山市；龙眼肉：河北全泰药业有限公司；糯米：市售；红曲：浙江丽水生物科技公司；小曲：湖南华伟铭化工科技有限公司；传统黄酒：市售；无水葡萄糖（分析纯）：上海源叶生物科技有限公司；浓硫酸（分析纯）：世纪科博科技发展有限公司；苯酚（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。
1.2 仪器与设备
HL-10D蒸饭柜：浙江宁波赵记电器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；FE20 pH指示计：上海仪电科学仪器股份有限公司；酒精计：河北省武强县同辉仪表厂；L530台式低速离心机：湖南湘仪仪器设备有限公司；UV2600A紫外可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 板栗龙眼糯米黄酒制备工艺流程及操作要点[15]
操作要点：
挑选原料：挑选无腐败、无霉变的龙眼肉和板栗，颗粒饱满、色泽清白透亮的糯米。
原料准备：将板栗脱壳、洗净、切碎；板栗洗净、切碎；糯米清洗后，在室温下用清水浸泡12 h。
蒸煮：固定原料（糯米、板栗、龙眼）的总质量为1 kg，其中板栗的添加量为30%、龙眼的添加量为3%，将原料放入蒸饭柜中蒸制50 min，要求糯米无粘连、无白心、软硬适中。
淋饭冷却：将蒸制好的原料摊放在无菌纱布上，用冷水淋至25～30 ℃。
活化曲种：将红曲和小曲分别在21～24 ℃的温水中浸泡1.5 h。
拌曲糖化、搭窝培菌：将处理好的糯米和龙眼、板栗与活化处理后的曲种按照小曲添加量0.8%，红曲添加量13%的比例进行搅拌，并将搅拌均匀的混合物放进砂罐中搭窝，用酒精擦拭砂罐内壁和罐盖，并用无菌纱布覆盖，进入糖化阶段。
冲缸、主发酵：在22 ℃的恒温条件下糖化4 d后，加入发酵前原料体积1.5倍的清水进行冲缸，进入主发酵阶段，21 ℃条件下发酵7 d，期间每6 h搅拌一次。
过滤：将主发酵完成后的板栗龙眼糯米黄酒用无菌纱布和脱脂棉进行粗滤，再用砂芯漏斗进行精滤。
灭菌、装瓶：将陈酿好的板栗龙眼糯米黄酒进行巴氏杀菌，冷却后装入经过高温杀菌的陶瓷瓶中。
陈酿：将酒放置在15～18 ℃的环境中进行陈酿，得到板栗龙眼糯米黄酒成品。
1.3.2 板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺优化单因素试验
以感官评分和多糖含量作为评价指标，采用单因素试验对板栗添加量（20%、25%、30%、35%、40%）、龙眼添加量（1%、2%、3%、4%、5%）、小曲添加量（0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%）、红曲添加量（9%、11%、13%、15%、17%）、主发酵温度（15 ℃、18 ℃、21 ℃、24 ℃、27 ℃）和主发酵时间（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d）进行优化，通过单因素试验筛选出影响显著的因素。
1.3.3 板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，固定主发酵温度为21 ℃，以板栗添加量（A）、龙眼添加量（B）、小曲添加量（C）及主发酵时间（D）为考察因素，以感官评分（Y1）和多糖含量（Y2）为评价指标，采用正交试验对板栗龙眼糯米黄酒的发酵工艺进行优化，正交试验因素与水平见表1。
表1 板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization of chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu
1.3.4 感官评价
选12名（6男，6女）食品专业人员为感官评定小组，对板栗龙眼糯米黄酒的色、香、味、体分别进行评分，总分100分，其感官评分标准见表2。
表2 板栗龙眼糯米黄酒感官评定标准
Table 2 Sensory evaluation standards of chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu
1.3.5 理化指标测定
总糖、总酸、pH、氨基酸态氮、酒精度的测定：均参照国家标准GB/T 13662—2018《黄酒》[16]中的方法；多糖含量的测定：采用苯酚-硫酸法[17]。
2 结果与分析
2.1 板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺优化单因素试验结果
2.1.1 板栗添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
板栗添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响见图1。由图1可知，当板栗添加量为20%～25%时，板栗龙眼糯米黄酒的感官评分和多糖含量呈逐渐上升的趋势；当板栗添加量为25%时，感官评分最高，为88.7分，多糖含量为6.22 g/L；当板栗添加量＞25%之后，感官评分呈下降趋势，多糖含量呈先增长后趋于稳定的趋势；当板栗添加量为35%时，多糖含量达到最高，为6.41 g/L。分析原因可能是当板栗添加量＜25%时，板栗龙眼糯米黄酒中的板栗风味不足，口感层次丰富度低，导致感官评分偏低。随着板栗添加量的增加，由于板栗中的蛋白质含量高于谷物[18]，会导致发酵前的蛋白质含量偏高，在发酵过程中细菌会过度繁殖产酸，使板栗龙眼糯米黄酒出现酸涩的口感，同时酒体也会变得浑浊[19]，进而导致板栗龙眼糯米黄酒的感官评分急剧下降；板栗中多糖含量丰富[20]，过多的板栗使发酵前的糖含量偏高，发酵液渗透压增大，抑制了红曲和小曲的发酵[21]，导致酒中的多糖含量处于动态平衡。因此，综合考虑，确定板栗最佳添加量为25%。
图1 板栗添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
Fig.1 Effect of chestnut addition on chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu fermentation
2.1.2 龙眼添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
在龙眼酒中，龙眼的添加量决定了发酵剂对底物的利用率，明显影响酒的口感和香气，是酒发酵过程的一个重要的因素[22]。龙眼添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响见图2。由图2可知，随着龙眼添加量的增加，板栗龙眼糯米黄酒的感官评分和多糖含量都呈先升高后下降的趋势，当龙眼添加量为4%时，感官评分和多糖含量均最高，分别为87.5分、6.25 g/L。分析原因可能是由于随着龙眼添加量的增加，提高了小曲和红曲对底物的利用率，且龙眼中有丰富的糖分[23]，所以感官评分和多糖含量都有所增加，但龙眼添加量较高时，板栗龙眼糯米黄酒中的龙眼特征香气过于浓厚，损害了黄酒特有的风味，龙眼过多使得发酵前的糖度过高，发酵液渗透压增大，抑制了红曲和小曲的发酵[20]，导致感官评分和多糖含量下降。因此，确定龙眼的最佳添加量为4%。
图2 龙眼添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
Fig.2 Effect of longan addition on chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu fermentation
2.1.3 小曲添加量对板栗龙眼糯米黄酒的发酵的影响
小曲在糖化发酵和蛋白质分解时会生产大量的代谢产物和自溶物质，是黄酒独特风味的重要来源[24]。小曲添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响见图3。由图3可知，随着小曲添加量的增加，板栗龙眼糯米黄酒的感官评分和多糖含量都呈先升高后下降的趋势，当小曲添加量达到0.9%时，感官评分和多糖含量均最高，分别为86.3分、6.47 g/L。分析原因可能是由于当小曲添加量较少时，底物发酵不充分，使得感官评分和多糖含量偏低，但小曲添加量较高时，酒前期发酵过快，发酵过程提前终止，进而影响板栗龙眼糯米黄酒的口感和多糖含量，使感官评分和多糖含量降低。因此，确定小曲最佳添加量为0.9%。
图3 小曲添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
Fig.3 Effect of Xiaoqu addition on chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu fermentation
2.1.4 红曲添加量对板栗龙眼糯米黄酒的发酵的影响
在黄酒发酵时加入红曲，不仅可以赋予黄酒色泽，而且在发酵过程中产生的一些代谢物质还可以丰富酒的口感和香气[25]。红曲添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响见图4。由图4可知，随着红曲添加量的增加，感官评分和多糖含量都呈先升高后下降的趋势，当红曲添加量为13%时，感官评分和多糖含量均最高，分别为84.5分、6.31 g/L。分析原因可能是由于红曲添加量较少时，底物发酵不充分，酒体浑浊，板栗和龙眼中的糖不能溶出，导致酒的感官评分和多糖含量偏低，但红曲添加量较高时，酵母生长旺盛，底物发酵速度过快，使得酒体不协调，从而导致感官评分和多糖含量下降。因此，确定红曲最佳添加量为13%。
图4 红曲添加量对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
Fig.4 Effect of Hongqu addition on chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu fermentation
2.1.5 主发酵时间对板栗龙眼糯米黄酒的发酵的影响
主发酵时间对板栗糯米黄酒发酵的影响见图5。由图5可知，随着主发酵时间的增加，板栗龙眼糯米黄酒的感官评分和多糖含量都呈先升高后下降的趋势，当主发酵时间为7 d时，感官评分和多糖含量均最高，分别为85.6分、6.27 g/L。分析原因可能是由于随着主发酵时间的增加，底物发酵充分，板栗和龙眼中的多糖溶出，感官评分和多糖含量也随之增加，但主发酵时间过长时，营养物质过度消耗，不利于酵母菌的生长繁殖，代谢产生不良产物，使酒变得浑浊[8]，同时糖分在发酵过程中被大量利用，导致了感官评分和多糖含量的下降。因此，确定最佳主发酵时间为7 d。
图5 主发酵时间对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
Fig.5 Effect of main fermentation time on chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu fermentation
2.1.6 主发酵温度对板栗龙眼糯米黄酒的发酵的影响
合适的发酵温度将会有利于发酵剂中各种菌的生长和代谢，从而可以加速发酵过程，并产生乙醇和其他代谢产物，丰富黄酒中的风味物质[26]。主发酵温度对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响见图6。由图6可知，随着主发酵温度的升高，板栗龙眼糯米黄酒的感官评分和多糖含量都呈先升高后下降的趋势，当主发酵温度为21 ℃时，感官评分和多糖含量均最高，分别为85.2分、6.37 g/L。分析原因可能是由于随着主发酵温度的升高，酵母菌生长繁殖旺盛，底物充分发酵，感官评分和多糖含量都有所上升，但主发酵温度过高，酵母菌生长繁殖过快，消耗大量糖分，产酸过多[27]，感官评分和多糖含量也就随之下降。因此，确定最佳主发酵温度为21 ℃。
图6 主发酵温度对板栗龙眼糯米黄酒发酵的影响
Fig.6 Effect of main fermentation temperature on chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu fermentation
2.2 板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺优化正交试验结果及分析
由单因素试验可知，固定红曲添加量和主发酵温度，以板栗添加量（A）、龙眼添加量（B）、小曲添加量（C）和主发酵时间（D）为板栗龙眼糯米黄酒发酵过程中的4个影响显著的因素，以板栗龙眼糯米黄酒的感官评分（Y1）和多糖含量（Y2）为评价指标，采用正交试验对板栗龙眼糯米黄酒的发酵工艺进行优化，正交试验设计及结果见表3。
表3 板栗龙眼糯米黄酒发酵工艺优化正交试验设计及结果
Table 3 Design and results of orthogonal tests for fermentation process optimization of chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu
由表3可知，以感官评分（Y1）和多糖含量（Y2）为评价指标，影响板栗龙眼糯米黄酒发酵的因素主次顺序均为B＞A＞C＞D，即龙眼添加量＞板栗添加量＞小曲添加量＞主发酵时间。以感官评分为评价指标时，板栗龙眼糯米黄酒最优发酵工艺组合为A1B3C2D3；以多糖含量为评价指标时，板栗龙眼糯米黄酒最优发酵工艺组合为A1B3C3D3。对A1B3C2D3和A1B3C3D3两个最佳因素组合进行验证试验，比较两个组合的感官评分和多糖含量。结果表明，A1B3C2D3组合的感官评分为95.8分，多糖含量为7.93 g/L；A1B3C3D3组合的感官评分为94.2分，多糖含量为7.04 g/L。因此，确定板栗龙眼糯米黄酒的最佳发酵工艺组合为A1B3C2D3，即板栗添加量20%，龙眼添加量5%，小曲添加量0.9%，主发酵时间8 d。
2.3 板栗龙眼糯米黄酒的理化指标
板栗龙眼糯米黄酒的理化指标见表4。
表4 板栗龙眼糯米黄酒理化指标的测定结果
Table 4 Determination results of physical and chemical indexes of chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu
由表4可知，经过最佳酿造工艺条件酿造出的板栗龙眼糯米黄酒的酒精度为（13.2±0.26）%vol，pH为4.3±0.16，总糖含量为（33.2±0.31）g/L，总酸含量为（6.34±0.06）g/L，氨基酸态氮含量为（0.47±0.004）g/L，各指标均符合GB/T 13662—2018《黄酒》要求。
2.4 板栗龙眼糯米黄酒多糖含量的测定结果与分析
在黄酒发酵过程中，当酒精增长到一定含量时，就会抑制酵母菌的生长和代谢，从而减少对糖分的消耗，最终在黄酒中可残存部分多糖，酿造原料是黄酒中多糖的重要来源之一[28]。板栗龙眼糯米黄酒及传统黄酒中的多糖含量测定结果见图7。
图7 板栗龙眼糯米黄酒多糖含量的测定结果
Fig.7 Determination results of polysaccharides content in chestnut,longan and glutinous rice Huangjiu
“**”表示和传统黄酒相比，差异极显著（P＜0.01）。
由图7可知，板栗龙眼糯米黄酒的多糖含量为7.93 g/L，传统黄酒的多糖含量为4.75 g/L，板栗龙眼糯米黄酒的多糖含量极显著高于传统黄酒（P＜0.01），是其多糖含量的1.67倍。传统黄酒中的大部分多糖来源于糯米发酵后残存的糊精类物质[29]，板栗龙眼糯米黄酒中的大部分多糖来源于糯米和加入的酿造辅料板栗和龙眼发酵后残存的物质，多糖含量高主要是由于添加了酿造辅料板栗和龙眼，板栗和龙眼中多糖含量丰富[20，23]，在发酵过程中，多糖成分大部分被保留在酒中，使酒体中的多糖含量增加。因此将板栗和龙眼作为发酵辅料加入到黄酒中，不仅对黄酒的多糖含量有重要的调节作用，而且有可能利于改善黄酒的功能性。
3 结论
以糯米为主料，板栗、龙眼为辅料，小曲和红曲为发酵剂，感官评分和多糖含量为评价指标，采用单因素试验及正交试验确定板栗龙眼糯米黄酒的最佳发酵工艺为：板栗添加量20%，龙眼添加量5%，小曲添加量0.9%，红曲添加量13%，主发酵时间8 d，主发酵温度21 ℃。在此优化工艺条件下，酿造的板栗龙眼糯米黄酒的感官评分为95.8分，多糖含量为7.93 g/L，是传统黄酒多糖含量的1.67倍，各理化指标符合相关国家标准要求。板栗龙眼糯米黄酒口感绵密，有独特的板栗和龙眼香气，营养丰富，生物活性成分多糖含量显著高于传统黄酒，酿造辅料板栗和龙眼是板栗龙眼糯米黄酒中多糖的重要来源之一。板栗龙眼糯米黄酒的研发，为板栗和龙眼的深加工提供了新的方向，同时提出了板栗和龙眼作为酿造辅料和多糖来源纳入酒类发酵的新思路。
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