北冰红葡萄是目前国内外培育出的第一个酿造冰葡萄酒的山葡萄品种，是含山葡萄血缘的杂种后代[1]。具有较强的抗寒性和抗病性，产量稳定，果粒出汁高，是我国北方寒冷地区酿造优质冰红葡萄酒及干红葡萄酒的原料[2-3]。其中，通化酿酒葡萄产区的自然环境优良，所以北冰红葡萄也已经成为当地特色[4]。而且北冰红葡萄富含花青素、维生素C（vitamin C，VC）以及白黎芦醇等，酿造的葡萄酒色泽呈深宝石红色，具有浓郁的蜂蜜香气，醇厚宜人，有液体紫晶之称[5-8]。
北冰红山葡萄作为高档冰红葡萄酒原料，由其酿造的冰葡萄酒具有独特的风格，蜜香气与果香气馥郁宜人[9-11]。但北冰红山葡萄果实酸度高，酿制的果酒出现品质参差不齐等问题。南海龙等[12]研究北冰红冰葡萄酒的酿造工艺，表明北冰红山葡萄是酿造高品质冰酒的理想原料。佟晓芳[13]采用人工制冷冰冻的工艺，使葡萄汁中浓缩很高的糖、酸和风味成分，利用冰冻条件的优化，从而制成低成本高品质的冰酒。金宇宁等[14]对吉林通化不同产区的北冰红冰葡萄酒的理化指标、香气成分及感官特性进行了分析比较。但在目前的研究中缺乏通过优化北冰红冰葡萄酒发酵工艺在一定程度上改善冰葡萄酒酒质，丰富口感以及在不同发酵条件下对冰酒发酵性能的影响，而且单一的使用商业酵母进行冰酒发酵，会造成冰酒口味缺乏典型性，香气薄弱，很难表现出我国冰酒特色[15-16]。
本研究以北冰红冰葡萄为原料，利用实验室筛选得到的冰酒专用酵母为发酵菌种，酿造成感官特性优良的高品质冰酒，在单因素试验的基础上采用正交优化发酵工艺，旨在提高冰酒品质及产业的经济价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
北冰红冰葡萄：吉林省集安市上品酒庄；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：本实验室自行筛选、鉴定及保藏（菌落为圆形、白色、凸起，出芽生殖，耐酒精，高糖等抗性）；酒石酸：天津市天力化学试剂有限公司；无水碳酸钠：天津市凯通化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钠：天津市光复精细化工研究所；果胶酶（酶活10万U/g）：河南万邦化工科技有限公司。所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SPX-150II恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JBQ-ZD全温振荡器：常州普天仪器制造有限公司；DSX-280B手提式压力蒸汽灭菌器：上海申安仪器有限公司；ES200精密电子天平：天津市德安特传感技术有限公司；PHS-3C型pH计：上海雷磁-上海仪电科学仪器有限公司；SW-CJ-2G超净工作台：上海阳光实验仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 北冰红冰葡萄酒的酿造工艺及操作要点[17，18]
北冰红山葡萄→低温榨汁→澄清处理→接种酵母→低温发酵→发酵中止→澄清→过滤→杀菌→灌装→成品
操作要点：
低温榨汁：挑选无腐烂，无坏果的北冰红冰葡萄，在-8 ℃的冰冻状态下进行低温压榨。
果胶酶处理：按0.04 mg/L的果胶酶添加量加入果浆中，在38 ℃的培养基中酶解5 h，进行澄清。
酵母培养液：在100 mL已灭菌的冰葡萄汁液体培养基中，接入2～3环斜面保藏的酵母菌株，在30 ℃、180 r/min摇床培养48 h。
接种酵母：调整SO2（偏重亚硫酸钠）的添加量在60mg/L，静置2 h后，接种一定量的酵母培养液。
低温发酵：将处理后的冰葡萄汁装入发酵罐中，安上发酵栓。根据预试验结果，设置发酵温度16 ℃条件下发酵20 d。
过滤除菌：发酵完成后，使用0.22 μm的过滤芯进行除菌，得到冰葡萄酒样品。
1.3.2 冰酒发酵试验设计
首先以冰葡萄汁酵母接种量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵温度（10℃、13℃、16℃、20℃、25℃）、初始糖度（320g/L、340 g/L、360 g/L、380 g/L、400 g/L）、初始pH值（2.9、3.3、3.7、4.1、4.5）为影响因素。在单因素试验的基础上，以感官评分和酒精度为评价指标，选取酵母菌接种量（A）、发酵温度（B）、初始糖度（C）和初始pH值（D）为影响因素进行4因素3水平的正交试验，每组试验做3个重复，结果取平均值，正交试验因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation process optimization
1.3.3 检测方法
还原糖、总酸、酒精度：参照国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》进行测定[19]；pH：精密酸度计[20]。
1.3.4 感官评价
组织10名葡萄酒品评培训人员，参照国家标准GB 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]，从色泽、澄清度、果香、酒香、滋味、典型性对北冰红冰葡萄酒进行感官评分，满分100分。冰葡萄酒感官评价标准见表2。
表2 北冰红冰葡萄酒感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of Beibinghong ice wine
1.3.5 数据分析
使用Microsoft Excel 2010和正交试验设计助手V3.1进行数据统计分析，Origin 8.5软件绘图。
2 结果与分析
2.1 北冰红冰葡萄酒发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 初始含糖量对冰酒发酵性能及品质的影响
酵母利用糖分转化为酒精、酸和酯类等物质[21]。由图1可知，当初始糖度为320 g/L时，发酵前4 d的降糖速率为40.75 g/L；初始糖度为360 g/L，发酵前4 d的降糖速率是37 g/L，而初始糖度为400 g/L时，降糖速率仅为22.5 g/L，这是由于高糖造成的渗透压增大，酵母代谢异常，从而使发酵变得缓慢[22]，由此说明初始含糖量对冰酒的发酵性能产生了很大的影响。
图1 在不同初始糖度下冰葡萄酒残糖含量的变化
Fig.1 Changes of residual sugar contents of ice wine with different initial sugar contents
由图2可知，随着冰葡萄汁初始糖度在320～400 g/L范围内的升高，冰酒的酒精度持续下降，残糖不断增加，总酸和感官分值呈先升高后下降的趋势，当初始含糖量＜360g/L时，发酵结束后残糖较少且远远低于GB15037—2006《葡萄酒》（残糖＞125.0 g/L），口感发酸，感官评分偏低；在初始糖度为360 g/L时，酒体的感官评分最高为89分，酒精度为12.3%vol，总酸为11.81 g/L，残糖为128 g/L，此时冰酒酸甜适中，品质最佳。当初始糖度＞360 g/L时，残糖过多，反而不利于酵母菌的繁殖，所以冰酒的酒精度下降，由于口感过甜也导致感官评分不高。综上，选择最佳初始糖度为360 g/L。
图2 不同初始糖度对冰葡萄酒品质的影响
Fig.2 Effect of different initial sugar contents on ice wine quality
2.1.2 不同接种量对冰酒发酵性能及品质的影响
酵母接种量直接影响着发酵时间，适当的酵母接种量有助于启动发酵和减少发酵时间，同时也避免了因为启动时间过长而造成杂菌污染[23]。由图3可知，随着接种量的增大，降糖速率也随之增大。在接种量为2%时，前4 d的降糖速率为2.75 g/L，是因为酵母添加量过少，利用的糖有限；在接种量为10%时，酵母发酵速率很快，约为31.5 g/L，是2%接种量降糖速率的11倍。
图3 在不同酵母接种量下冰葡萄酒残糖的变化
Fig.3 Changes of residual sugar contents of ice wine with different yeast inoculum
由图4可知，酵母菌接种量在2%～10%范围内，随着酵母菌接种量逐渐增加，北冰红冰葡萄酒的酒精度、总酸、感官评分呈现先增高后下降的趋势。当接种量2%～6%时，接种量与酒精度呈正相关；当接种量为6%时，冰酒的酒精度、总酸、感官评分均达到最大值；但当接种量＞6%之后，由于接种量过大会造成发酵前期细胞大量消耗营养物质，营养很快缺乏，导致酵母细胞快速老化，从而代谢酒精减少，影响了冰酒果香味，使得感官评分下降。综上，选择最佳酵母接种量为6%。
图4 不同酵母接种量对冰葡萄酒品质的影响
Fig.4 Effect of different yeast inoculum on ice wine quality
2.1.3 不同发酵温度对冰酒性能及品质的影响
发酵温度对冰酒的酿造十分重要，温度过低时，酵母菌生长与繁殖速度很慢，无法利用更多的糖分转化为酒精，造成冰酒酒精度过低，残糖含量高，口味甜腻的现象；温度过高又会使杂菌生长旺盛，酒体氧化褐变，发生酸败现象[24]。由图5可知，发酵温度为10 ℃时，酵母的代谢速率很慢，发酵前4 d的降糖速率仅为18.5 g/L，而发酵温度为20 ℃时，发酵前4 d的降糖速率为52.5 g/L。
图5 在不同发酵温度下冰葡萄酒残糖含量的变化
Fig.5 Changes of residual sugar contents of ice wine with different fermentation temperature
由图6可知，在发酵温度为10～16 ℃时，北冰红冰葡萄酒的酒精度、总酸、感官评分呈现升高的趋势；当发酵温度达到16 ℃时，冰酒的感官评分最高，为89分，当发酵温度＞16 ℃之后，感官评分呈现下降的趋势，这是因为过高的温度，酵母生长繁殖过快，细胞更容易衰老，挥发酸增加，产酒精能力降低，对冰酒的口味、香气的形成都有不良影响[24]。综上，选择最佳发酵温度为16 ℃。
图6 不同发酵温度对冰葡萄酒品质的影响
Fig.6 Effect of different fermentation temperature on ice wine quality
2.1.4 不同初始pH对冰酒性能及品质的影响
在酿造冰酒的过程中，适当的酸度会增加葡萄酒的陈酿时间，而且冰葡萄酒的颜色也受酸度的影响，所以在冰酒开始发酵前控制好初始酸度十分重要[26-27]。由图7可知，在初始pH值为2.9时，降糖最慢，为11.5 g/L，是因为酵母菌在高酸的环境下，生长缓慢；在初始pH值为3.7时，降糖速率最快，为35 g/L，是初始pH值为2.9时降糖速率的3.04倍。
图7 在不同初始pH下冰葡萄酒残糖含量的变化
Fig.7 Changes of residual sugar contents of ice wine with different initial pH
由图8可知，随着冰葡萄汁初始pH值在2.9～4.5范围内的升高，冰酒的酒精度和感官分值呈先升高后下降的趋势，当初始pH值在2.9～3.7时，由于冰葡萄汁过酸，不利于酵母的生长繁殖，导致冰酒酒精度偏小，口感发酸，感官评分不高；在初始pH值为3.7时，酒体的酒精度达到最高，为12.6%vol，感官评分也达到了峰值，为87分，总酸为9.2 g/L，此时冰酒口味柔和，果香浓郁。当初始pH值＞3.7之后，冰酒的酒精度和感官评分开始下降。综上，选择最佳初始pH值为3.7。
图8 不同初始pH对冰葡萄酒品质的影响
Fig.8 Effect of different initial pH on ice wine quality
2.2 北冰红冰葡萄酒发酵工艺优化正交试验
在单因素试验基础上，以接种量（A）、发酵温度（B）、初始糖度（C）和初始pH值（D）为影响因素，以感官评分为考察指标，设计4因素3因素正交试验，试验重复3次，正交试验结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation process optimization
由表3可知，影响冰酒感官评分的主次因素顺序为B＞A＞D＞C，即发酵温度＞接种量＞初始pH值＞初始糖度。最佳发酵工艺组合为A1B2C2D2，即接种量为4%，发酵温度为16 ℃，初始糖度360 g/L，初始pH值为3.7。由表4可知，发酵温度对冰酒的感官评分影响最大，且影响显著（P＜0.05）。在最优发酵工艺组合A1B2C2D2条件下，进行3次验证试验，感官评分为88.3分，酒精度为11.6%vol，得到的北冰红冰葡萄酒酒体红润，果香浓郁。
表4 正交试验结果方差分析
Table 4 Variance analysis of orthogonal test results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
3 结论
在单因素试验的基础上，利用正交试验对酿造条件进行了优化，优化得到最佳的发酵工艺条件为：酵母接种量4%，发酵温度16 ℃，初始含糖量360 g/L，初始pH值3.7。在此优化发酵工艺条件下，北冰红冰葡萄酒的感官评分为88.3分，酒精度达到11.6%vol，经上述酿造工艺酿造的北冰红冰葡萄酒澄清透明，果香浓郁，口感酸甜协调，具有冰葡萄酒的典型特征。
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