贵州仁怀为酱香型白酒的主要产地，其特殊的生态环境和独特的酿造工艺，造就了贵州白酒的独特酱香优势[1]。鲜丢糟含有60%左右的水分，13.3%的粗蛋白，7%左右的粗淀粉和粗纤维，2%～3%的粗脂肪和灰分，含有大量的营养物质，湿度大，易腐败且不易保存[2]。其一般作为原料发酵产甲烷、乙醇等有机溶剂，产饲料蛋白、化工原料（如丁二酸、甘油、乳酸和植酸等），丢糟还可作为生产材料，如黄酒丢糟饼干[3]、纤维素、木塑复合材料、活性炭、水泥添加剂；发酵生产食醋、食用菌、乳酸链球菌素和有机肥等[4]。在烟草种植的土壤中使用丢糟，可以很大程度减少烟草病虫害的发生，改善烟草的生长状况，还能有效提高烟草的品质[5]。
研究表明，类黑精具有抗氧化[6]、降血糖、抗突变、抑菌、抗增殖、抗过敏、降血压、调节肠道菌群等作用，对食物的色泽和风味有重大贡献[7]。其对延长食物保质期也具有重要意义，有助于提高加工食品的色泽和风味，对健康有益[8]。在全国推行绿色可持续发展的理念下，通过从酱香型白酒丢糟中提取类黑精物质，减少丢糟的浪费，提高丢糟的利用率，在一定程度上可以推动白酒企业的全面发展，减少经济损失和对环境的污染，为企业发展创造新的效益点。
目前国内外研究主要对可可、蜂蜜[9]、面包[10]、老陈醋[11]、黑芝麻[12]、麦芽、黑参、黑啤酒[13]、咖啡[14]及豆豉等物质中的类黑精进行研究，类黑精作为多数食品加热和贮存过程中普遍存在的产物，其保健功能和生理活性引起各国学者的高度关注[15]，对类黑精抗菌活性[16]、抗氧化活性[17]、抗癌活性和风味物质方面的研究成为热点[18-19]，类黑精的主要提取方法有乙醇溶液浸提法[20]、沉淀法[21]、大孔树脂吸附法[22]、水浸提法；还有超声辅助提取法[23]、超临界流体萃取[24]、高静水压萃取[25]、脉冲电场等非热加工技术。
本试验以酱香型白酒丢糟为研究对象，比较乙醇溶液浸提和超声辅助浸提两种方法对酱香型白酒丢糟中类黑精提取效率的影响，并采用单因素试验及正交试验优化丢糟中类黑精提取工艺。丢糟深加工利用的新方法，一方面减少了酒糟对环境的污染，另一方面提高了丢糟的综合利用价值，有助于酒企解决其发展中的瓶颈性问题，研究丢糟类黑精的提取和纯化工艺，对类黑精的生理活性和保健功能具有重要意义，可产生较大的经济和社会效应，为优化产业结构，加快经济发展，加快绿色发展具有积极的推动作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
酱香型白酒丢糟：贵州仁怀某酒厂提供。
类黑精对照品（纯度＞99%）：上海源叶生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；甘氨酸（分析纯）：上海市阿拉丁工业公司；乙醇（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；硫酸铁（分析纯）：天津市化工三厂有限公司；过氧化氢（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；水杨酸（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
LGJ-10真空冷冻干燥机：宁波新艺超声设备有限公司；RE-52AA旋转蒸发器、SHZ-III循环水式真空泵、FW-500A高速万能粉碎机：北京科伟永兴仪器有限公司；FA2204N电子天平：上海菁海仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：上海力辰邦西仪器科技有限公司；UV5100紫外分光光度计：上海元析仪器有限公司；TDL-80-2B低速离心机：上海安亭科学仪器厂；DS-040S型数控超声波清洗器：浙江东森电器有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器：常州润华电器有限公司；DGG-9240A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；DHC-L6006低温恒温槽：上海森信实验仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品的预处理
（1）丢糟干粉的制备
将新鲜酒糟放入恒温干燥箱中90 ℃干燥至质量恒定，经过粉碎后过80目筛，取酒糟干粉装入密封袋中备用。
（2）丢糟类黑精待测液的制备
称取丢糟干粉1.000 0 g于250 mL三角瓶中，加入20 mL无水乙醇，80 ℃恒温水浴循环浸提1.5 h，然后3 500 r/min离心15 min，将上清液收集，重复两次，用旋转蒸发仪旋蒸后定容于50 mL的容量瓶中，得丢糟类黑精待测液。
1.3.2 标准曲线的绘制
类黑精标准溶液的制备：参照郝日礼等[23-24]的研究方法制备类黑精对照品，精密称取1.000 0 g类黑精对照品，定容至100 mL容量瓶，作为类黑精标准溶液（10 mg/mL）。类黑精具有良好的溶解性[25]，可将甘氨酸和葡萄糖混合制作类黑精，通过加水溶解再冻干，烘烤形成的类黑精经过溶解进行过滤再冻干制得标准品。
类黑精含量的测定：采用紫外分光光度法。分别取体积为5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL梯度的类黑精标准溶液（10 mg/mL），分别加入蒸馏水定容至50 mL，测定波长420 nm处的吸光度值，重复3次，结果取平均值。以类黑精标准溶液质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制类黑精标准曲线。按照标准曲线回归方程y=0.165 2x+0.004 4（相关系数R2为0.998 9）。计算样品中类黑精含量。并对该检测方法进行方法学研究。
类黑精提取率计算公式如下：
式中：P为类黑精的提取率，%；C为类黑精质量浓度，mg/mL；V为样液的体积，mL；M为1.000 0 g丢糟完全提取类黑精含量，mg。
1.3.3 类黑精的羟基自由基（·OH）清除能力测定
采用水杨酸法。分别设置对照组（按顺序加入1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和2 mL的H2O）、反应组（各加入1 mL的待测液和水，加入1 mL 9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液，1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液）和未反应组，分别加入1 mL 8.8 mmol/L的H2O2于比色管中，在37 ℃水浴锅中水浴10 min，测定其波长510 nm条件下的吸光度值。·OH清除率计算公式如下：
式中：A为对照组吸光度值；A1为反应组吸光度值；A2为未反应组吸光度值。
1.3.4 类黑精提取工艺优化
分别采用单因素和正交试验优化类黑精乙醇溶剂提取和超声辅助-溶剂提取工艺。
乙醇溶剂提取法：称取丢糟干粉末1.000 0 g，于250 mL容量瓶中封口，以不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL））、不同提取时间（1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h、6.5 h）、不同提取温度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）的条件下进行提取。分别考察料液比、提取时间及提取温度对类黑精提取率的影响。在单因素试验基础上，将提取时间（A）、提取温度（B）、料液比（C）作为影响因素，以类黑精提取率为评价指标，进行3因素3水平正交试验，正交试验因素与水平见表1。
表1 乙醇溶剂法提取工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ethanol solvent extraction methods
超声辅助-溶剂浸提法：以不同乙醇体积分数（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、超声时间（15 min、30 min、45 min、60 min、75 min）、超声温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）、料液比（1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g∶mL））等因素作为变量进行试验，分别考察乙醇体积分数、超声时间、超声温度及料液比对类黑精提取率的影响。在单因素试验基础上，将乙醇体积分数（a）、料液比（b）、超声温度（c）、超声时间（d）作为影响因素，以类黑精提取率为评价指标，进行4因素3水平正交试验，正交试验因素与水平见表2。
表2 超声辅助-溶剂浸提法提取工艺优化正交试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ultrasonic assisted-solvent extraction methods
2 结果与分析
2.1 类黑精含量测定方法学考察
2.1.1 精密度试验
取质量浓度为2.0mg/mL的类黑精标准溶液进行精密度试验，在波长420 nm条件下连续测定吸光度值6次，计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），结果见表3。
表3 精密度试验结果
Table 3 Results of the precision tests
由表3可知，精密度试验结果RSD为1.0%＜5%，表明该检测方法精密度良好。
2.1.2 稳定性试验
取质量浓度为2.0 mg/mL类黑精标准溶液进行稳定性试验，在波长420 nm条件下，分别在0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h测定吸光度值，计算相对标准偏差（RSD），考察该方法稳定性，结果见表4。
由表4可知，稳定性试验结果的RSD为1.55%＜5%，表明该检测方法在5 h内稳定性良好。
表4 稳定性试验结果
Table 4 Results of the stability tests
2.1.3 重复性试验
取10.0 mL丢糟提取液，在波长420 nm条件下，测定吸光度值，测定6次并取平均值，计算相对标准偏差（RSD），考察该方法重复性，结果见表5。
表5 重复性试验结果
Table 5 Results of the reproducibility tests
由表5可知，稳定性试验结果的RSD为2.0%＜5%，表明该方法重复性良好。
2.1.4 加标回收率试验
取质量浓度为2 mg/mL丢糟类黑精样品100 mL，加标质量浓度0.2 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL，加标体积1 mL，加标回收率试验结果见表6。由表6可知，样品加标回收率在98%～101%之间，加标回收率试验结果RSD为1.53%＜5%，表明该方法准确度高。
表6 回收率试验结果
Table 6 Results of the recovery rate tests
2.2 溶剂浸提提取工艺的优化
2.2.1 料液比的确定
提取温度为35 ℃，提取时间4 h，乙醇体积分数为50%，在料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g∶mL）的条件下进行浸提，3 500 r/min离心15 min，取上清液，测其吸光度值，计算类黑精提取率，结果见图1。
图1 不同料液比对类黑精提取率的影响
Fig.1 Effect of different solid-liquid ratio on extraction rate of melanoidin
由图1可知，在料液比为1∶10～1∶20（g∶mL）时，类黑精提取率随之增加；在料液比为1∶20（g∶mL）时，丢糟类黑精提取率为42.5%；在料液比为1∶20～1:35（g∶mL）时，类黑精提取率变化不大。因此，最适料液比为1:20（g∶mL）。
2.2.2 提取时间的确定
在提取温度为35 ℃，提取时间分别为1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、5.5 h、6.5 h，乙醇体积分数为50%，在料液比为1∶20（g∶mL）的条件下进行浸提，3 500 r/min离心15 min，取上清液，测其吸光度值，计算类黑精提取率，结果见图2。
图2 不同提取时间对类黑精提取率的影响
Fig.2 Effect of different extraction time on extraction rate of melanoidin
由图2可知，在提取时间为1.5～3.5 h 时，类黑精提取率随之增加；提取时间为3.5 h时，类黑精提取率最大为47.5%；提取时间＞3.5 h之后，类黑精提取率趋于平缓。可能是由于类黑精提取出来后随着时间延长，类黑精分子又渗入丢糟溶液中。因此，最适提取时间为3.5 h。
2.2.3 提取温度的确定
在提取温度分别为20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，提取时间为3.5 h，乙醇体积分数为50%，在料液比为1∶20（g∶mL）的条件下进行浸提，3 500 r/min离心15 min，取上清液，测其吸光度值，计算类黑精提取率，结果见图3。
图3 不同提取温度对类黑精提取率的影响
Fig.3 Effect of different extraction temperature on extraction rate of melanoidin
由图3可知，提取温度为20～50 ℃时，丢糟中类黑精提取率随着温度上升而增高；提取温度为50 ℃时，类黑精提取率最大为48%；提取温度高于50 ℃之后，类黑精提取率有所下降。因此，最适提取温度为50 ℃。
2.2.4 正交试验
由表7可知，RC＞RA＞RB，说明料液比是影响类黑精提取的最大因素，其次是提取时间，提取温度的影响是最小的。最佳的提取工艺组合A3B3C3，即提取时间为4.0 h，提取温度为55 ℃，料液比为1∶25（g∶mL）。在此最佳提取工艺条件下，类黑精的提取率为51.25%。
表7 乙醇溶剂提取法提取工艺优化正交试验结果与分析
Table 7 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ethanol solvent extraction methods
2.3 超声辅助-溶剂提取工艺的优化
2.3.1 乙醇体积分数的确定
在料液比为1∶50（g∶mL），超声温度为60 ℃，浸提时间为30 min，超声波功率200 W，乙醇体积分数分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%条件下进行浸提，3500r/min离心15min，取上清液，测其吸光度值，计算类黑精提取率，结果见图4。
图4 不同乙醇体积分数对类黑精提取率的影响
Fig.4 Effect of different ethanol volume fraction on extraction rate of melanoidin
由图4可知，随着乙醇体积分数在20%～50%范围内增加，类黑精提取率随之增大；在乙醇体积分数为50%时，类黑精提取率最大，为25.15%；乙醇体积分数＞50%之后，类黑精提取率减小。因此，最佳乙醇体积分数为50%。
2.3.2 超声时间的确定
在料液比为1∶50（g∶mL），超声温度为60 ℃，超声时间分别为15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，超声波功率200 W，乙醇体积分数为50%条件下进行浸提，3 500 r/min离心15 min，取上清液，测其吸光度值，计算类黑精提取率，结果见图5。
图5 不同超声时间对类黑精提取率的影响
Fig.5 Effect of different ultrasound time on extraction rate of melanoidin
由图5可知，超声时间在15～30 min范围内逐渐递增，类黑精提取率随时间的增加而上升；超声时间＞30 min之后，提取率逐渐趋于稳定。因此，最佳超声时间为30 min。
2.3.3 不同料液比对提取率的影响
由图6可知，开始时提取率随料液比在1∶25～1∶35（g∶mL）时，类黑精提取率逐渐上升；在料液比为1∶35（g∶mL）时，类黑精提取率为45.21%；料液比为1∶35～1∶50（g∶mL）时，类黑精提取率逐渐趋于稳定。为了考虑成本，最佳料液比为1∶35（g∶mL）。
图6 不同料液比对类黑精提取率的影响
Fig.6 Effect of different solid-liquid ratio on extraction rate
2.3.4 超声温度的确定
在料液比为1∶35（g∶mL），超声温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，超声时间为30 min，超声波功率200 W，乙醇体积分数为50%条件下进行浸提，3 500 r/min离心15 min，取上清液，测其吸光度值，计算类黑精提取率，结果见图7。
图7 不同超声温度对类黑精提取率的影响
Fig.7 Effect of different ultrasonic temperature on extraction rate of melanoidin
由图7可知，超声温度为40～70 ℃时，类黑精提取率随之不断上升；在超声温度为70 ℃时，类黑精提取率达到最大，为55.23%；超声温度高于70 ℃之后，丢糟类黑精提取率有所降低。因此，最佳超声温度为70 ℃。
2.3.5 超声功率的确定
在料液比为1∶35（g∶mL），超声温度为70 ℃，超声时间为30 min，超声波功率分别为240 W、280 W、320 W、360 W、400 W，乙醇体积分数为50%条件下进行浸提，3 500 r/min离心15 min，取上清液，测其吸光度值，计算类黑精提取率，结果见图8。
图8 不同超声功率对类黑精提取率的影响
Fig.8 Effect of different ultrasonic power on extraction rate of melanoidin
由图8可知，丢糟类黑精提取率随超声功率升高而增加，在超声功率为320 W后，类黑精提取率增加缓慢，考虑成本，选择最佳超声功率为320 W。
2.3.6 正交试验
在单因素试验基础上，将乙醇体积分数（a）、料液比（b）、超声温度（c）、超声时间（d）作为影响因素，以类黑精提取率为评价指标，进行3因素3水平正交试验，正交试验因素与水平见表8。
表8 超声辅助-溶剂浸提法提取工艺优化正交试验结果与分析
Table 8 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction technology optimization of ultrasonic assisted-solvent extraction methods
由表8可知，Rb＞Ra＞Rc=Rd，说明料液比是影响类黑精提取的最大因素，其次是乙醇体积分数，超声温度，超声时间的影响是最小的。最佳的提取工艺组合a2b3c3d1，即乙醇体积分数50%，料液比1∶37（g∶mL），超声温度75 ℃，超声时间25 min。在此最佳提取工艺条件下，类黑精的提取率为72.37%。
3 结论
本研究通过超声辅助浸提和乙醇溶液浸提两种方法，提取酱香型白酒丢糟中的类黑精成分，通过紫外分光光度法测定所提取的类黑精的含量。结果表明，超声辅助溶液浸提法优于乙醇溶液浸提法，超声辅助溶液浸提类黑精的最佳提取工艺为超声时间25 min，超声温度75 ℃，料液比1∶37（g∶mL），乙醇体积分数50%，超声功率320 W。此优化条件下，酱香型白酒丢糟类黑精提取率为72.37%。
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