蓝莓（blueberry）被誉为“浆果之王”，果实含有丰富的氨基酸、维生素、花青素、黄酮、有机硒和有机酸等特殊营养成分[1]，不仅拥有比一般植物更强的抗氧化活性，还具有抗癌和抗炎等功能，在改善视力、延缓衰老、增强记忆力、降低糖尿病风险和促进心血管健康等方面有较强的保健功效[2-3]。蓝莓深加工产品丰富，主要包括果汁饮料、饼干、罐头、果酱等。因发酵果汁饮料营养丰富、酯香风味独特，备受消费者喜爱[4]。发酵果汁在发酵过程不仅会产生大量的氨基酸、短链脂肪酸等营养物质和益生菌代谢产物，还能产生丰富的醇类、酯类等风味成分[5]。而发酵工艺作为发酵果汁加工的关键，其改进点主要集中在发酵方式和菌种的选择方面[6]。发酵可以分为酒精发酵和非酒精发酵，酒精发酵主要采用酵母菌发酵，非酒精发酵主要为乳酸菌发酵[7]。
目前，发酵蓝莓果汁饮料普遍采用乳酸菌发酵的方式，而酵母发酵多用于蓝莓果酒及果醋的生产中[8-9]。吴万林等[10]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）与嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）单独发酵和混合发酵蓝莓汁在抗氧化能力和总酚的保留上无明显差异，但混合发酵在花色苷和色泽的保留方面明显优于单独发酵。张玉慧[11]研究表明，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）和植物乳杆菌复合发酵比例为1∶2时，具有协同发酵能力，所得发酵蓝莓果汁香气成分增加，挥发性香气成分变化显著。白琳等[12]研究发现，复合菌种（植物乳杆菌、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）、嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus））发酵的蓝莓酵素可提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。然而，采用酵母菌与乳酸菌混合发酵生产发酵蓝莓果汁饮料的研究目前还比较少。
本研究以蓝莓为研究对象，采用酵母菌与乳酸菌分阶段发酵工艺制备发酵蓝莓果汁，通过单因素试验与正交试验，考察酵母菌接种量、乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）比例及接种量、发酵温度与发酵时间对发酵蓝莓果汁总酯含量以及感官评分的影响，并利用顶空固相微萃取（headspace-solidphase microextraction，HS-SPME）结合气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）联用技术对发酵前后蓝莓果汁挥发性风味物质进行分析。以期改善发酵蓝莓果汁风味，并为其产业化生产奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
蓝莓（夏普）：重庆市綦江区健力蓝莓合作社；果胶酶（酶活10 000 U/g）：上海荣晖生物科技有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）菌粉（1×1010 CFU/g）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）菌粉（1×1010 CFU/g）：西安米先尔生物科技有限公司；酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）粉BV818：安琪酵母股份有限公司；木糖醇、赤藓糖醇、果葡糖浆、葡萄糖（均为食品级）：济南康旭生物科技有限公司；低聚果糖（食品级）：量子高科集团有限公司；壳聚糖（食品级）：山东浩瀚食品添加剂有限公司；环己酮（纯度99.90%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司。
1.2 仪器与设备
固相微萃取（solidphase microextraction，SPME）手动进样器、50/30μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司；HP-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）、6890N-5975B气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；WYT-J型手持糖度计：成都光学厂；WYA-2WAJ阿贝折射仪：上海力辰仪器科技有限公司；LRH-250生化培养箱：重庆市永生实验仪器厂；JJ-2型组织捣碎机：常州朗越仪器制造有限公司；不锈钢密封层叠板框过滤器：上海信步科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵蓝莓果汁加工工艺流程及操作要点
原料预处理：挑选无机械碰伤和有病虫害的蓝莓1 kg，用自来水洗净、晾干，加入等质量的纯净水，倒入榨汁机打成匀浆。
蓝莓酶解：蓝莓匀浆添加2‰果胶酶，50 ℃条件下酶解40 min[13]，100目尼龙网过滤。
调糖：测定蓝莓汁的初始糖度，采用白砂糖将糖度调节至12°Bx。
酵母活化：添加0.5‰～3.0‰酵母菌粉BV818至50 mL 10%白砂糖水溶液中，37 ℃活化30 min。
酵母发酵：将酵母活化液添加到蓝莓汁中，发酵温度28 ℃，糖度下降至8°Bx以下结束发酵，85 ℃灭菌20 min。
乳酸菌发酵：将蓝莓酵母发酵汁添加等体积的纯净水，混合均匀，糖度调节至12°Bx，85 ℃灭菌20 min，乳酸菌菌粉（植物乳杆菌：干酪乳杆菌比例3∶1）接种量为1.5‰。
调配：于乳酸菌发酵液中添加1%赤藓糖醇、1%木糖醇和1‰低聚果糖，优化糖酸比，形成更加协调的口感。并按0.8‰添加壳聚糖[14]，于室温静置1 d，600目板框过滤器过滤。
灭菌、罐装：将过滤后的发酵蓝莓饮料罐装至100 mL玻璃瓶中，采用巴氏灭菌方法灭菌后即得发酵蓝莓果汁成品。
1.3.2 酵母接种量对发酵效果的影响
酵母以不同接种量（0.5‰、1.0‰、2.0‰、3.0‰）接种到蓝莓汁中，于28 ℃发酵18 h，每隔6 h监测一次糖度，考察酵母接种量对第一阶段发酵效果的影响。
1.3.3 乳酸菌发酵工艺优化单因素试验
（1）植物乳杆菌∶干酪乳杆菌比例对蓝莓果汁发酵效果的影响
酵母菌发酵结束后的蓝莓发酵汁中添加等体积的纯净水，混合均匀，将糖度调节至12°Bx，乳酸菌菌粉的接种总量为1.5‰，乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）接种比例为3∶1，30 ℃发酵18 h。在此基础条件下，分别考察乳酸菌比例（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌=3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3（g∶g），发酵温度（22 ℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃和38 ℃）、发酵时间（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h）对发酵蓝莓果汁总酯含量及感官评价的影响。
1.3.4 乳酸菌发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以总酯含量（Y）为评价指标，选择乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）比例（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）3个影响较大的因素为自变量，进行3因素3水平正交试验，优化乳酸菌发酵工艺条件，因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization
水平A 乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）比例（g∶g）B 发酵温度/℃C 发酵时间/h 123 3∶1 2∶1 1∶1 26 30 34 12 18 24
1.3.5 分析检测
可溶性固形物含量：手持糖度计测定；总酯含量的测定：回流皂化法[15]。
1.3.6 感官评价
由15名专业感官评价人员组成评定小组，依据发酵蓝莓果汁的感官评价标准进行感官评价[16]，满分100分。发酵蓝莓果汁的感官评价标准见表2。
表2 发酵蓝莓果汁的感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented blueberry juice
项目评分标准评分/分外观（20分）香气（40分）滋味（40分）澄清、透明、色泽诱人澄清、无杂质、色泽较好浑浊、有杂质、色泽不自然发酵味、酯香味、果香味浓郁协调发酵味、酯香味、果香味良好，较协调发酵味、酯香味、果香味较淡或不协调发酵味、酯香味、果香味较淡，酸味偏重香气不足，带有酸臭味酸甜适中，果香味突出，无苦涩味酸甜适中，果香味较突出，无苦涩味酸味或甜味偏重，果香味淡，无明显苦涩味略有苦涩味，无果香味有明显的苦涩味16～20 11～15＜10 36～40 31～35 26～30 21～25＜20 36～40 31～35 26～30 21～25＜20
1.3.7 挥发性成分检测
HS-SPME条件：取混合均匀的5 mL蓝莓发酵液于10 mL固相微萃取仪采样瓶中，插入装有萃取纤维头的手动进样器，在60 ℃的平板加热条件下顶空萃取48 min，热解吸5 min后进样进行GC-MS分析。
气相色谱（gas chromatography，GC）条件：HP-5MS弹性石英毛细管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升温：柱温：40 ℃，起始温度35 ℃，保持1 min，以4 ℃/min升温至190 ℃，再以8 ℃/min升温至240 ℃，保持5 min；进样口温度：230 ℃；不分流进样，载气为高纯氦气（He），流速0.9 mL/min，溶剂延迟时间3 min[17-18]。
质谱（mass spectrometer，MS）条件：电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；质量扫描范围29～500 m/z。
定性方法：采用Wiley275谱库和美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）17标准数据库对挥发性成分进行比对分析，通过谱库检索和挥发性成分的质谱碎片信息、保留指数、保留时间等进行定性分析（匹配度＞80，最大值为100）；定量方法：以环己酮为内标（8.42 mg/L），采用内标法计算挥发性成分含量。
1.3.8 数据处理
采用Excel 2018进行绘图，采用SPSS 24.0进行数据统计分析。
2 结果与分析
2.1 酵母接种量对发酵蓝莓果汁发酵效果的影响
酵母接种量对发酵过程中发酵蓝莓果汁糖度的影响见图1。
图1 不同酵母接种量对发酵过程中发酵蓝莓果汁糖度的影响
Fig. 1 Effects of different yeast inoculum on sugar contents of fermented blueberry juice during fermentation
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同。
由图1可知，随着酵母接种量增加，在0～12 h内酵母发酵速度越快，降糖速度也越快。当酵母添加量≤2‰时，随着酵母添加量增加，降糖效果更明显；当酵母添加量＞2‰时，与2‰酵母添加量相比，对糖度变化无显著影响。当发酵时间在12～18 h之间，糖度变化曲线趋于平缓，酵母添加量为1‰、2‰、3‰，对糖度变化无显著影响。综合考虑，选择酵母接种量2‰为宜。
2.2 乳酸菌发酵工艺优化单因素试验
2.2.1 乳酸菌比例对发酵蓝莓果汁品质的影响
乳酸菌比例对发酵蓝莓果汁感官评分和总酯含量的影响见图2。
图2 乳酸菌比例对发酵蓝莓果汁感官评分和总酯含量的影响
Fig. 2 Effects of lactic acid bacteria ratio on sensory scores and total ester contents of fermented blueberry juice
由图2可知，随着干酪乳杆菌占比增加，总酯含量呈先下降后平稳的趋势，植物乳杆菌∶干酪乳杆菌比例为3∶1时，总酯含量最高（80.90 mg/L）；而感官评分呈先增加后下降的趋势，当植物乳杆菌∶干酪乳杆菌比例为3∶1、2∶1时，产品的感官评分逐渐增加，当植物乳杆菌∶干酪乳杆菌比例为2∶1时，感官评分最高（94.5分）；随着干酪乳杆菌占比继续增加，感官评分降低至80.5分。植物乳杆菌在发酵蓝莓果汁时可以进行苹果酸-乳酸发酵，赋予蓝莓果汁独特的酯香风味，另外，植物乳杆菌具有多种氨基酸代谢酶，可以消耗蓝莓果汁中的氨基酸，生成醇、醛、酸等代谢小分子物质，赋予产品更加丰富的口感[19]；干酪乳杆菌与其复配使用，可使有机酸、酯类等物质含量增多，风味更加饱满[20]。综合考虑，选择乳酸菌（植物乳杆菌：干酪乳杆菌）比例2∶1为宜。
2.2.2 发酵温度对发酵蓝莓果汁品质的影响
发酵温度对发酵蓝莓果汁感官评分和总酯含量的影响见图3。
图3 发酵温度对发酵蓝莓果汁感官评分和总酯含量的影响
Fig. 3 Effects of fermentation temperature on sensory scores and total ester contents of fermented blueberry juice
由图3可知，随着发酵温度在22～38 ℃范围内的上升，发酵蓝莓果汁的总酯含量呈逐步上升后平稳的趋势，发酵温度≤34 ℃时，总酯含量逐步增加，发酵温度＞34 ℃，总酯含量趋于平稳，当发酵温度为38 ℃时，总酯含量最高（95.2 mg/L）；而感官评分呈先增加后下降的趋势，当发酵温度≤30 ℃时，产品的感官评分增加，当发酵温度为30 ℃时，感官评分值最高（92.1分），当发酵温度＞30 ℃，产品的感官评分下降。其原因可能是发酵温度过低，乳酸菌生长迟缓，导致发酵能力差，不利于风味物质的形成；温度过高，乳酸菌生长活跃，代谢旺盛，利于风味物质产生，但大量其他代谢物同时产生，比如有机酸增多，导致发酵蓝莓果汁酸味过重，影响口感[21]。综合考虑，选择乳酸菌发酵温度30 ℃为宜。
2.2.3 发酵时间对发酵蓝莓果汁品质的影响
由图4可知，随着发酵时间在6～30 h范围内的增加，发酵蓝莓果汁的总酯含量逐渐增加，发酵时间≤18 h时，总酯含量增速较快，发酵时间＞18 h时，总酯含量变化趋于平稳，当发酵时间为30 h时，总酯含量达到最高值（93.20mg/L）；而感官评分呈先增加后下降的趋势，当发酵时间≤18 h时，感官评分增加，当发酵时间为18 h时，产品的感官评分最高（96.7分），发酵时间＞18 h时，产品的感官评分下降。其原因可能是发酵时间过短，乳酸菌发酵不完全，酯化反应不够充分，导致发酵蓝莓果汁风味单调寡淡；发酵时间过长，乳酸菌生长旺盛，产生大量乳酸，抑制菌株自身生长，使得发酵蓝莓果汁酸味过重，影响口感[22]。综合考虑，选择乳酸菌发酵时间18 h为宜。
图4 发酵时间对发酵蓝莓果汁感官评分和总酯含量的影响
Fig. 4 Effects of fermentation time on sensory scores and total ester contents of fermented blueberry juice
2.3 乳酸菌发酵工艺优化正交试验
在单因素试验的基础上，以乳酸菌接种比例（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为影响因素，以总酯含量为评价指标，采用L9（33）正交设计，正交试验结果及分析见表3。
表3 发酵工艺优化正交试验结果及分析
Table. 3 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization
试验号ABC总酯含量/（mg·L-1）123456789k1 111222333 123123123 123231312 65.5 98.6 93.6 65.2 59.5 51.3 75.1 61.3 91.6 k2 k3R 85.90 58.66 76.00 27.24 68.60 73.13 78.83 10.23 59.36 85.13 76.06 16.70
由表3可知，乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）比例、发酵温度以及发酵时间对发酵蓝莓果汁品质有重要影响，通过正交试验优化乳酸菌发酵工艺参数，可以获得酯香风味更加浓郁的发酵蓝莓果汁。由极差分析可知，影响发酵蓝莓果汁总酯含量的因素，由高到低排序为：乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）比例＞发酵时间＞发酵温度。正交试验最优组合为A1B3C2，即乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）比例3∶1，发酵温度34 ℃，发酵时间18 h。在此条件下进行验证试验，总酯含量为101.3 mg/L。
2.4 蓝莓果汁发酵前后挥发性风味物质分析
蓝莓果汁发酵前后挥发性风味物质检测结果见表4。
表4 蓝莓果汁发酵前后挥发性风味物质含量对比
Table 4 Comparison of volatile compounds contents in fermented blueberry juice before and after fermentation
注：“-”表示未检出。
种类挥发性风味化合物含量/（μmol·L-1）发酵前发酵后---醇类16.51--125.66 6.32 120.93 29.20 55.62 1.14--酚类8.04 1.85 50.24醛类---67.91 1.08 1.55 1.72--烯烃类0.99 7.19 14.58 1.92酯类——---其他乙醇异丁醇2-甲基-1-丁醇芳樟醇苯乙醇香茅醇α-松油醇香叶醇2,4-二叔丁基苯酚异戊醛苯甲醛苯乙醛正己醛反式-2-己烯醛右旋萜二烯乙酸乙酯醋酸异戊酯2-甲基丁基乙酸酯正己酸乙酯辛酸乙酯乙酸苯乙酯癸酸乙酯月桂酸乙酯甲氧基苯肟3.51 6.17 5.91 8.61 1.25 16.80 21.11 4.21 23.21 4.51-
由表4可知，蓝莓果汁在发酵前后挥发性香气成分在种类和含量均发生了显著变化，发酵前的蓝莓果汁检测出9种挥发性香气成分，包括醇类（3种）、酚类（1种）、醛类（2种）、烯烃类（1种）、酯类（1种）以及其他类（1种）；发酵后的蓝莓果汁共检测出19种挥发性香气成分，包括醇类（6种）、酚类（1种）、醛类（3种）、烯烃类（1种）、酯类（8种）。与发酵前相比，发酵后蓝莓果汁的挥发性香气中酯类物质增加7种，含量是其44.6倍；醇类物质增加3种，含量是其12.8倍；醛类物质增加1种，含量是其53%。酯类物质是芳香风味的代表，其中乙酸乙酯被赋予果香和酯香属性[26]，己酸乙酯具有水果香味、曲香和菠萝香型香气[27]。醇类物质是酵母菌主要的代谢产物，风味多呈现清新的花草香味，其阈值一般很低，对风味的形成有不容忽视的作用[28]；醛类化合物多为果香及花香，阈值较低，赋予香气能力较强，高含量的醛类物质可能会引起异味，乳酸菌发酵后代谢分解了大部分醛类物质，发酵后检测到的苯甲醛具有樱桃味和甜味，对风味起到加强作用[29]；因此，发酵后可赋予蓝莓果汁更丰富的风味。金晓帆[23]研究结果表明，乳酸菌和酵母菌进行混合发酵可以显著增加果汁中醇类和酯类的含量，产生令人愉悦的水果香和芳香味，这是由于蓝莓果汁经过酵母菌发酵生成醇类物质，乳酸菌发酵生成酸类物质，并通过酯化反应生成种类丰富的酯类物质的原因[24-25]。
3 结论
本研究采用酵母菌和乳酸菌分阶段发酵工艺制备发酵蓝莓果汁，通过单因素及正交试验优化蓝莓果汁发酵工艺。最佳发酵条件为：酵母菌接种量2‰；乳酸菌（植物乳杆菌∶干酪乳杆菌）比例为3∶1，接种量为1.5‰，发酵时间18 h，发酵温度34 ℃。通过顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术对发酵前后蓝莓果汁风味物质进行分析，发酵后的蓝莓果汁共检测出挥发性风味物质19种，相较于发酵前的蓝莓果汁，酯类物质增加7种，含量是其44.6倍；醇类物质增加3种，含量是其12.8倍；醛类物质增加1种，含量是其53%。本研究对丰富发酵蓝莓果汁香气成分，改善发酵蓝莓果汁品质具有重要意义。
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