甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）又名洋白菜、卷心菜，由于其具有产量高，肉质厚而硬、致密坚实的特点，适宜发酵制备酸菜调味品或者泡菜。发酵蔬菜中包括大量的微生物，如细菌、酵母、霉菌等，燕平梅等[1]基于宏基因组学技术研究了发酵甘蓝泡菜老汤中的微生物群落结构，发现泡菜老汤中含有大量的乳酸菌，发酵后期以耐酸的乳酸菌为主；张锐等[2]研究榨菜腌渍过程中，发酵初期是明串珠菌，中后期是植物乳杆菌、短乳杆菌；张鲁冀等[3]研究自然发酵的东北酸菜发现，酸菜中有植物乳杆菌、短乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌；汪冬冬等[4-5]研究发酵甘蓝中细菌变化发现，发酵甘蓝中有植物乳杆菌、芽孢杆菌、葡萄球菌等细菌；曾骏等[6-7]鉴定了发酵蔬菜中酵母菌有异常汉逊酵母、德式酵母、螺丝酵母、球拟酵母、假丝酵母等；乳酸菌制造酸性环境利于酵母菌的生长，而酵母菌乙醇代谢产物也有利于乳酸菌的进一步生长，二者具有协同作用[8-9]。王海平等[10]研究四种腌制方式对甘蓝品质的影响，发现纯种湿法可提高发酵速度和乳酸菌菌落数，使亚硝峰峰值快速降低至稳定值，感官评分也最高；王芮东等[11]研究发现，纯种发酵甘蓝总酸最高、感官最佳；刘程惠等[12]发现糖、香辛料和水果的添加可促进甘蓝泡菜总酸的增加，糖对亚硝酸盐有促进作用，而香辛料和水果的添加可抑制其产生；张向美玲等[13]研究发现，菊花溶液含量为1%时，甘蓝发酵成熟时乳酸菌最高，霉菌较少；汪冬冬等[14]研究发现，甘蓝发酵温度范围为10～35 ℃，提高温度利于产酸，缩短发酵时间，温度与乳酸、乙酸含量呈正相关，与柠檬酸、苹果酸和游离氨基酸成反比，低温有利于防止酸败。发酵甘蓝中亚硝酸盐的研究多集中在发酵方式、菌种筛选、起始pH值、影响因子添加、变化规律和累积机理研究等[15-18]。
硒元素具有抗氧化和抗癌作用，可提高免疫力和预防心血管疾病[19]。微生物可以富集和转化无机硒为有机硒，已成为硒生物转化的研究热点。本研究选用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和异常汉逊酵母（Hansenula anomala）为发酵菌株，研究添加亚硒酸钠对接种发酵甘蓝的影响，旨在为提升发酵甘蓝品质提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
平头甘蓝：由湖北聚汇农业开发有限公司提供。
蛋白胨、酵母膏（均为生化试剂），氯化钠、无水乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠、乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
植物乳杆菌、异常汉逊酵母：实验室保藏菌种，筛选自湖北聚汇农业开发有限公司大白菜腌渍池。
1.2 仪器与设备
F-4700荧光分光光度计：日立科学仪器（北京）有限公司；PHSJ-6L型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；PC-420磁力恒温搅拌器：美国Corning公司；QDWZⅠ3000-7D湿法粉碎机：无锡轻大食品有限公司。
1.3 方法
1.3.1 发酵甘蓝的制备
参考屠梦婷[20]的方法并做改良，将发酵坛清洗干净，用体积分数75%的酒精擦拭灭菌，将洗净沥干切分好的甘蓝放入发酵坛中，加4.5%的白砂糖和4.0%食盐水浸渍，同时加入亚硒酸钠（浓度分别设置为0、15 μmol/L、30 μmol/L、45 μmol/L、60 μmol/L、75 μmol/L、90 μmol/L），搅拌均匀，每罐分别加入体积分数3.0%植物乳杆菌种子液（1.65×109CFU/mL）和体积分数2.0%异常汉逊酵母菌种子液（1.13×109 CFU/mL），密封28 ℃发酵6 d，试验重复3次。
1.3.2 发酵甘蓝感官评价标准
发酵甘蓝的感官评价标准见表1。
表1 发酵甘蓝的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of the fermented cabbage
项目评分标准感官评分/分色泽组织状态鲜白色，有光泽色泽较暗，光泽度略差色泽暗，无光泽质地脆嫩，汁液清亮，无杂质质地较脆嫩，汁液稍发绿，有少许杂质不脆，汁液绿色，有杂质26～30 21～25 15～20 26～30 21～25 15～20
续表
项目评分标准感官评分/分风味酸菜应有的滋味和香气，酯香气浓酸菜应有的滋味和香气，有酯香气酸菜应有的滋味和香气，无酯香气味34～40 27～33 20～26
1.3.3 乳酸菌和酵母菌的测定
按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》对发酵甘蓝中乳酸菌进行测定；酵母菌按照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》对发酵甘蓝中酵母菌进行测定。
1.3.4 pH、总酸、总酯、硝酸盐和亚硝酸盐的测定
pH测定采用pH计测定；总酸（以乳酸计）按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中酸碱滴定法测定；总酯（以乙酸乙酯计）参考GB/T 19777—2013《地理标志山西老陈醋》测定；硝酸盐和亚硝酸盐按照GB 5009.33—2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》测定。
1.3.5 总硒和有机硒的测定
总硒和有机硒按照DBS 42/002—2014《富有机硒食品硒含量要求》中方法测定。
1.3.6 数据分析运用处理与Origin 9.5和SPSS 20.0软件对实验数据进行分析处理。
2 结果与分析
2.1 不同亚硒酸钠添加量对甘蓝发酵中乳酸菌和酵母菌数的影响
将从腌渍白菜中筛选的乳酸菌和酵母菌接种于甘蓝中发酵，研究亚硒酸钠的添加量对发酵过程中乳酸菌和酵母菌的影响，结果分别见表2和表3。由表2可知，随着发酵时间的延长，发酵1 d后乳酸菌由106数量级迅速增长至108，而后缓慢增大趋于稳定；添加了亚硒酸钠的实验组，在相同浓度下，发酵1 d后，乳酸菌菌落数显著增大（P＜0.05），且发酵4 d后，菌落数达到峰值后保持稳定；相同发酵时间条件下，随着亚硒酸钠浓度增加乳酸菌菌落数也持续增大，但增速逐渐放缓，在亚硒酸钠浓度为60 μmol/L时，其乳酸菌菌落数增速效果较好，为最适宜添加浓度。
表2 不同亚硒酸钠添加量对甘蓝发酵中乳酸菌数的影响
Table 2 Effect of different sodium selenite addition on number of lactic acid bacteria during cabbage fermentation
注：同列不同字母代表差异显著（P＜0.05）。下同。
亚硒酸钠/（μmol·L-1）0 15 30 45 60 75 90（×106 CFU·g-1）0 d 1.02±0.15a 1.08±0.13a 0.99±0.12a 1.04±0.10a 1.05±0.12a 1.01±0.11a 1.03±0.08a乳酸菌菌落数/（×108 CFU·g-1）1 d2 d3 d4 d5 d6 d 1.23±0.21a 1.50±0.15b 2.14±0.10c 2.46±0.11d 2.63±0.13e 2.71±0.12e 2.75±0.11e 1.32±0.09a 1.61±0.12b 2.23±0.15c 2.55±0.12d 2.70±0.15e 2.78±0.09e 2.79±0.14e 1.37±0.13a 1.68±0.14b 2.32±0.12c 2.61±0.09d 2.79±0.09e 2.84±0.16e 2.83±0.11e 1.39±0.16a 1.71±0.17b 2.35±0.11c 2.64±0.12d 2.84±0.15e 2.88±0.13e 2.87±0.12e 1.36±0.10a 1.74±0.11b 2.36±0.09c 2.66±0.13d 2.87±0.13e 2.90±0.08e 2.92±0.15e 1.34±0.15a 1.75±0.13b 2.39±0.16c 2.68±0.12d 2.86±0.11e 2.89±0.13e 2.93±0.11e
由表3可知，亚硒酸钠对酵母菌的影响与乳酸菌一致，添加了亚硒酸钠，随着发酵时间的延长，酵母菌菌落数显著增加（P＜0.05），在发酵4 d后趋于稳定；相同发酵时间条件下随着亚硒酸钠添加量的增加，酵母菌菌落数逐渐增加，且在亚硒酸钠浓度为60 μmol/L后，酵母菌增速放缓，因此选择亚硒酸钠浓度为60 μmol/L作为后续研究的最佳值。发酵液中的亚硒酸钠可能会被乳酸菌和酵母菌转化利用，进而提高自身代谢速率和抵抗外界环境的能力，进而促进其快速增殖。
表3 不同亚硒酸钠添加量对甘蓝发酵中酵母菌数的影响
Table 3 Effect of different sodium selenite addition on number of yeast during cabbage fermentation
亚硒酸钠/（μmol·L-1）0 15 30 45 60 75 90（×105 CFU·g-1）0 d 0.68±0.07a 0.69±0.10a 0.71±0.12a 0.70±0.10a 0.69±0.16a 0.66±0.14a 0.67±0.14a酵母菌菌落数/（×107 CFU·g-1）1 d2 d3 d4 d5 d6 d 0.96±0.09a 1.26±0.16b 1.97±0.09c 2.33±0.11d 2.58±0.12e 2.62±0.08e 2.65±0.08e 1.12±0.11a 1.33±0.12b 2.08±0.13c 2.45±0.16d 2.65±0.15e 2.70±0.12e 2.69±0.12e 1.15±0.06a 1.39±0.12b 2.15±0.09c 2.49±0.13d 2.72±0.09e 2.74±0.12e 2.76±0.12e 1.19±0.08a 1.42±0.14b 2.20±0.11c 2.52±0.12d 2.73±0.15e 2.76±0.12e 2.78±0.12e 1.18±0.11a 1.44±0.12b 2.19±0.13c 2.53±0.12d 2.76±0.14e 2.77±0.13e 2.80±0.13e 1.17±0.09a 1.43±0.09b 2.23±0.16c 2.52±0.11d 2.74±0.12e 2.76±0.13e 2.79±0.13e
2.2 亚硒酸钠对发酵甘蓝pH和总酸含量的影响
在甘蓝发酵前添加亚硒酸钠，使发酵液浓度为60μmol/L，接种体积分数3.0%植物乳杆菌种子液（1.71×109 CFU/mL）和体积分数2.0%异常汉逊酵母菌种子液（1.08×109CFU/mL），发酵6 d，测定发酵液pH和总酸，结果见图1。
图1 亚硒酸钠对发酵甘蓝pH和总酸含量的影响
Fig. 1 Effect of sodium selenite on pH and total acid contents of fermented cabbage
从图1可知，随着发酵时间延长，甘蓝发酵液总酸稳定升高，相比对照组，发酵1 d后，实验组总酸增速更快、含量更高，达到0.943 g/100 g。实验组和对照组的pH随发酵时间的变化趋势一致，接种发酵后，pH值显著降低，发酵2 d后缓慢减低，但实验组pH降低的更快，发酵6 d后pH值由初始的5.91降低为3.21，使发酵液在更短的发酵时间内pH值更低，这可能会缩短甘蓝发酵时间。添加了亚硒酸钠，促进乳酸菌和酵母菌快速增殖，会代谢产生更多的乳酸、乙酸，造成总酸含量更高，同时，使甘蓝发酵液具有更低的pH值。
2.3 亚硒酸钠对发酵甘蓝总酯的影响
亚硒酸钠对发酵甘蓝总酯含量的影响见图2。由图2可知，实验组和对照组在发酵前2天总酯增长缓慢，2 d后明显增大，发酵6 d后分别增至3.493 g/kg和2.502 g/kg，可见添加亚硒酸钠在发酵第6天时使发酵甘蓝总酯含量提高39.61%。亚硒酸钠促进植物乳杆菌和异常汉逊酵母的快速增殖，提高发酵液总酸含量及其本身耐酸性，代谢更多更高含量的酸和醇类，进而提高总酯的含量。
图2 亚硒酸钠对发酵甘蓝总酯含量的影响
Fig. 2 Effect of sodium selenite on total ester contents of fermented cabbage
2.4 亚硒酸钠对发酵甘蓝总硒和有机硒含量的影响
硒是机体不可或缺的微量元素，有机硒被认为更有利于机体吸收，其存在形式也多种多样，可由机体代谢产生，乳酸菌和酵母菌均具有较强的富硒和有机硒转化能力。添加60 μmol/L亚硒酸钠对发酵甘蓝中总硒和有机硒的影响见图3。由图3可知，发酵1 d时，随着植物乳杆菌和异常汉逊酵母菌的快速增殖，亚硒酸钠大量转化为有机硒，而在发酵2 d后又显著增加，原因可能是此时发酵甘蓝中总酸过高，菌株为了抵抗酸性环境而利用无机硒转化为有机硒合成功能物质以提高自身抗逆性，其他发酵时间段有机硒增加缓慢，发酵6 d后，有机硒为3.80 mg/kg，转化率达80.68%。
图3 亚硒酸钠对发酵甘蓝中总硒和有机硒含量的影响
Fig. 3 Effect of sodium selenite on total selenium and organic selenium contents of fermented cabbage
2.5 亚硒酸钠对发酵甘蓝中硝酸盐和亚硝酸盐含量的影响
甘蓝中含有硝酸盐，尤其是化肥过量的使用，导致甘蓝的硝酸盐含量更高[21-22]，因此在腌制过程中甘蓝会生成更多的亚硝酸盐，相对自然发酵，接种发酵可以使亚硝酸盐含量显著降低[26]。亚硒酸钠对发酵甘蓝中硝酸盐和亚硝酸盐的影响见图4。
图4 亚硒酸钠对发酵甘蓝中硝酸盐和亚硝酸盐含量的影响
Fig. 4 Effect of sodium selenite on nitrate and nitrite contents of fermented cabbage
由图4可知，随着发酵进行，甘蓝中的硝酸盐持续显著下降（P＜0.05），直至降低到0.093 g/kg以下，而添加了亚硒酸钠的甘蓝硝酸盐含量比对照组下降更快，发酵6 d后降至0.057 g/kg；亚硝酸盐含量随发酵时间先增大后减小，对照组在发酵4 d时达到峰值，为9.273 mg/kg，而实验组在提前至发酵3 d时到峰值，为7.058 mg/kg，且峰值更小，这与谷云等[23]的研究一致，因此添加亚硒酸钠既可以促进发酵甘蓝中硝酸盐的快速减少，降低安全隐患，又可以降低亚硝酸盐峰值，使亚硝峰提前达到，降低发酵周期[24-25]。
2.6 添加亚硒酸钠的发酵甘蓝感官评价
发酵6 d制备的发酵甘蓝感官评价见表4。由表4可知，实验组和对照组在色泽和组织状态上无差异，但实验组的酯香气浓郁，感官评分比对照组高7分，因此添加亚硒酸钠基本不影响甘蓝的色泽和组织状态，但明显提升了发酵甘蓝的酯香气。
表4 发酵甘蓝的感官评价结果
Table 4 Sensory evaluation result of fermented cabbage
理化指标色泽（30分）组织状态（30分）风味（40分）实验组对照组鲜白色，有光泽（29分）鲜白色，有光泽（29分）质地脆嫩，汁液清亮（28分）质地脆嫩，汁液清亮（29分）酸菜应有的滋味和香气、酯香气浓（38分）酸菜应有的滋味和香气、有酯香气（31分）
3 结论
通过添加亚硒酸钠，接种植物乳杆菌和异常汉逊酵母发酵甘蓝，研究了亚硒酸钠对发酵过程中植物乳杆菌和异常汉逊酵母菌落数、pH、总酸、总酯、有机硒和亚硝酸盐等指标的影响。结果表明，亚硒酸钠能促进植物乳杆菌和异常汉逊酵母快速增殖，其浓度为60 μmol/L最适宜。添加适宜浓度的亚硒酸钠，甘蓝发酵液总酸增速快，pH也降低的更快，同时提高了总酯含量；通过植物乳杆菌和异常汉逊酵母的生物转化，有机硒转化率高达80.68%；硝酸盐快速下降，亚硝峰峰值降低，且提前1 d出现。
对发酵甘蓝进行感官评价，添加亚硒酸钠对发酵甘蓝的色泽和组织状态无影响，但可显著提升其酯香气。添加亚硒酸钠，提高了发酵甘蓝总酸和总酯含量，显著降低了亚硝酸含量，新增了有机硒，提升了发酵甘蓝感官品质和整体质量。
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