黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr）属茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）落叶多棘刺灌木，是一种药食同源的特色植物[1-2]，主要分布于中国陕西北部、宁夏、甘肃、青海、新疆和西藏等地[3-4]，因其果实具有独特的营养价值和保健功能而广为人知[5]。《维吾尔药志》中记载，黑枸杞果实及根皮对皮肤病、尿道结石、齿龈出血等症有一定的治疗效果，民间则用作明目、降压以及滋补强壮药[6-7]。黑枸杞主要的化学成分是花青素，具有抗氧化作用，可防止过早衰老，增强血管弹性，抑制过敏及炎症，改善关节柔韧性等功效[8-9]。近些年人们对保健食品、药品越来越重视，黑枸杞因具有丰富的营养价值，又具有资源可再生等优点，其需求量也逐年上涨，广泛应用于功能性食品以及保健药品制备行业[10]。
果醋一般是以水果为原料，经酶解处理、酒精发酵和醋酸发酵而成的一种营养丰富的酸性调味品，富含维生素、氨基酸和碳水化合物，能够补充人体所需的营养物质[11-13]。黑枸杞作为一种药食同源的小浆果类保健品，目前对其生理活性的研究是重点[14]，而对其产品的研发鲜有报道，目前黑枸杞产品多为与其他水果复合而来的果汁、果酒和果醋，使黑枸杞的口感、风味等特性无法得到充分体现[15]。黑枸杞果醋是以黑枸杞干果为主要原料，经酒精发酵、醋酸发酵酿制而成的酸性饮品。它兼具黑枸杞和一般果醋的营养生理功能，极大地改善了醋的口感，是一种时兴新型保健饮品[16]。本研究以黑枸杞为原料制备果醋，采用液态发酵方法，在单因素试验的基础上，利用正交设计和响应面法优化其酒精发酵和醋酸发酵工艺条件，为黑枸杞果醋的产业化开发提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑枸杞干果：市售；安琪酿酒酵母、葡萄酒果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；AS1.41型醋酸菌：上海佳民酿造食品有限公司；沪酿1.01醋酸菌：山东和众康源生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯）：天津盛奥化学试剂有限公司；偏重亚硫酸钾（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；维生素C（分析纯）：天津市永大化学试剂开发中心；果胶酶（30 000 U/g）：江苏锐阳生物科技有限公司。
1.2 仪器与设备
VP30型榨汁机：北京莱伯泰科仪器股份有限公司；L3S分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；B250智能数显恒温油水浴锅：上海予卓仪器有限公司；RE-3000旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；WYTO-18型手持式糖度计：成都泰华光学有限公司；HT-24X2H恒温振荡培养器：上海五久自动化设备有限公司；SW-CJ-1C无菌工作台：无锡一净净化设备有限公司；雷磁PHS-25型酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；FRESCO-21离心机：赛默飞世尔科技（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 黑枸杞果醋加工工艺流程及操作要点
操作要点：
清洗、复水：对去除果柄泥渣后的黑枸杞干果进行称质量，清洗后加入蒸馏水，30 ℃浸泡1 h进行复水处理，直至干果柔软无硬心。
打浆、酶解：使用榨汁机将复水处理后的黑枸杞打浆30 s，加入0.4%的果胶酶，置于40 ℃酶解1 h。
过滤、调配、杀菌：使用8层纱布过滤，添加白砂糖调节黑枸杞浆液糖度。于75 ℃维持30 s，然后迅速冷却降温。
酵母菌活化、接种：称取适量的酵母菌，加入10倍的蒸馏水，混匀后加入8%的白砂糖，充分搅拌，使白砂糖溶解，在35 ℃下活化30 min，再加入适量黑枸杞浆液，继续在35 ℃下驯化15 min，得活化酵母液。将4%活化酵母菌接种到杀菌后的黑枸杞浆中。
酒精发酵：在一定温度下发酵，每天定时测其酒精度。当发酵醪液表面气泡消散，酵母泥沉积在瓶底，且酒精度2 d内不再变化时，酒精发酵结束，得到黑枸杞酒液。
过滤、杀菌：使用八层纱布过滤掉酵母泥，于65 ℃维持30 min杀菌。
醋酸菌活化、接种：称取适量的醋酸发酵菌种，加入10倍的酒精度为4%vol～5%vol的酒精，30 ℃、110 r/min振荡培养12 h，加入适量黑枸杞酒液及在30 ℃驯化12 h的活化醋酸菌液。将6%活化醋酸菌接种到黑枸杞酒液中。
醋酸发酵：于30 ℃、120 r/min振荡培养条件下发酵，每天定时取样，检测其酒精度和酸度，7 d左右醋酸菌将乙醇转化为乙酸，当酒精度不再下降、酸度不再上升时，表明醋酸发酵基本结束。
澄清、离心：加入0.2%的食盐抑制醋酸菌的活性，后加入5 g/L的壳聚糖，澄清8 h，于3 000 r/min离心10 min。
灭菌、装罐：将上清液灌装到瓶子里，于121 ℃超高温灭菌10 min，封盖后即得黑枸杞果醋。
1.3.2 酵母菌的选择
处理两份相同的黑枸杞浆液，分别接种葡萄酒酿酒酵母和安琪酿酒酵母（接种量4%），按照1.3.1节工艺进行酒精发酵，通过考察酒精度的变化，来确定最佳酵母菌种类。
1.3.3 酒精发酵工艺优化
单因素试验：分别设置黑枸杞干果添加量为5%、10%、15%、20%、25%，初始糖度为9%、11%、13%、15%、17%，发酵温度为26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃，酵母接种量为2%、3%、4%、5%、6%，进行酒精发酵，以酒精度为评价指标，确定最适的黑枸杞干果添加量、初始糖度、发酵温度及酵母接种量。
正交试验：以酒精度为评价指标，固定黑枸杞干果添加量为15%，以初始糖度（A）、发酵温度（B）、接种量（C）为影响因素，采用3因素3水平正交设计，黑枸杞果醋酒精发酵工艺优化正交试验因素与水平见表1。
表1 酒精发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for technology optimization of alcoholic fermentation
水平A 初始糖度/%B 发酵温度/℃C 接种量/%123 13 15 17 28 30 32 345
1.3.4 醋酸菌的选择
处理两份相同的黑枸杞酒液，分别接种沪酿1.01醋酸菌和AS1.41型醋酸菌（接种量6%），按照1.3.1节工艺进行醋酸发酵，通过考察酸度的变化，以确定最佳醋酸菌种类。
1.3.5 醋酸发酵工艺优化
单因素试验：以酸度为评价指标，分别考察发酵温度（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%）、装液量（20 mL/250 mL、30 mL/250 mL、40 mL/250 mL、50 mL/250 mL、60 mL/250 mL）对醋酸发酵的影响。
响应面试验设计：固定摇床转速为120 r/min，发酵时间为7 d，以酸度为评价指标，以发酵温度（A）、接种量（B）、装液量（C）为影响因素，采用3因素3水平的响应面法优化醋酸发酵工艺，响应面试验因素与水平见表2。
表2 醋酸发酵工艺优化响应面试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of response surface experiments for technology optimization of acetic fermentation
水平A 发酵温度/℃B 接种量/%C 装液量/（mL·250 mL-1）-1 01 28 30 32 468 30 40 50
1.3.6 黑枸杞果醋感官评价
参考农业行业标准NY/T2987—2016《绿色食品果醋饮料》[17]，以色泽（15分）、香气（30分）和滋味（40分）及组织状态（15分）作为感官评价项目，满分100分，制定黑枸杞果醋的感官质量评定标准见表3。
表3 黑枸杞果醋的感官评定标准
Table 3 Sensory evaluation standards of Lycium ruthenicum vinegar
项目感官评价得分/分色泽（15分）香气（30分）滋味（40分）组织状态（15分）具有原料特有的色泽，赏心悦目色泽较亮紫色暗沉具有黑枸杞特有香味，醋香浓郁具有果香，醋香良好果香淡，无异味酸甜可口，浓郁醇香酸甜适宜，有涩味过酸或过甜澄清透明，无可见沉淀澄清透明，有少量沉淀液体浑浊，有明显沉淀11～15 6～10 1～5 21～30 11～20 1～10 31～40 16～30 1～15 11～15 6～10 1～5
1.3.7 理化指标的测定
pH值：采用pH计测定；可溶性固形物：采用手持式糖度计测定；总酸（以醋酸计）：采用酸碱中和滴定法[18]测定；酒精度：采用蒸馏法[19]测定；花青素含量：采用pH示差法[20]测定。
1.3.8 数据处理
单因素试验数据利用Origin 8.5软件处理软件进行处理和分析；响应面优化设计分析利用Design-Expert V10.0.1设计软件；显著性差异分析采用SPSS17.0统计软件进行，P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析
2.1 酵母菌的选择
由图1可知，使用葡萄酒果酒酵母发酵的酒精度远远高于安琪酿酒酵母，且葡萄酒果酒酵母的发酵周期短，在第6天时，葡萄酒果酒酵母的发酵趋势已经平缓，酒精度达到7.1%vol左右，而安琪酿酒酵母在第8天时仍处于上升趋势，且酒精度只达到5%vol。因此，葡萄酒果酒酵母为最适菌种。
图1 酵母菌种类对酒精度的影响
Fig. 1 Effect of yeast species on alcohol content
2.2 黑枸杞果醋酒精发酵工艺优化
2.2.1 黑枸杞干果添加量的确定
由图2可知，当黑枸杞干果添加量越高时，其酒精度越低，这是由于浆液中的含糖量是固定的，此时浆液过于浓稠，酵母菌快速生长，产生的酒精过多，酒精又抑制酵母菌的生长，导致酵母菌发酵迟缓，最终导致酒精度处于较低的状态。在黑枸杞干果添加量＜15%时，酒精度增长较快，且酒精度相对较高，但此时黑枸杞果酒的色泽偏淡，透光率极大，且口感寡淡，黑枸杞的特色风味没有体现出来；当黑枸杞干果添加量为15%时，果酒的清香风味和黑枸杞的特色风味融合在一起，具有宜人的色泽和口感；当黑枸杞干果添加量＞15%之后，酒精度的增长趋势有所减缓，这是由于发酵液中的糖度过高，酵母菌无法完全利用，反而抑制了酵母菌的生长。因此，最适黑枸杞干果添加量为15%。
图2 黑枸杞干果添加量对酒精度的影响
Fig. 2 Effects of dried fruit of Lycium ruthenicum addition on alcohol content
2.2.2 初始糖度的确定
糖分是酵母菌生长的主要营养物质，糖度含量对酒精量的产生有一定的影响[21]。由图3可知，当初始糖度为9%～13%时，酒精量的增长处于一个较为平缓的趋势，产生的酒精量也不高；当初始糖度为15%时，酒精量的增长速度最快且在第4天时达到了最高值；当初始糖度为17%时，酒精度的增长趋势有所减缓，这是由于发酵液中的糖度过高，酵母菌无法完全利用，反而抑制了酵母菌的生长。因此，最适初始糖度为15%。
图3 初始糖度对酒精度的影响
Fig. 3 Effect of initial sugar contents on alcohol content
2.2.3 发酵温度的确定
发酵温度是影响微生物发酵的重要外界因素，可以显著影响菌体的生长状况，进而影响酒精量的产生[22]。由图4可知，当发酵温度为26～30 ℃时，酒精发酵速率一直较为缓慢；当发酵温度为30 ℃时酒精发酵速率明显比其他温度下发酵的要高；当发酵温度＞30 ℃时，酒精发酵速率前期速度较快，后期逐渐变缓；较低的培养温度使菌种增殖缓慢，酒精度低，发酵不完全。温度过高可缩短发酵周期，促使酵母菌提前进入衰亡期，影响发酵汁中菌体数量与酒精度。因此，最适发酵温度为30 ℃。
图4 发酵温度对酒精度的影响
Fig. 4 Effect of fermentation temperature on alcohol content
2.2.4 酵母接种量的确定
由图5可知，当酵母接种量为2%～4%时，起酵速度慢，体系中所产酒精量也慢；当酵母接种量为4%时，发酵速度快，发酵的启动速度也在加快，体系中所产酒精度也较高；当酵母接种量＞4%之后，当发酵速度较早达到顶峰时，由于酵母有自溶、衰亡等现象，使发酵速度逐渐下降，产酒精量随之下降[23]。因此，最适酵母接种量为4%。
图5 酵母接种量对酒精度的影响
Fig. 5 Effect of yeast inoculum on alcohol content
2.3 酒精发酵工艺优化正交试验
根据酒精发酵单因素试验，固定黑枸杞干果添加量为15%，考察初始糖度（A）、发酵温度（B）、酵母接种量（C）对黑枸杞果醋酒精发酵工艺的影响。正交试验结果与分析见表4。
表4 酒精发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 4 Results and analysis of orthogonal tests for technology optimization of alcoholic fermentation
试验号 A 初始糖度/%B 发酵温度/℃C 酵母接种量/%酒精度/%vol 123456789k1 111222333 123123123 123231312 1.80 3.20 4.20 6.50 5.45 5.80 6.20 4.70 7.10 k2 k3R 3.07 5.92 6.00 2.9 4.83 4.45 5.70 1.3 4.10 5.60 5.28 1.5
由表4可知，影响酒精度因素主次为A＞C＞B，即初始糖度＞酵母接种量＞发酵温度。最优酒精发酵工艺组合为A3B3C2，即初始糖度为17%，发酵温度为32 ℃，接种量为4%。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，酒精度平均值为7.4%vol。
2.4 醋酸菌的选择
由图6可知，沪酿1.01醋酸菌的酸度上升趋势高于AS1.41型醋酸菌，醋酸生成量高于AS1.41型醋酸菌，由此说明，沪酿1.01醋酸菌的醋酸发酵效果远高于AS1.41型醋酸菌。因此，最适醋酸菌为沪酿1.01。
图6 不同醋酸菌对酸度的影响
Fig. 6 Effect of different acetic acid bacteria on acidity
2.5 黑枸杞果醋醋酸发酵工艺优化
2.5.1 发酵温度的确定
由图7可知，当发酵温度为26～30 ℃时，黑枸杞醋酸发酵液中总酸含量较低，这可能是因为温度较低时醋酸菌活性较弱所致；当发酵温度为30 ℃时，总酸含量最高；当发酵温度＞30 ℃之后，总酸含量反而下降，这可能是因为温度较高，醋酸菌生长和代谢过于旺盛，菌体极易老化、衰退，而且高温不利于产物的积累[24]。因此，最适发酵温度为30 ℃。
图7 发酵温度对酸度的影响
Fig. 7 Effect of fermentation temperature on acidity
2.5.2 接种量的确定
由图8可知，当接种量为2%～6%时，产酸速度较慢，发酵周期较长，最终的总酸含量也较低；随着接种量的増加，产酸速度增大，发酵周期缩短，总酸含量增大，且在接种量为6%时，发酵周期仅为4 d，总酸含量达最大值3.75 g/100 mL；当接种量＞6%之后，发酵周期不断缩短，但总酸含量呈明显下降趋势，接种量过大，菌体增殖会消耗发酵液中大部分养分，并且积累大量代谢废物，导致醋酸菌过早出现老化、自溶现象，影响醋酸发酵效果[25]。因此，最适接种量为6%。
图8 接种量对酸度的影响
Fig. 8 Effect of inoculum on acidity
2.5.3 装液量的确定
由图9可知，当装液量为20～40 mL/250 mL时，浆液中溶氧过量，易引发醋酸菌死亡，影响黑枸杞发酵液中总酸含量；当装液量为40 mL/250 mL时，黑枸杞发酵液中总酸含量最高；当装液量＞40 mL/250 mL之后，浆液中溶氧量不足，不利于菌体的生长及氧化酒精过程的进行[26]。因此，选择最适装液量为40 mL/250 mL。
图9 装液量对酸度的影响
Fig. 9 Effect of liquid volume on acidity
2.6 响应面法优化醋酸发酵工艺条件
在单因素试验分析结果的基础上，以酸度（Y）为响应值，固定摇床转速为120 r/min，发酵时间为7 d，考察发酵温度（A）、接种量（B）、装液量（C）对黑枸杞果醋醋酸发酵工艺的影响，采用Design-Expert V10.0.1软件进行3因素3水平的响应面设计，将得到的试验数据进行二次多项回归拟合，试验均重复3次。响应面试验设计结果见表5，方差分析结果见表6。
应用Design-Expert V 10.0.1软件对表5的试验数据进行回归分析，得酸度回归方程如下：
表5 响应面试验设计与结果
Table 5 Design and results of response surface experiments
试验号ABCY 酸度/（g·100 mL-1）1234567891 0 010-10-1-1 10-00000-10010-100-11 12 13 14 15 16 17 100-1110001 1101010-1 100--1 0 1001-11 3.559 3.119 3.580 3.275 3.855 3.350 3.625 2.878 3.228 3.705 3.675 3.178 3.250 3.750 3.219 2.528 3.478
由表6可知，该模型P＜0.01，回归模型方程显著；失拟项P=0.199 9＞0.05，不显著，表明该方程合理可行；决定系数R2=0.928 3，校正决定系数R2Adj=0.836 1，说明该模型能解释83.61%响应值的变化。该回归方程的拟合度和可信度均较好，可用于黑枸杞果醋醋酸发酵的理论预测。
表6 回归模型方差分析
Table 6 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
方差来源平方和 自由度均方F 值P 值显著性模型**ABCA B**AC BC A2 B2 C2残差失拟项误差总和1.73 2.926E-003 0.48 0.19 0.11 0.035 0.032 0.086 0.46 0.24 0.13 0.087 0.047 1.86 91111111117341 6 0.19 2.926E-003 0.48 0.19 0.11 0.035 0.032 0.086 0.46 0.24 0.019 0.029 0.012 10.07 0.15 25.43 10.21 5.82 1.85 1.70 4.51 24.03 12.72 0.003 0 0.706 7 0.001 5 0.015 2 0.046 5 0.216 4 0.233 3 0.071 2 0.001 7 0.009 1******2.49 0.199 9
模型方程的一次项C、交互项AB对结果有显著的影响（P＜0.05），一次项B、二次项B2、C2对结果有极显著的影响（P＜0.01）。由F值可知，各因素对醋酸产量影响的大小顺序为：发酵温度（A）＞装液量（C）＞接种量（B）。
由图10可知，酸度随着发酵温度和接种量的增加呈现先升高后下降的趋势，两者等高线呈现椭圆形，存在极值，且坡度较陡说明交互作用显著；随着发酵温度和装液量的增加，酸度呈现出先升高后下降的趋势，且坡度较平缓交互作用不显著；随着接种量和装液量的增加，酸度呈现出先升高后下降的趋势，坡度相对较陡，交互作用较显著。
图10 发酵温度、接种量和装液量交互作用对黑枸杞果醋酸度影响的响应面及等高线
Fig. 10 Response surface plots and contour lines of interaction between fermentation temperature, inoculum and liquid volume on Lycium ruthenicum fermentation
通过统计软件Design-Expert V 10.0.1对模型优化求解，得到黑枸杞果醋醋酸发酵的最佳工艺条件为：发酵温度30.472 ℃，接种量6.809%，装液量42.023 mL/250 mL，此条件下发酵后黑枸杞果醋酸度理论值为3.771 g/100 mL。
为验证试验结果的真实性，考虑实际的操作情况，将发酵工艺参数调整为发酵温度30 ℃，接种量7%，装液量42 mL/250 mL，在此最佳醋酸发酵工艺条件下进行3次验证试验，得到黑枸杞果醋的酸度实际值为3.763 g/100 mL，结果与预测值相差微小。因此，采用响应面法优化的黑枸杞果醋发酵工艺条件准确可靠，具有可行性。
2.7 产品的质量指标
对优化配方后的黑枸杞果醋进行感官分析，色泽呈紫色，色泽纯正均匀；具有果醋香气和黑枸杞的气味；酸度适中，口感较好；稳定性好，无肉眼可见杂质。
对优化配方后的黑枸杞果醋进行理化指标的测定，pH值为4.5；可溶性固形物含量为9.0%；总酸含量为（以醋酸计）3.76 g/100 mL；花青素含量为0.548 g/100 mL。
3 结论
依据单因素试验结果和正交试验确定最佳黑枸杞果醋酒精发酵工艺为初始糖度为17%、发酵温度为32 ℃、接种量为4%。通过单因素及响应面优化得到黑枸杞果醋醋酸的最优发酵工艺为发酵温度30 ℃、接种量为7%、装液量为42 mL/250 mL。黑枸杞果醋饮料色泽深紫、赋有光泽，口感好、酸度适中、爽口、无异味，具有浓郁的醋香和黑枸杞的清香、柔和、刺激味少，澄清、无沉淀、无悬浮物。
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