多糖广泛存在于植物中，它是构成生物生命活动的最重要的基本物质之一。茯苓（Poria cocos）为多孔菌科真菌的干燥菌核，多糖是茯苓的主要活性成分，约占其菌核干质量的70%～90%[1-4]，现代研究表明茯苓多糖具有抗肿瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化等生物活性[5-8]。白芷（Angelica dahurica）为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根，其中多糖含量达34.14%[1，9]。白芷多糖具有体外抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、调节免疫力功效[9-12]。白扁豆（Dolichos lablab）为豆科植物扁豆的干燥成熟种子，主要成分是多糖，含量为50%左右[1，13]。白扁豆多糖具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功效[14-16]。
茯苓多糖主要存在细胞壁中，常见溶剂提取法包括水提法和碱提法，其中以水为溶剂，操作安全、无毒[17-18]。屈贺幂[19]研究了茯苓多糖水提工艺，在单因素试验基础上采用正交试验优化得到最佳浸提工艺参数为浸提温度90 ℃，浸提时间7.4 h，水料比9.4倍，在此条件下，茯苓多糖得率为0.758%。目前，白芷多糖常用水为提取溶剂[20]，王德才等[21]经脱脂、醇提后，采用水提醇沉法得杭白芷多糖的含量达15.38%，浸提工艺为95 ℃，浸提3次，每次2 h，分别加入6倍、5倍、4倍蒸馏水。于鑫等[22]以白扁豆为原料，以水为溶剂，通过响应面法优化建立多糖提取方法，浸提温度为70 ℃，浸提时间为100 min，液料比为70∶1（mL∶g），在此条件下，白扁豆多糖得率为0.96%。
很多古方记载及现代医学证明，某些白色类中药具有美白、抗衰老、抗皱等功效[23]。如美白古方八白散由1∶1的茯苓、白芷等药材组成，具有润泽肌肤、日用面如玉作用[24]；出自清《医学集成（卷二）》的八仙糕中含有1∶1的茯苓、白扁豆等药材，长期服用具有益寿延年的作用[25]；清代美容方剂玉容散中含有1∶1∶1白芷、茯苓、白扁豆等药材，用其洗面可以令肌肤白嫩[26]。目前，鲜有关于茯苓、白芷、白扁豆混合料多糖的提取研究报道。
本研究选用茯苓、白芷、白扁豆饮片混合料（1∶1∶1），采用水浸提方法提取其总多糖，以总多糖得率为评价指标，考察提取次数、提取温度、提取时间、液料比对总多糖提取效果的影响，通过单因素试验与正交试验优化总多糖提取工艺，以期为茯苓、白芷、白扁豆综合应用提供参考和依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
茯苓饮片、白芷饮片（均符合2020版《中国药典》标准）：湖北正光九资河药业有限公司；白扁豆饮片（符合2020版《中国药典》标准）：湖北天济中药饮片有限公司；D-无水葡萄糖（纯度≥99.9%）标准品：中国食品药品检定研究院；浓硫酸、苯酚（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
TU951型紫外可见光分光光度计：北京谱析通用仪器有限责任公司；OSB-2200水浴锅、EYEL4 N-1100型旋转蒸发仪、vacuubrand 2C型真空泵、CA-111型冷却水循环装置：上海爱朗仪器有限责任公司；SQP型电子天平（0.01 mg）：赛多利斯科学仪器有限公司；DSW-S-8电热恒温水浴锅：北京光明医疗仪器有限公司；JJ1000型电子天平（0.01 g）：常熟市双杰测试仪器厂；SK8200LHC超声波清洗器：上海超导超声仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 混合料总多糖提取工艺优化单因素试验
称取茯苓、白芷、白扁豆饮片各20.00 g，分别考察提取次数（1、2、3、4）、提取温度（75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃）、提取时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、液料比（6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL∶g））对茯苓、白芷、白扁豆混合料总多糖得率的影响。
1.3.2 混合料总多糖提取工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以总多糖得率（Y）为评价指标，选择液料比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）作为变量，设计3因素3水平L9（33）正交设计优化茯苓、白芷、白扁豆混合料提取工艺条件。正交试验因素与水平见表1。
表1 茯苓、白芷、白扁豆混合料提取工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction process optimization of tuckahoe, angelica and Baibiandou mixture
水平A 液料比（mL∶g）B 提取温度/℃C 提取时间/h 123 6 10 14 75 85 95 2.0 2.5 3.0
1.3.3 总多糖含量检测
总多糖含量检测参照文献[27]。设定吸光度值波长为495 nm，以吸光度值（y）为纵坐标，葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程为y=0.057 9x+0.009 5，相关系数R2=0.999 6。根据标准曲线回归方程计算样品中总多糖得率，公式如下：
式中：W表示总多糖得率，%；c表示根据吸光度值计算出的溶液质量浓度，mg/mL；D表示溶液稀释倍数；V表示供试品溶液体积，mL；m表示饮片称样量，mg。
2 结果与分析
2.1 混合料总多糖提取工艺优化单因素试验
2.1.1 提取次数的确定
提取次数对茯苓、白芷、白扁豆混合料总多糖得率的影响结果见图1。
图1 提取次数对总多糖得率的影响
Fig. 1 Effect of extraction times on yield of total polysaccharides
由图1可知，提取1次总多糖得率为5.12%，提取2次总多糖得率为7.8%，提取3次总多糖得率为9.07%，第4次提取总多糖得率增加不明显，且多次提取操作繁琐，耗时较长。综合考虑，确定提取次数3次为宜。
2.1.2 提取温度的确定
提取温度对茯苓、白芷、白扁豆混合料总多糖得率的影响见图2。
图2 提取温度对总多糖得率的影响
Fig. 2 Effect of extraction temperature on yield of total polysaccharides
由图2可知，随着提取温度在75～85 ℃范围内的升高，茯苓、白芷、白扁豆混合料总多糖得率增加，温度高于85 ℃时，总多糖得率处于平稳上升趋势，当提取温度达到95 ℃时，总多糖得率最高，为8.36%。造成这种现象是由于多糖分子之间的运动速度随着提取温度的上升而不断加快，而细胞组织中的多糖组分与溶剂之间的传质运动速度也随之加快的原因[28]。因此，确定提取温度95 ℃为宜。
2.1.3 提取时间的确定
提取时间对茯苓、白芷、白扁豆总多糖得率的影响见图3。
图3 提取时间对总多糖得率的影响
Fig. 3 Effect of extraction time on yield of total polysaccharides
由图3可知，提取时间在1.0～2.5 h范围内时，茯苓、白芷、白扁豆总多糖得率随提取时间的增加而升高；当提取时间达到2.5 h时，总多糖得率最高，为8.73%；继续增加提取时间至3.0 h时，总多糖得率有所下降。这可能是由于提取时间过长，导致多糖内部结构破坏[29]，降低了总多糖得率。此外，加热时间过长，能耗增加。因此，确定提取时间2.5 h适宜。
2.1.4 液料比的确定
液料比对茯苓、白芷、白扁豆总多糖得率的影响见图4。
图4 液料比对总多糖得率的影响
Fig. 4 Effect of liquid to solid ratio on yield of total polysaccharides
由图4可知，液料比为6∶1、10∶1时，随着液体占比增加，总多糖得率升高，当液料比为10∶1时，总多糖得率为8.94%，继续增加液体占比，至液料比至22∶1，总多糖得率呈缓慢上升趋势。这是因为随着料液用量不断增加，细胞内外的渗透压也随之增加，多糖浸出越多，然而继续增加料液，细胞内外渗透压趋于平衡，多糖提取率呈缓慢上升趋势[30]。在车间提取罐体积一定的条件下，液料比过大，会造成过多的溶剂浪费。因此，确定液料比10∶1适宜。
2.2 正交试验优化茯苓、白芷、白扁豆混合料总多糖提取工艺
正交试验设计以单因素试验所得最优提取条件为基础，选择液料比（A）、提取温度（B）、提取时间（C）为影响因素，以总多糖得率为考察指标进行3因素3水平正交试验。茯苓、白芷、白扁豆总多糖混合提取工艺优化正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。
表2 茯苓、白芷、白扁豆混合料总多糖提取工艺优化正交试验结果与分析
Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction process optimization of total polysaccharides from tuckahoe,angelica and Baibiandou mixture
试验号 A 液料比（mL∶g）B 提取温度/℃C 提取时间/h总多糖得率/%123456789k1 6.67 8.01 7.47 6.97 7.98 8.67 7.78 7.45 8.35 k2 k3R 6∶1 6∶1 6∶1 10∶1 10∶1 10∶1 14∶1 14∶1 14∶1 7.383 7.873 7.860 0.490 75 85 95 75 85 95 75 85 95 7.140 7.813 8.163 1.023 2.0 2.5 3.0 2.5 3.0 2.0 3.0 2.0 2.5 7.597 7.777 7.743 0.180
表3 正交试验结果方差分析
Table 3 Variance analyasis of orthogonal experiments results
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
因素偏平方和自由度F 值F0.05临界值显著性ABC误差0.467 1.623 0.055 0.06 2222 8.491 29.509 1.000 19.000 19.000 19.000*
由表2可知，对总多糖得率的影响因素的主次顺序依次为提取温度（B）＞液料比（A）＞提取时间（C），最佳茯苓、白芷、白扁豆混合料中总多糖提取工艺组合为A2B3C2，即液料比10∶1（mL∶g）、提取温度95 ℃、提取时间2.5 h，提取3次。在此最佳条件下进行3次平行验证试验，总多糖平均提取率为8.88%。由表3可知，提取温度对结果影响具有显著性差异（P＜0.05），液料比、提取时间对结果影响无显著性差异（P＞0.05）。
3 结论
选用茯苓、白芷、白扁豆饮片为原料，采用浸提法提取其总多糖，通过单因素试验与正交试验优化混合料多糖的提取工艺。结果表明，茯苓、白芷、白扁豆混合料总多糖的最佳提取工艺为提取温度95 ℃、液料比10∶1（mL∶g）、提取时间2.5 h、提取3次。在此优化条件下，总多糖得率为8.88%。因此，采用该工艺提取茯苓、白芷、白扁豆3种饮片的总多糖，总多糖得率较高，工艺稳定可行。
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2020 年版.北京：中国医药科技出版社，2020：109，114，251.
[2]朱秀高，李艳青.茯苓多糖的免疫调节作用研究进展[J].猪业科学，2018，35（6）：80-81.
[3]李世杰.发酵与酶解转化茯苓多糖工艺及其产物活性研究[D].贵阳：贵州大学，2018.
[4]邓桃妹，彭代银，俞年军，等.茯苓化学成分和药理作用研究进展及质量标志物的预测分析[J].中草药，2020，51（10）：2703-2717.
[5]SUN Y C.Biological activities and potential health benlth benefits of polysaccharides from Poria cocos and their derivatives[J]. Int J Biol Macromol,2014,68(1):131-134.
[6]游晰，熊大国，郭志斌，等.茯苓多种化学成分及药理研究进展[J].安徽农业科学，2015，43（2）：106-109.
[7]李晓洁，曾百惠，陈慕兰，等.酸性茯苓多糖的提取工艺优化[J].中国酿造，2018，37（10）：158-161.
[8]郭毓菲，张诗泉，王汉迪，等.超声波法提取水溶性茯苓多糖工艺优化及其抗氧化活性探究[J].中国酿造，2018，37（12）：160-164.
[9]王彦龙.禹白芷的干燥及其总香豆素的提取纯化[D].洛阳：河南科技大学，2012.
[10]王俊雅.基于RAW264.7 细胞的白芷和黑莓籽多糖免疫增强功能评价[D].开封：河南大学，2019.
[11]高丽君，高艳霞.杭白芷多糖体外抗氧化活性的研究[J].时珍国医国药，2009，20（1）：173-174.
[12]练有扬，杨娜，赵雨晴，等.白芷的化学成分及药理活性研究进展[J].科学技术创新，2019（3）：36-37.
[13]李安智，傅翠真.食用豆类标准物质的研制及优质源标准的制定[J].中国粮油学报，1992（1）：16-18.
[14]刘德辉.白扁豆的药用[J].农村百事通，2005（13）：68.
[15]刘富岗，弓建红，杨云，等.白扁豆等4 种中药多糖体外抗氧化活性研究[J].河南科学，2009，27（10）：1212-1215.
[16]胡国柱，姚宇飞，文珠，等.白扁豆多糖对神经细胞缺氧性凋亡的保护[J].中药药理与临床，2012，28（1）：91-94.
[17]刘星汶，徐晓飞，刘玮，等.茯苓多糖的提取、结构、活性和作用机理研究进展[J].食品研究与开发，2021，42（8）：172-178.
[18]张晓娟，唐洁，梁引库，等.茯苓多糖的提取纯化及应用研究进展[J].时珍国医国药，2018，19（12）：2946-2949.
[19]屈贺幂. 茯苓多糖提取纯化及指纹图谱研究[D]. 长沙：湖南大学，2007.
[20]胡政宇，周鸿立.白芷多糖提取分离及其生物活性的研究进展[J].中国调味品，2017，42（12）：174-177.
[21]王德才，李同德，高丽君.杭白芷多糖的提取分离及其含量测定[J].中国中医药科技，2008（4）：283-284.
[22]于鑫，徐敏.响应面法优化白扁豆多糖的提取条件[J].安徽农业科学，2014，42（2）：380-382.
[23]高春洁，葛旻垚，唐苏为，等.面部滚针联合“八白散”洁面治疗黄褐斑的临床疗效观察[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志，2019，18（6）：586-589.
[24]陈革豫.八白散的研究进展[J].科学技术创新，2020（10）：15-16.
[25]张敏.古代抗衰老方剂用药规律研究[D].北京：中国中医科学院，2018.
[26]毛文姣.痤疮古代文献整理及研究[D].南京：南京中医药大学，2009.
[27]汪亚楠，田祎颖，黄俊霖，等.荔枝草总多糖提取工艺研究[J].广州化工，2018，46（10）：75-77.
[28]许小向，洪艳平，胡捷敏，等.松针多糖提取工艺及稳定性研究[J].食品科技，2015，1（6）：218-223.
[29]蔡梅超，许银银，刘玉红，等.响应面法优化川楝子多糖提取工艺[J].辽宁中医药大学学报，2018，20（11）：31-34.
[30]王锋，刘晓鹏，王应玲，等.猴头菇菌丝体多糖的超声辅助提取工艺研究[J].化学研究与应用，2020，32（11）：1984-1990.
