山西老陈醋具有紫黑明亮的色泽，口感绵柔，是一种重要的调味品[1-2]。经发酵，山西老陈醋中积累了丰富的呈味物质，这些物质相互协调，赋予了山西老陈醋“绵、酸、香、甜、鲜”的风格。同时山西老陈醋中还含有功能物质川芎嗪，这让山西老陈醋还具有较高的营养价值。山西老陈醋发酵过程主要分为酒精发酵和醋酸发酵两部分，在这两个阶段中会产生大量风味成分，再通过山西老陈醋独有的熏醅工艺，为老陈醋增色增香，调和五味[3]。山西老陈醋口感、滋味与其中风味物质的种类及含量密切相关[4]，如果能从山西老陈醋的酿造过程中找出这些复杂的呈香、呈味物质的变化规律，将为山西老陈醋酿造过程中的代谢调控以及成品醋的品质控制提供有力的数据支撑。
很多研究对食醋中理化指标、有机酸含量及挥发性风味物质进行了研究。NIE Z Q等[5]研究了山西老陈醋清徐醋厂酒精发酵及醋酸发酵阶段酒精度、温度、总酸和可溶性固形物含量的变化。杨宇霞等[6]在对食醋中有机酸的差异性进行研究，发现山西老陈醋中乙酸和乳酸的含量较高，其比例也具特色。吕利华等[7]对山西老陈醋有机酸进行定性定量研究，同时优化了山西老陈醋的检测方法。吕艳歌等[8]对山西老陈醋醋醅中有机酸进行检测，主要分析了老陈醋醋酸发酵中有机酸含量变化及影响因子。苗志伟等[9]利用气质联用对老陈醋进行了定性分析，共检测出29种挥发性风味物质，并对色谱条件进行了优化。但目前还鲜见有学者对山西老陈醋整个酿造过程中的理化和风味物质进行测定。因此，本实验主要研究了山西老陈醋整个酿造过程的理化指标、有机酸的动态变化，同时对新淋醋的理化指标、有机酸含量及挥发性香气成分进行了检测，旨在优化山西老陈醋的酿造工艺，改善其品质具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品
对山西某醋厂的山西老陈醋整个酿造阶段进行动态采样。分别在酒精发酵第0、1、2、3、5、7、9、11天等距离（5 m）、等量（100 mL）从3个酒精发酵缸内采集约300 mL的酒醪样品，于灭菌广口瓶中均匀混合，分别编号为AF0、AF1、AF2、AF3、AF5、AF7、AF9、AF11；醋酸发酵第0、1、3、5、7、9、10天等距离（5 m）、等量（100 g）从3个醋酸发酵缸中，距醋醅表面30 cm处，各选取4个点共采集约300 g刚完成翻醅的醋醅样品于无菌自封袋中混匀，分别编号为AAF0、AAF1、AAF3、AAF5、AAF7、AAF9、AAF10；上述样品及新淋醋样品存放于-80 ℃保存。
1.1.2 化学试剂
草酸、丙酮酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸（均为色谱纯）：天津市光复精细化工研究所。
1.2 仪器与设备
PB-21酸度计：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；戴安U3000液相色谱仪、戴安ICA-1500离子色谱仪、Trace1300气相色谱仪、TraceISQ质谱分析仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；TDL-4分析天平：北京赛多利斯天平有限公司；Eppendorf离心机：艾本德（中国）有限公司。
1.3 方法
1.3.1 理化指标测定
酒精度、还原糖、水分、总酸、不挥发酸的测定参照国标GB/T 19777—2013《地理标志产品山西老陈醋》中的方法。
1.3.2 外标物的制备及定量方法
参照文献[10]配制草酸、酒石酸、丙酮酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸共8种有机酸的混合标准溶液，存于4 ℃冰箱，使用时稀释于0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。采用峰面积外标法定量分析。
1.3.3 有机酸含量测定
（1）酒醪、醋醅有机酸含量测定
样品预处理：将酒醪、醋醅样品用去离子水浸泡3 h，抽滤，12 000 r/min离心10 min，取上清液于0.22 μm微孔滤膜滤样后进样检测。
酒醪、醋醅样品有机酸含量测定采用高效液相色谱法，其色谱条件如下：流动相为pH=2.7的20 mmol/L NaH2PO4；进样量20 μL；流动速度0.8 mL/min；紫外检测波长210 nm；柱温30 ℃。
（2）新淋醋有机酸含量测定
样品预处理[10]：新淋醋样品用去离子水稀释，0.22 μm微孔滤膜过滤后进样。
新淋醋有机酸含量测定采用离子色谱法，其色谱条件如下：IonPac AS11色谱柱（4 mm×250 mm）；流动相20 mmol/L NaOH；进样量1 mL；流动速度1 mL/min；色谱池温度35 ℃；柱温30 ℃；抑制器电流100 mA。
1.3.4 新淋醋品质分析
对新淋醋的理化指标、有机酸含量及挥发性香气成分进行分析。挥发性香气成分测定采用气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法。
样品处理方法[11]：先将萃取头在进样口270 ℃老化至无杂峰，然后将样品于45 ℃孵化炉中平衡30 min，顶空吸附30 min后将萃取头插入进样口，270 ℃解吸5 min，进行样品中挥发性香气成分萃取。
气相色谱条件：HP-5-MS（30 m×0.25 mm×0.25 mm）色谱柱；载气为氦气（He），纯度99.999%；流量1 mL/min，不分流进样；程序升温：初始温度为40 ℃，保持3 min，4 ℃/min升至160 ℃保持1 min，后以10 ℃/min的速度升至270 ℃保持5 min。
质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，接口温度270 ℃，离子源温度270 ℃，电子能量70 eV，扫描质量范围41～500 amu。
2 结果与分析
2.1 理化指标动态变化
2.1.1 酒精发酵阶段理化指标的动态变化
对山西老陈醋酒精发酵阶段的理化指标进行测定，结果见图1。由图1可知，山西老陈醋酒精发酵阶段酒醪温度在整体上呈现先上升后下降的趋势，发酵第0～1天，由于酵母菌快速繁殖，产生大量热量，酒醪温度由22 ℃迅速上升至30 ℃，而随着发酵地进行酒醪温度逐渐下降，到酒精发酵末期为21 ℃。在酒精发酵第0～1天，酒醪中还原糖、可溶性固形物的含量急剧下降，分别由17.50 g/100 g、19.4%下降至3.50 g/100 g、6.0%，发酵第1～3天，还原糖的含量减少趋势较为缓慢，可溶性固形物的含量出现少量增加，而后均趋于稳定。酒精度和酸度在酒精发酵阶段均呈现上升趋势，发酵第0～1天，酒精度和酸度分别由0和0.29 g/100 g上升至9.3%vol和0.71 g/100 g，其中酒精度的上升趋势最为明显，到发酵末期时，酒精度和酸度的含量分别为8.7%vol和1.42 g/100 g。在酒精发酵第0～1天，酒醪pH下降趋势最为明显，由5.62急剧下降至3.13，这可能是由于酒精发酵初，酵母菌以及乳酸菌、芽孢菌等其他微生物快速生长，从而产生酸性代谢物质，使得酒醪pH迅速降低，而随着发酵，酒醪中的代谢产物种类和含量不断增加，构成了缓冲体系，使得酒醪pH在酒精发酵中期至末期呈现稳定波动变化[12]。
图1 山西老陈醋酒精发酵阶段理化指标的动态变化
Fig. 1 Dynamic changes of physicochemical indexes in alcoholic fermentation of Shanxi aged vinegar
2.1.2 醋酸发酵阶段理化指标的动态变化
山西老陈醋醋酸阶段的理化指标动态变化测定结果见图2。由图2可知，在醋酸发酵阶段，酸度呈现上升趋势，由发酵初1.34 g/100 g上升至末期的5.51 g/100 g，醋酸阶段是山西老陈醋酿造的主要产酸阶段。在此阶段中，不挥发酸的含量呈现出先上升后下降的趋势，这可能是由于在发酵初期，微生物利用糖类产生了乳酸、酒石酸、琥珀酸等不挥发酸，使醋醅中不挥发酸的的含量增加，随着发酵地进行，发生了酯化反应，不挥发酸的含量开始降低。还原糖和氨基氮的含量也呈现先增加后降低趋势，分别在发酵第5天和第7天达到最高值，为2.86 g/100 g和0.20 g/100 g，后降至末期的0.74 g/100 g和0.17 g/100 g。醋酸发酵前加入了大量的麸皮、谷糠等辅料，在酶的作用下发生水解，使得还原糖及氨基酸态氮含量增高；而发酵后期底物被微生物利用，含量降低。水分和可溶性固形物的含量均呈现波动趋势。
图2 山西老陈醋醋酸发酵阶段理化指标的动态变化
Fig. 2 Dynamic changes of physicochemical indexes in acetic acid fermentation of Shanxi aged vinegar
2.2 有机酸含量动态变化
2.2.1 酒精发酵阶段有机酸含量动态变化
在酒精发酵阶段，大量的乳酸沉积起到了改善山西老陈醋口感，减缓山西老陈醋刺激性酸味的作用[13]。除了乳酸，酒精发酵阶段还产生其他有机酸，如酒石酸、丙酮酸、柠檬酸等[14]，多种有机酸共同赋予了山西老陈醋醇和的口感。
对山西老陈醋酒精发酵阶段中有机酸含量进行检测，结果分别见表1和图3。由表1和图3可知，山西老陈醋酒精发酵阶段聚为两支，第一支为发酵第0～5天，第二支为发酵第7～11天。有机酸的总含量在整体上呈现出上升趋势，由酒精发酵第0天的0.455 1 g/100 g上升到发酵末期的1.793 8 g/100 g。其中乳酸在发酵过程中含量均为最高，在发酵末期乳酸的含量达到了1.399 1 g/100 g，占有机酸总量的77.99%，在酒精发酵阶段，乳酸菌作为主要微生物之一，生长繁殖旺盛，代谢产生了大量乳酸[15-16]，乳酸是酒精发酵阶段的主体有机酸。酒精发酵阶段产生的其他有机酸，如酒石酸、丙酮酸和琥珀酸的含量也均有增加，在酒精发酵末期其含量分别为0.0961g/100g、0.0416g/100g和0.0153g/100g；草酸、苹果酸、乙酸和柠檬酸含量在第5天达到峰值之后略有下降，最终含量分别为0.098 7 g/100 g、0.032 9 g/100 g、0.080 8 g/100 g和0.029 2 g/100 g。桂青[17]研究表明，酒石酸和苹果酸在酒精发酵过程中含量增加，这与本研究结果一致。
图3 山西老陈醋酒精发酵阶段有机酸含量动态变化热图
Fig. 3 Heat map of dynamic changes of organic acid contents during alcoholic fermentation of Shanxi aged vinegar
表1 山西老陈醋酒精发酵过程中有机酸含量动态变化
Table 1 Dynamic changes of organic acid contents during alcoholic fermentation of Shanxi aged vinegar
样品AF0 AF1 AF2 AF3 AF5 AF7 AF9 AF11有机酸含量/（g·100 g-1）草酸酒石酸丙酮酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸有机酸总量0.107 3 0.150 8 0.116 4 0.164 5 0.138 1 0.119 2 0.068 5 0.098 7 0.049 3 0.034 9 0.044 7 0.046 5 0.043 1 0.046 3 0.052 0 0.096 1 0.036 4 0.103 5 0.018 5 0.037 0 0.048 0 0.032 8 0.037 2 0.041 6 0.011 5 0.019 4 0.009 8 0.033 7 0.044 7 0.025 2 0.025 6 0.032 9 0.176 3 0.316 5 0.373 2 0.679 0 0.810 1 0.857 3 0.982 6 1.399 1 0.051 1 0.023 7 0.057 4 0.120 0 0.129 5 0.053 7 0.061 3 0.080 8 0.014 3 0.031 1 0.010 0 0.015 9 0.024 4 0.014 6 0.019 0 0.029 2 0.008 9 0.012 7 0.001 1 0.005 9 0.008 2 0.007 7 0.012 4 0.015 3 0.455 1 0.692 6 0.631 2 1.102 4 1.246 1 1.156 8 1.258 5 1.793 8
2.2.2 醋酸发酵阶段有机酸含量动态变化
在山西老陈醋醋酸发酵阶段，大量的有机酸生成，同时还会伴有一些酯化反应，这个过程为山西老陈醋的滋味奠定了一定的基础[18-19]。
山西老陈醋醋酸发酵阶段的有机酸含量变化分别见表2和图4。由表2和图4可知，醋酸发酵阶段也聚为两支，第一支为醋酸发酵第0～3天，第二支为第5～10天。在醋酸发酵过程中，有机酸总含量呈现明显增长趋势，发酵第0天有机酸总含量为1.2533g/100g，而到发酵末期达到了2.3048g/100g。在醋酸发酵阶段，由于醋酸菌大量生长，代谢产生了大量乙酸，其含量在发酵第0天为0.137 4 g/100 g，至发酵末期达到了1.239 3 g/100 g，占有机酸总量的53.77%。另外乳酸的含量也较多，发酵第0天含量为0.418 0 g/100 g，发酵末期上升至0.625 6 g/100 g，占有机酸总量的27.14%。该两种酸为山西老陈醋醋酸发酵阶段的主体有机酸。琥珀酸的含量在发酵第7天达到最高值0.210 3 g/100 g后开始下降，到发酵末期时降为0.045 4 g/100 g。丙酮酸、苹果酸和柠檬酸的含量均有下降，至发酵末期时含量分别为0.008 0 g/100 g、0.0493g/100g和0.0005g/100g。其他有机酸含量变化不明显。
图4 山西老陈醋醋酸发酵阶段有机酸含量动态变化热图
Fig. 4 Heat map of dynamic changes of organic acid contents during acetic acid fermentation of Shanxi aged vinegar
表2 山西老陈醋醋酸发酵过程中有机酸含量动态变化
Table 2 Dynamic changes of organic acid contents during acetic acid fermentation of Shanxi aged vinegar
样品AAF0 AAF1 AAF3 AAF5 AAF7 AAF9 AAF10有机酸含量/（g·100 g-1）草酸酒石酸丙酮酸苹果酸乳酸乙酸柠檬酸琥珀酸有机酸总量0.2453 0.1980 0.1932 0.2575 0.2629 0.2580 0.2622 0.0826 0.0783 0.1089 0.0879 0.0970 0.0807 0.0742 0.1493 0.0935 0.1856 0.0277 0.0122 0.0104 0.0080 0.1386 0.1420 0.1411 0.0642 0.1067 0.0865 0.0493 0.4180 0.5396 0.6853 0.7297 0.6525 0.7287 0.6256 0.1374 0.2829 0.4190 0.9934 1.1361 1.3439 1.2393 0.0546 0.0678 0.0309 0.0132 0.0069 0.0098 0.0005 0.0279 0.0542 0.0807 0.1432 0.2103 0.0633 0.0454 1.2533 1.4566 1.8451 2.3173 2.4850 2.5818 2.3048
2.3 新淋醋的品质分析
2.3.1 新淋醋的理化指标
对新淋醋样品的理化进行检测，结果见表3。由表3可知，新淋醋样品中的还原糖、可溶性固形物及氨基氮的含量分别为1.59 g/100 mL、9.7%及0.11 g/100 mL，pH值、酸度以及不挥发酸分别为3.68、5.29 g/100 mL和1.93 g/100 mL。
表3 山西老陈醋新淋醋中基础理化指标测定结果
Table 3 Determination results of basic physicochemical indexes of new leaching vinegar of Shanxi aged vinegar
项目测定结果项目测定结果pH值酸度/（g·100 mL-1）还原糖/（g·100 mL-1）3.68 5.29 1.59不挥发酸/（g·100 mL-1）可溶性固形物/%氨基酸态氮/（g·100 mL-1）1.93 9.70 0.11
2.3.2 新淋醋中有机酸
新淋醋样品中各有机酸含量检测结果见表4。由表4可知，样品中各有机酸总含量为31.017 2 g/L，其中乙酸的含量最高，为20.983 0 g/L，占有机酸总含量的67.65%。乳酸含量次之，为8.184 5 g/L，占有机酸总含量的26.39%。王芮东等[20]研究表明，乙酸为食醋酸味的主要来源，且山西老陈醋中乙酸的含量占有机酸总量的51.57%，是山西老陈醋的主要呈酸物质。
表4 山西老陈醋新淋醋中有机酸测定结果
Table 4 Determination results of organic acids contents in new leaching vinegar of Shanxi aged vinegar
有机酸含量/（g·L-1）有机酸含量/（g·L-1）草酸酒石酸丙酮酸苹果酸乳酸0.002 1 0.002 6 0.136 8 0.003 3 8.184 5乙酸柠檬酸琥珀酸有机酸总量20.983 0 0.018 8 1.686 1 31.017 2
2.3.3 新淋醋中挥发性香气成分
采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）结合气-质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技术，对新淋醋中挥发性香气成分进行检测，其总离子流色谱图见图5，挥发性香气成分含量检测结果见表5。
图5 新淋醋挥发性香气成分GC-MS分析总离子流图
Fig. 5 Total ion chromatogram of volatile aroma compounds in new leaching vinegar analysis by GC-MS
表5 新淋醋中挥发性香气成分测定结果
Table 5 Determination results of volatile aroma components in new leaching vinegar
化合物风味描述相对含量/%化合物风味描述相对含量/%酯类乙酸乙酯丁二酸单炔酯1-甲氧基-2-丙基乙酸酯2-羟基-4-甲基戊酸乙酯2,3-丁二醇二乙酯庚酸乙酯丁二酸二乙酯辛酸乙酯苯乙酸乙酯2-苯乙基乙酸酯癸酸乙酯十二烷酸甲酯十六烷酸乙酯总相对含量微带果香的酒香香蕉香酒香令人愉悦的香味类似白兰地的香气浓烈的甜蜂蜜香气椰子香酒香和花香奶油香1.32 0.33 1.08 0.50 0.38 0.03 0.26 0.27 0.17 2.27 0.14 0.07 0.37 7.19醛类苯甲醛5-甲基-2-呋喃甲醛苯乙醛壬醛癸醛十一醛5-甲基-2-苯基-2-己烯醛总相对含量杂环类糠醛四甲基吡嗪2(3H)-二氢-5-戊基呋喃酮(E)-6,10-二甲基-5,9-十一烷二烯-2-酮3-苯基呋喃苦杏仁香焙烤香杏仁、樱桃香尖锐的蜜蜡香甜橙油和蜡香木香橙皮香气苦可可、烘烤和青草香焙烤香及甜香焙烤香、甜香桃子香芳香气味2.40 1.37 0.82 0.89 1.14 0.13 0.20 6.95 38.87 2.37 0.29 0.05 0.09
续表
化合物风味描述相对含量/%化合物风味描述相对含量/%醇类2,3-丁二醇苯乙醇总相对含量酸类乙酸总相对含量温和的蜂蜜样香气玫瑰香1.10 2.75 3.85刺激性酸味13.88 13.88 2-甲氧基酚4-乙基-2-甲氧基酚乙苯1,3-二甲基苯甲氧基苯基肟萘十二烷总相对含量具有特殊风味0.10 0.21 0.08 0.31 0.38 0.35 0.10 43.20
由图5和表5可知，在新淋醋样品中共检测出13种酯类、2种醇类、1种酸类、7种醛类、12种杂环类，共35种挥发性香气成分。新淋醋样品中杂环类香气成分的总相对含量最高，为43.20%，其中糠醛和四甲基吡嗪为主要成分，相对含量分别为38.87%和2.37%。酯类、酸类、醛类香气成分含量较高，其相对含量分别为7.19%、13.88%、6.95%，山西老陈醋中的酯类物质大多具有果香和乳香，赋予了山西老陈醋，醛类物质具有一定的焦香味，起到了调和山西老陈醋无味的作用[21-22]。同时新淋醋样品中还含有一定的醇类香气成分，包括了2,3-丁二醇和苯乙醇，总相对含量为3.85%，其中苯乙醇的含量较多，为2.75%。苯乙醇由酵母菌代谢产生，具有蜂蜜香味，起到了改善山西老陈醋的风味的作用[23]。上述风味物质共同存在，相互调和，构成了山西老陈醋的独特风格，使得老陈醋酸口感醇和，酸绵幽香[24-25]。
3 结论
本研究对山西老陈醋酿造过程中理化指标、有机酸含量进行了动态监测，研究其变化规律，并对新淋醋中理化指标、有机酸含量及挥发性香气成分进行分析。结果表明，酒精发酵阶段，酒精度、酸度和有机酸呈上升趋势，还原糖含量呈下降趋势。醋酸发酵阶段酸度和有机酸含量不断增长，还原糖和氨基氮的含量先上升后下降。新淋醋理化指标符合相关国标，有机酸总含量为31.017 2 g/L，共检测到35种挥发性香气成分，其中酯类、醇类、挥发性酸、醛类和杂环类化合物相对含量分别为7.19%、3.85%、13.88%、6.95%和43.20%。本研究对优化山西老陈醋酿造工艺，指导代谢控制提质增效起到重要意义。山西老陈醋是一个非常复杂的体系，多种物质共同作用赋予了其特有的风味。而在山西老陈醋发酵和陈酿的过程中，很多风味物质的代谢通路还不是十分明确，有待进一步研究。
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