红枣是吕梁的特产之一，种植历史悠久[1]。红枣兼具药食功能[2]，富含人体所需的六大营养素[3]，对食疗保健、健脾益胃、延缓衰老等有很好的功效[4]。近年来，红枣因富含生物碱、类黄酮、酚、萜类等有益营养成分而受到消费者的欢迎和青睐[5]。研究发现，红枣中的三萜类化合物、环磷酸腺苷、黄酮类化合物、抗坏血酸和皂苷等多种生物活性成分在抑癌、抗过敏、降血压和保护肠胃等方面具有重要作用[6-7]。
核桃也是吕梁地区特产之一，具有很高的营养价值[8]。核桃中含有大量的营养成分，其中包括六大营养素中的蛋白质、维生素、脂肪和矿物质[9]，其中不饱和脂肪酸的含量达到86%[10]。核桃是我国传统的药食两用的佳品[11]，核桃仁在一定程度上可抑制肿瘤。核桃中富含的卵磷脂可以增强大脑功能，预防阿尔兹海默症的发生[12]。同时，核桃仁中还含有丰富的α-亚麻酸（α-linolenic acid），α-亚麻酸在体内可以部分转化为二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），在细胞受到自由基的氧化发生损害时发挥作用，是世界公认的抗衰老物质，也可以帮助大脑发育。随着技术的进步，核桃产品中出现了核桃粉、核桃乳、核桃油等附加价值较高的产品，其中核桃乳深受大众喜欢[13]。
酸奶既营养又健康，已成为世界上最受欢迎的乳制品[14]。酸奶中含有益生元和益生菌等成分，可以起到预防疾病和增强免疫系统的作用[15-16]，对于具有乳糖不耐症的特殊人群，饮用酸奶不会像饮用牛奶一样引起腹胀、腹泻或产气等现象[17]。同时还具有降低胆固醇、促进肠道蠕动、降血脂、提高免疫力等功效[18]。
本研究以红枣、核桃、鲜奶等为主料，在鲜奶中加入保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进行发酵，然后搅拌并加入核桃粉混匀，制成一款营养保健型酸奶。将红枣核桃酸奶和空白对照酸奶进行对比研究，通过测定不同贮藏期两种酸奶的理化指标，研究红枣核桃酸奶和空白对照酸奶在胃、肠液的模拟环境反应后对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS）自由基的清除能力，初步探究其在模拟人体消化道环境中的抗氧化特性。以期进一步探究红枣核桃酸奶的贮藏特性，提供货架期的基本数据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新鲜红枣、新鲜核桃、白砂糖、鲜牛奶：市售；保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）：均由吕梁学院生命科学系微生物实验室提供。对照酸奶：不添加红枣汁与核桃粉的同批鲜奶自制普通酸奶。
DPPH：济南鑫贝生物技术有限公司；ABTS：山东华宏生物工程公司；牛肉膏、蛋白胨、琼脂（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；硫酸镁（化学纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸锰（分析纯）：天津市致远化学药剂有限公司；柠檬酸铵、乙酸钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；磷酸氢二铵（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：无锡市亚泰联合化工有限公司；酚酞、吐温-80（均为分析纯）：天津市大茂化学试剂厂。
1.2 仪器与设备
FE20K pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司；SPX-250培养箱：跃进医疗器械有限公司；UV-1601分光光度计：瑞利分析仪器有限公司；SC-04离心机：中科中佳科学仪器有限公司；LDZX-50KBS蒸汽灭菌器：申安医疗器械厂；FA2104N分析天平：天津精密仪器有限公司；CM-5色差仪：柯尼卡美能达控股公司；KLG-9205A恒温鼓风干燥箱：齐欣科学仪器有限公司；GJ200-4粉碎机、LC-JLQ-1C菌落计数器、NDJ-1指针式黏度计、LC-CP200×150破碎机：上海力辰仪器科技有限公司；HERPUSI压榨机：九阳生活电器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 原料制备
核桃粉的制作[19]：选择优良的核桃仁，使用恒温（80 ℃）干燥箱烘烤180 min，烘干后核桃皮会变得比较脆，用手撕去外面的皮，这样脱皮处理后使用粉碎机进行粉碎，过80目筛，成品即为核桃粉，备用。红枣汁的制作[20]：选择优质的红枣，剔去其中有虫害、空心、有蛆的红枣，最终用水洗净。经浸泡、预煮、破碎、压榨等步骤提取红枣汁，然后进行过滤浓缩，成品即为红枣汁，备用。
1.3.2 菌种活化
将灭菌冷却处理后的牛奶，装入已灭菌试管中，接种3%保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌（1∶1）的冻干粉，将接种过的试管放置于42 ℃培养箱中，间隔一定时间并进行反复培养，直至符合生产发酵剂发酵4 h要求。
1.3.3 红枣核桃酸奶制作工艺流程与操作要点
原料乳、红枣汁与核桃粉混合搅拌→均质→加入白砂糖→杀菌→冷却→加入发酵剂→搅拌均匀→恒温培养→发酵→冷却后熟→红枣核桃酸奶
操作要点：
搅拌：将准备好的原料乳、红枣汁与核桃粉混合，按照不规则顺序搅拌3 min。
均质：在18 MPa的压力下对混合液进行均质处理，时间为1 min。均质处理后，加入7%的白砂糖搅拌均匀。
杀菌：将红枣核桃酸奶放置于90～95 ℃的加热温度下进行10 min的杀菌处理。
冷却：杀菌后静置，待其温度下降至20 ℃。
接种：混合液中在无菌条件下加入3%的发酵剂（保加利亚杆菌∶嗜热链球菌=1∶1）搅拌均匀。
发酵：放置于42 ℃恒温箱中发酵4～6 h，直至凝乳形成，冷却。
冷却后熟：待冷却至常温后将酸奶放入冰箱（4～6 ℃）中后熟24 h，即得红枣核桃酸奶成品。
1.3.4 菌落总数的测定
乳酸菌活菌总数采用GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》测定。将发酵乳梯度稀释后倒平板，37 ℃恒温培养72 h，菌落计数器计数。
1.3.5 理化指标检测
酸度：按GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》的方法测定。吸取10 g发酵乳放置于锥形瓶，使用20 mL蒸馏水进行稀释，加2～3滴0.5%酚酞试剂摇匀，以0.1 mol/L的氢氧化钠滴定至呈微红色，且1 min不褪色。滴定酸度=氢氧化钠消耗体积（mL）×10。pH：按GB 5009.237—2016《食品安全国家标准食品pH值的测定》的方法测定。黏度：采用NDJ-1指针式黏度计直接测定。
色差：使用色差仪测定酸奶样品的L*值、a*值和b*值。
持水力：取一定质量（W1）的酸奶于离心管；4 000 r/min离心12 min，弃上清液[21]，称剩余物质质量（W2）。持水力计算公式如下：
1.3.6 抗氧化性检测
（1）DPPH自由基清除率的测定
参照文献[22-23]并进行调整。分别吸取样品1 mL+0.1 mmol/L DPPH 5 mL于试管混合；吸取蒸馏水1 mL+0.1 mmol/L DPPH 5 mL混合；吸取样品1 mL+无水乙醇5 mL置于试管混合。以上混合液均用振荡器混匀，在20 ℃置于暗室反应30 min，4 000 r/min离心12 min，取上清液。使用分光光度计测量其吸光度值，波长为517 nm，做三组平行。计算DPPH自由基的清除能力，其计算公式如下：
式中：AS为样品吸光度值；AC为对照组吸光度值；Ab为空白组吸光度值。
（2）ABTS自由基清除率的测定
参考已有的研究方法[24-25]并稍做修改。配制7 mmol/L ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾，避光24 h，制成ABTS储备液。用磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L，pH=7.4）稀释，测量波长734 nm处的吸光度值。分别取样品0.5 mL+ABTS稀释液5 mL（样品组AS）于试管；取样品0.5 mL+PBS 5 mL（对照组AC）于试管；取蒸馏水0.5 mL+ABTS稀释液5 mL（空白组Ab）置于试管。混匀后，置于暗室20 ℃静置反应10 min，4 000 r/min离心12 min，取上清液，在波长734 nm处测量吸光度值。计算ABTS自由基的清除能力，其计算公式如下：
式中：AS为样品吸光度值；AC为对照组吸光度值；Ab为空白组吸光度值。
1.3.7 制备模拟胃肠液
根据已有的研究并稍作修改制备模拟胃肠液[26-27]。模拟胃液：量取稀盐酸8.2 mL、蒸馏水350 mL、胃蛋白酶5 g，混匀定容至500 mL备用。模拟肠液：用250 mL的水溶解3.4 g磷酸二氢钾，使用0.1 mol/L NaOH溶液调节pH至6.8；以适量水溶解5 g蛋白酶。将两液混匀定容于500 mL容量瓶。
1.3.8 体外胃肠液消化模拟试验
胃液环境模拟反应：取一份待测酸奶与两份蒸馏水混合均匀，混合均匀后的溶液为样品溶液，同时测定该样品溶液的活菌数和抗氧化能力。取一份样品溶液与一份模拟胃液混合均匀，在37 ℃环境下进行2 h水浴振荡反应后，置于冰水中结束反应，4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定活菌数和抗氧化能力。
肠液环境模拟反应：将胃液模拟反应完后的样品取出，再与取一份模拟肠液与一份胃液模拟反应完后的样品混合均匀，并在37 ℃环境下进行2 h水浴振荡反应，4 000 r/min离心10 min，取上清液，测定活菌数和抗氧化能力。
1.3.9 数据处理
所有的基础数据都使用Microsoft Excel 2010处理，作图利用Graphpad Prism 8.0，显著性分析使用SPSS 26.0软件。
2 结果与分析
2.1 红枣核桃酸奶贮存期间活菌数变化
酸奶作为含有活菌的发酵乳品，其中的乳酸菌对人体健康有着特殊的作用，如果活菌数量不达标，则难以发挥其在人体内的功效[28]。红枣核桃酸奶及对照酸奶中的乳酸菌活菌数在4 ℃下贮藏21 d的变化情况见图1。
图1 两种酸奶贮藏期间活菌数的变化情况
Fig.1 Change of the viable count of two kinds of yogurts during storage
注：a、b、c、d小写字母不同表示组间差异显著（P＜0.05）；“*”表示组内差异显著（P＜0.05），“**”表示组内差异极显著（P＜0.01）。下同。
由图1可知，红枣核桃酸奶乳酸菌活菌数在1～7d时较高且无明显差异（P＞0.05），14 d、21 d时下降；对照酸奶随着贮藏时间的延长，活菌数逐渐降低。在1 d时，红枣核桃酸奶的活菌数显著高于对照酸奶（P＜0.05），分别为8.62 lg（CFU/g）、8.47 lg（CFU/g）。红枣核桃酸奶在储藏的21 d内，活菌数均高于对照酸奶，可能是由于红枣和核桃中的成分对乳酸菌起到了保护作用。不仅如此，在试验期间，红枣核桃酸奶的活菌数一直保持在7.95 lg（CFU/g）以上，超过国标规定的发酵乳货架期乳酸菌活菌数≥6.00 lg（CFU/g）的要求。
2.2 红枣核桃酸奶贮存期间酸度变化
红枣核桃酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d的pH、滴定酸度变化情况分别见图2、图3。
图2 两种酸奶贮藏期间pH的变化情况
Fig.2 Change of pH of two kinds of yogurts during storage
图3 两种酸奶贮藏期间滴定酸度的变化情况
Fig.3 Change of titrated acidity of two kinds of yogurts during storage
由图2可知，红枣核桃酸奶和对照酸奶随贮藏时间延长，pH值均有不同程度的降低。在1 d时，红枣核桃酸奶的pH为4.06，对照酸奶的pH为4.09，造成这种结果的原因是由于红枣和核桃中的成分对pH产生了影响。两种酸奶在贮藏14 d时，pH值出现了大幅下降。随着时间延长酸奶的pH不断下降，主要是酸奶中的发酵剂乳酸菌一直处于发酵状态，产生大量乳酸引起的。21 d时两者的pH无显著差异（P＞0.05），可能与乳酸菌发酵的阈值有关。
由图3可知，第1天时红枣核桃酸奶的滴定酸度为80.50 °T，显著高于对照酸奶的77.35 °T（P＜0.05）；7 d时对照酸奶的滴定酸度为98.60 °T，显著高于红枣核桃酸奶的92.40°T（P＜0.05），这是由于酸奶中含有的大量乳酸菌发酵产生乳酸引起的酸度变化，但红枣核桃中的成分也会引起酸度的变化。14 d和21 d时，由于乳酸引起的酸度的变化而使两种酸奶滴定酸度差异不显著（P＞0.05）。21 d时红枣核桃酸奶和对照酸奶滴定酸度均有所上升，这与乳酸菌发酵程度有关。
2.3 红枣核桃酸奶贮存期间持水力和黏度变化
红枣核桃酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d持水力、黏度的变化情况分别见图4、图5。
图4 两种酸奶贮藏期间持水力的变化情况
Fig.4 Change of water holding capacity of two kinds of yogurts during storage
图5 两种酸奶贮藏期间黏度的变化情况
Fig.5 Change of viscosity of two kinds of yogurts during storage
由图4可知，两种酸奶在储存期间的持水力都呈现下降趋势，可能是由于冷藏期间pH的变化以及凝胶结构的变化导致[29]。影响酸奶持水力的主要原因是酸奶中酪蛋白的含量；在整个实验的4次测定中，红枣核桃酸奶的持水力均显著低于对照酸奶（P＜0.05），原因可能是添加了红枣汁及核桃粉破坏了酸奶由酪蛋白颗粒构成的凝胶结构，降低了蛋白质分子之间的亲和力，导致蛋白质胶体结合水的含量有所减少[30]，造成酸奶的持水力降低。另外，酸奶的持水力还与总固形物浓度有关，由于加入的红枣汁含有大量水分，造成红枣核桃酸奶的总固形物浓度下降，使其持水力低于对照酸奶。
由图5可知，两种酸奶的黏度都在1～14 d内随着时间延长而降低，21 d均有所提高，但红枣核桃酸奶的黏度的变化趋势相对缓和，造成这种结果的原因是由于红枣核桃中含有多糖，使酸奶的质地变得比较黏稠，产生了拉丝性的现象[31]；同时由于酸奶中蛋白质发生絮凝，把牛奶中的水分包裹起来，使得酸奶的阻力增大，从而导致体系的黏度较大。1 d时，红枣核桃酸奶的黏度为1 900 mPa·s，显著低于对照酸奶的2 248 mPa·s（P＜0.05）。对照酸奶在第7天的黏度迅速下降为1 322 mPa·s，7 d、14 d、21 d时红枣核桃酸奶的黏度均显著高于对照酸奶（P＜0.05）。黏度能够体现酸奶内部分子间作用力的强度，酸奶中的各种成分相互作用，从而提高了酸奶的黏度；但随着时间的推移，酸奶中的营养成分流失，从而黏度降低；而红枣核桃酸奶中由于添加了红枣、核桃，使酸奶内部分子间作用力更强，其黏度为1 725 mPa·s，相对于对照酸奶黏度1 300 mPa·s大，因此红枣核桃酸奶的黏度明显优于对照酸奶。
2.4 红枣核桃酸奶贮存期间的色差对比
红枣核桃酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d的颜色变化情况见表1。L*值为明亮度表示黑白，数值越大越白；a*值的正值为红，负值为绿，0为中性；b*值的正值为黄，负值为蓝，0为中性；ΔE*数值越大，表明色差明显。
由表1可知，在贮藏期间，两种酸奶的L*值都呈现上升的趋势；红枣核桃酸奶的a*值在1～7 d下降，14～21 d保持相对稳定，对照酸奶的a*值在1～14 d下降，14 d与21 d的a*值相同。贮藏期间，红枣核桃酸奶的b*值总体上升，但在14 d时有所下降，对照酸奶的b*值平稳上升。1 d时对照酸奶的L*值为72.20，显著高于红枣核桃酸奶的68.47（P＜0.05），表明其颜色相对偏白，可能是红枣中色素的存在以及核桃氧化变色导致的这一差异。进一步计算出1～7 d，7～14 d，14～21 d时红枣核桃酸奶的总色差ΔE*分别为11.38、1.34、6.89，对照酸奶分别为0.08、3.78、0.57；红枣核桃酸奶的颜色变化较为明显。原因可能是一方面是因为红枣中含有天然的枣红色素，所以添加红枣汁后酸奶的色泽加深；另一方面是因为红枣中含有大量的还原糖，还原糖与蛋白质经过加热发生了非酶棕色化反应，导致红枣核桃酸奶的颜色变化，色差值明显高于对照酸奶[32]。
表1 两种酸奶在贮藏期间颜色指标的变化情况
Table 1 Change of color indexes of the two kinds of yoghurts during storage
注：在P＜0.05水平，大写字母不同表示同一贮藏时间下两种酸奶具有显著性，小写字母不同表示同一样品不同贮藏时期具有显著性。
2.5 红枣核桃酸奶贮存期间及胃、肠液模拟后抗氧化活性变化
DPPH、ABTS自由基清除率一定程度上反映了酸奶抗氧化的能力，红枣核桃酸奶及对照酸奶在4 ℃下贮藏21 d的清除率分别见表2、表3。
由表2和表3可知，在冷藏过程中，随着贮藏时间的延长，两种酸奶的DPPH自由基的清除率先下降后保持稳定，而ABTS自由基清除率在前14 d呈现略微上升的趋势，21 d时有所下降。总体上看，未经过胃肠液处理的情况下，红枣核桃酸奶在贮藏过程中对两种自由基清除率均显著高于对照酸奶（P＜0.05）。这是由于红枣中的酚类物质、维生素C等抗氧化成分发挥了作用，以及酸奶中乳酸菌的活菌数较高，可以使自由基清除率升高，是由于乳酸菌发酵能够生成含有传递质子能力的化合物。另外，核桃中的蛋白质水解得到的产物具有抗氧化性，使自由基清除率升高[32]。
表2 不同处理对DPPH自由基清除率的影响
Table 2 Effect of different treatments on DPPH free radical scavenging rate%
注：大写字母为两种酸奶及其胃肠液模拟反应后清除率差异显著（P＜0.05），小写字母为不同贮藏时期的清除率差异显著（P＜0.05）。下同。
表3 不同处理对ABTS自由基清除率的影响
Table 3 Effect of different treatments on ABTS free radical scavenging rate%
进一步分析可知，经过胃液模拟反应后，红枣核桃酸奶的DPPH自由基清除率由73.56%下降到63.73%，ABTS自由基清除率由79.51%下降到63.01%；经过胃肠液模拟反应后，红枣核桃酸奶的ABTS自由基清除率由74.66%下降到61.44%。由此可知经过胃液模拟反应和和肠液模拟反应后，都会导致两种酸奶的DPPH和ABTS自由基清除能力下降，但下降程度有所不同。这可能是由于酸奶中的一些抗氧化物质在胃肠液环境下发生反应被分解。不仅如此，在1 d时，红枣核桃酸奶经过胃液和胃肠液模拟反应后的ABTS自由基清除率，和未反应的普通酸奶的清除率差异显著（P＜0.05）；在7 d、21 d时，红枣核桃酸奶经过胃肠液模拟反应后的ABTS自由基清除率，和未反应的普通酸奶的清除率差异显著（P＜0.05）；在14 d时，红枣核桃酸奶经过胃液和胃肠液模拟反应后的ABTS自由基清除率，和未反应的普通酸奶的清除率差异显著（P＜0.05）。
在红枣中含有多种抗氧化物质（如黄酮、多酚等），可以有效增强酸奶的抗氧化能力，核桃中的多酚可抑制低密度脂蛋白的氧化活性，并且酸奶中的乳酸菌发酵也会产生抗氧化物质，从而促使抗氧化能力提高，这些均能体现红枣核桃酸奶在模拟人体消化实验中抗氧化能力的优势。
3 结论
在低温贮藏期间，红枣核桃酸奶相比于对照酸奶的乳酸菌活菌数更高，pH低，黏度变化趋势更稳定，但是红枣核桃酸奶在保水性方面低于对照酸奶。此外，在不同贮藏期和胃、肠液模拟环境下，红枣核桃酸奶的DPPH、ABTS自由基清除率均显著高于对照酸奶。随着贮藏时间的延长，两种酸奶的自由基清除率都有所下降。总之，该研究证实了红枣核桃酸奶在人体消化道内具有抗氧化作用。
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