桑葚（Fructus mori）属于药食同源浆果，因不耐贮藏而常被加工成果酒等产品。桑葚酒不仅营养丰富且具健康功效，因此受到消费者青睐[1]。然而，桑葚酒存在风味单一的问题[2]，这必将影响桑葚酒在果酒市场的竞争力。果酒风味化合物的种类和含量是影响果酒风味复杂性的重要因素，它受发酵微生物、发酵工艺和果汁化学组成等的影响，因此可通过优选酵母菌株、优化发酵工艺、优化果汁组成等解决果酒风味单一问题[3-5]。
酵母种类及发酵工艺是影响果酒风味的重要因素。研究表明，利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和非酿酒酵母（non-Saccharomyces）混合发酵可有效改善葡萄酒、樱桃酒、榴莲酒和甘蔗酒等果酒的风味和品质[6-9]。优化酵母接种量及其发酵条件等也可改善果酒风味品质[10-11]。氨基酸的种类及浓度对果酒香气的复杂性具有重要影响[12]。浆果中的氨基酸是酵母可同化氮的主要来源之一，可被酵母吸收并用于生长和产生代谢产物，如产生高级醇及酯类物质[13]。不同氨基酸经微生物代谢后可产生不同风味物质进而影响果酒的风味和品质，如支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸）与苯丙氨酸可显著提高葡萄酒中相应高级醇及其乙酸酯的含量[14]。GUTIÉRREZ A等[15]研究发现，在酵母生长稳定期添加精氨酸，可促进酯类物质的生成。增加果汁中苏氨酸含量，则可增加果酒中异戊醇、苯乙醇、乙酸、丙酸的含量，并降低异丁醇的含量[16]。
项目组在前期研究中发现，库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）F2-24与酿酒酵母混合发酵可以显著改善桑葚酒的风味品质。同时，相对于葡萄汁的氨基酸含量，大十桑葚汁所含氨基酸较少，尤其是对香气影响较大的缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸的含量[17]。由此推断，桑葚汁中氨基酸浓度低可能是造成桑葚酒风味单一的原因。鉴于此，本研究在桑葚汁中分别添加缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸及苯丙氨酸，并采用P.kudriavzevii F2-24与酿酒酵母混合发酵桑葚酒，以不添加氨基酸的混合发酵桑葚酒为对照，通过对桑葚酒的理化指标、挥发性风味物质及感官品质进行分析，探究外源添加单一氨基酸对桑葚酒风味品质的影响，以期为高品质桑葚酒开发提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
大十桑葚：来自湖北省武汉市黄陂区，含糖量115.24g/L，含酸量16.75 g/L（以酒石酸计）。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SC：法国LAFFORT公司；库德里阿兹威氏毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）F2-24：本实验室保藏。
1.1.2 试剂
异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸：合肥兰杰科技有限公司；H2SO3、NaCl、环己酮：国药集团化学试剂有限公司。所有试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-IF超净工作台：苏中净化设备有限公司；TQ8040型气相色谱质谱联用仪：日本岛津公司；固相微萃取针头50/30 μm DVB/CAR/PDMS：美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 桑葚酒的发酵流程及操作要点
桑葚除梗破碎→巴氏杀菌→浸渍→发酵→过滤→装瓶→陈酿→桑葚酒
操作要点：桑葚除梗破碎后得到桑葚醪，将其装入15个250 mL发酵瓶中（装液量为80%）。向发酵瓶中分别单独添加400 mg/L的异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸（发酵酒分别命名为Ile-w，Leu-w，Phe-w，Val-w），以不添加氨基酸的发酵酒作为对照（Control）。将装有醪液的发酵瓶置于水浴锅中加热至80 ℃保持45 min，取出冷却后加入60 mg/L SO2，混匀置于4 ℃冰箱过夜。按照1×106 CFU/mL的接种量，同时在桑葚醪中接入活化的库德里阿兹威氏毕赤酵母F2-24和酿酒酵母SC（1∶1）进行混合发酵（20 ℃），直至残糖＜4 g/L（以还原糖计）即进行压榨过滤，在上清液中加入50 mg/L SO2后装入无菌瓶中在4 ℃贮藏。每种酒样做3个重复。
1.3.2 理化指标分析
还原糖采用3,5-二硝基水杨酸法测定[18]；酒精度采用快速氧化法测定[19]；总酸和挥发酸的测定参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。
1.3.3 挥发性风味物质分析
样品处理：取8 mL酒样移入20 mL顶空瓶中，加入2.00 g NaCl，加入10 μL环己酮（0.4 mg/L）作为内标物，在40 ℃条件下于恒温磁力搅拌器中平衡15 min，萃取30 min，后插入GC进样口解吸5 min。
色谱条件：DB-5石英毛细管柱（30m×320 μm，0.25 μm），程序升温：起始温度40 ℃，保持5 min，以3 ℃/min升至130 ℃，然后以4 ℃/min升至250 ℃保持5 min，进样口温度250 ℃，检测器温度260 ℃。
质谱条件：电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量70 eV，灯丝发热电流0.25 mA，离子源温度250 ℃，四极杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，质量扫描范围为30～350 amu。
定性定量分析：通过质谱计算机的Wiley、Nistdemo质谱库定性，各香气物质组分的质谱经计算机谱库检索，结合解析谱图，确定香气物质。采用内标法进行定量。
1.3.4 感官分析
感官分析参照BELDA I等[20]的方法，评议小组由10名成员（6名女性和4名男性）组成，年龄为25～46岁。在室温且通风良好条件下对酒样的外观、香气和口感进行评价。评分等级中的分数表示特性的有无和强弱。其中，“0”表示无此特征，“1～2”表示非常弱，“3～4”表示弱，“5～6”表示中等，“7～8”表示强，“9”表示非常强。
1.3.5 数据处理
数据统计和作图由Microsoft Office 2016和GraphPad Prism 6.0执行。单因素方差分析通过SPSS 19.0完成。利用Multi Experiment Viewer 4.9.0对所有风味物质和酒样进行聚类分析和热图可视化分析。
2 结果与分析
2.1 桑葚酒理化指标分析
桑葚酒理化指标分析见表1。由表1可知，外源添加异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸对桑葚酒的酒精度、总酸和挥发酸无显著影响（P＞0.05），显著降低其残糖含量（P＜0.05）。说明外源添加氨基酸对桑葚酒的理化指标无明显影响，这与ZHONG X F等[21]的研究结果一致。
表1 添加单一氨基酸的桑葚酒的理化指标
Table 1 Physiochemical indexes of mulberry wine with single amino acid addition
注：同一列内字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。
酒样残糖/（g·L-1） 酒精度/%vol 总酸/（g·L-1） 挥发酸/（g·L-1）Control Ile-w Leu-w Phe-w Val-w 2.37±0.02a 1.88±0.09b 1.87±0.07b 1.91±0.11b 1.90±0.22b 5.36±0.06a 5.31±0.12a 5.57±0.18a 5.39±0.07a 5.47±0.13a 13.33±0.98a 13.25±1.08a 13.41±1.26a 13.13±0.84a 13.45±0.62a 1.32±0.07a 1.28±0.22a 1.29±0.09a 1.31±0.08a 1.27±0.11a
2.2 桑葚酒的挥发性风味物质分析
桑葚酒挥发性风味成分及含量测定结果见表2。由表2可知，不同氨基酸添加的桑葚酒中共检测到40种风味化合物，包括7种品种香气化合物和33种发酵香气化合物。与未添加氨基酸的混合发酵葡萄酒的挥发性风味物质含量相比（36.07 mg/L），添加异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及缬氨酸均显著提高了桑葚酒的挥发性风味物质含量（42.38～84.58 mg/L）（P＜0.05）。
表2 添加单一氨基酸的桑葚酒中挥发性风味物质含量
Table 2 Contents of volatile flavor compounds in mulberry wine with single amino acid addition mg/L
化合物感官阈值OAV气味描述ControlIle-w酒样Leu-wPhe-wVal-w品种香气C6化合物1-己醇萜烯类芳樟醇香茅醇松油醇香叶醇香叶基丙酮C13-降异戊二烯类β-紫罗兰酮品种香气总和发酵香气高级醇异丁醇异戊醇活性戊醇1-辛醇1-壬醇1-癸醇正庚醇辛烯醇苯乙醇乙酸酯类乙酸丙酯乙酸丁酯乙酸异丁酯乙酸异戊酯乙酸活性戊酯乙酸苯乙酯脂肪酸乙酯丁酸乙酯己酸乙酯庚酸乙酯辛酸乙酯壬酸乙酯9-癸烯酸乙酯癸酸乙酯月桂酸乙酯0.78±0.06b 0.70±0.04c 0.71±0.01bc 0.73±0.00bc 0.86±0.05a 1.100[22]0.1～1青草、生青味[23]0.07±0.01b 0.25±0.00c 0.09±0.01a 0.04±0.00a 0.05±0.00a 0.09±0.01a 0.31±0.01a 0.11±0.00a 0.04±0.00a 0.04±0.00b 0.09±0.01a 0.26±0.01b 0.10±0.01a 0.04±0.00a 0.05±0.00a 0.05±0.00c 0.25±0.00c 0.07±0.00b 0.04±0.00a 0.04±0.00b 0.06±0.01b 0.25±0.00c 0.10±0.01a 0.04±0.00a 0.04±0.00b 0.025[22]0.100[23]0.11～0.4[24]0.020[25]0.006[26]＞1＞1 0.1～1＞1＞1木香、玫瑰、果香[23]柠檬、木香[23]柑橘、木香[24]柠檬、天竺葵[25]新鲜，花香[26]0.01±0.00b 1.28±0.12ab 0.01±0.00b 1.29±0.10ab 0.01±0.00b 1.26±0.04bc 0.02±0.00a 1.20±0.02c Nd 1.34±0.07a 9×10-5[22]＞1玫瑰、覆盆子、甜味[25]4.41±0.20e 6.64±0.13b 2.23±0.01c 0.13±0.01ab 0.63±0.01b 0.02±0.01b 0.31±0.01a 0.05±0.00b 4.80±0.21b 5.67±0.06b 0.11±0.01c 40.67±0.09a 0.11±0.01bc 0.47±0.07b 0.03±0.01a 0.19±0.03b 0.04±0.00c 4.25±0.16c 5.40±0.13c 45.20±1.61a 1.89±0.01d 0.11±0.00bc 0.46±0.04b 0.03±0.00a 0.23±0.01b 0.03±0.00d 4.17±0.06c 5.10±0.18d 6.37±0.37b 2.29±0.11c 0.09±0.00c 1.03±0.03a 0.02±0.00b 0.30±0.00a 0.08±0.00a 47.46±0.15a 9.70±0.01a 6.44±0.02b 2.61±0.08b 0.15±0.03a 0.99±0.37a 0.03±0.00a 0.31±0.07a Nd 4.61±0.11b 40.000[23]30.000[23]65.000[27]0.900[28]0.058[29]0.400[23]0.2～0.3[25]0.020[25]14.000[28]0.1～1 0.1～1＜0.1 0.1～1＞1＜0.1＞1＞1 0.1～1杂醇油、酒精[23]焦香、麦芽香[23]杂醇、杏仁饼[27]玫瑰、香草、甜味[28]甜橙、酯蜡[29]花香、柑橘脂肪味、花香[25]蘑菇味[25]玫瑰花香、果香[28]0.03±0.02bc Nd 0.06±0.01d 3.30±0.14b 0.20±0.02b 0.26±0.02b 0.01±0.01c 0.02±0.00a 0.13±0.00b 3.19±0.01b 4.82±0.09a 0.34±0.06b 0.09±0.02b 0.01±0.01b 0.09±0.00c 10.42±0.86a 0.22±0.01b 0.25±0.03b 0.06±0.01bc Nd 0.10±0.00c 3.29±0.10b 0.25±0.02b 4.79±0.46a 0.34±0.07a Nd 0.33±0.02a 3.03±0.13b 0.21±0.03b 0.14±0.00b 4.700 1.800 1.600[23]0.030[23]1.500[28]0.250[30]＜0.1＜0.1＜0.1＞1 0.1～1＞1果味、甜味愉悦果香草莓、花香、水果[28]脂肪味、甜果味[23]愉悦的果香、梨香[28]花香、玫瑰[30]0.05±0.01b 0.77±0.06c 0.05±0.00b 4.99±0.23c 0.05±0.01b 0.01±0.00b 3.57±0.11b 0.07±0.01b 0.04±0.00c 0.81±0.07bc 0.05±0.01b 5.36±0.02ab 0.05±0.00b 0.02±0.00a 3.61±0.01b 0.04±0.00c 0.05±0.00b 0.91±0.05a 0.07±0.00a 5.66±0.06a 0.06±0.00a 0.01±0.00b 3.79±0.05a 0.05±0.01c 0.06±0.00a 0.88±0.00ab 0.05±0.00b 5.24±0.03bc 0.04±0.00b Nd 3.71±0.02ab 0.11±0.01a 0.05±0.00b 0.78±0.00c 0.07±0.00a 5.33±0.34abc 0.06±0.01a Nd 3.66±0.14ab 0.06±0.01c 0.020[23]0.005[23]0.220[23]0.002[23]1.300[23]0.100[28]0.200[22]0.800[30]＞1＞1 0.1～1＞1＜0.1 0.1～1＞1＜0.1酸水果、草莓、果味[23]青苹果、花香、紫罗兰[23]菠萝味[23]果味、菠萝、梨、花香[23]蜡质、水果[23]生青味、水果、脂肪味[28]愉悦的水果味、脂肪味[28]甜香、花香、肥皂味[30]
续表
注：同一行内字母不同表示差异显著（P＜0.05），Nd表示通过GC-MS在桑葚酒中没有检测到该化合物。
化合物感官阈值OAV气味描述ControlIle-w酒样Leu-wPhe-wVal-w其他酯类辛酸甲酯脂肪酸异丁酸2-甲基丁酸异戊酸己酸辛酸癸酸醛酮类壬醛癸醛苯乙醛发酵香气总和总和0.01±0.00b 0.02±0.00a 0.02±0.00a Nd 0.02±0.00a 0.200[25]＜0.1强烈的柑橘味[25]0.02±0.00b 0.01±0.00b 0.04±0.01b 0.28±0.02a 1.08±0.00a 0.45±0.02ab 0.02±0.00b 0.03±0.02a 0.01±0.00c 0.18±0.01b 0.93±0.06a 0.40±0.01b 0.02±0.00b 0.01±0.00b 0.13±0.03a 0.13±0.02c 0.99±0.11a 0.42±0.04b 0.01±0.00c 0.02±0.01ab 0.01±0.00c 0.13±0.00c 1.13±0.35a 0.48±0.02a 0.08±0.00a 0.01±0.00b 0.03±0.00bc 0.26±0.01a 1.08±0.01a 0.46±0.02a 2.300[22]0.033 0.030[30]0.420[28]0.500[28]1.000[28]＜0.1 0.1～1 0.1～1 0.1～1＞1 0.11化学味、酚味、脂肪味[25]奶酪味奶酪味、霉味[30]奶酪味，腐臭味[28]脂肪酸味、腐味、奶酪味[28]脂肪味，奶酪味[28]0.03±0.01a 0.01±0.00b 0.23±0.07a 34.79±1.32e 36.07±1.44e 0.02±0.00b 0.02±0.00a 0.10±0.02b 71.76±0.57c 73.05±0.67c 0.01±0.00b Nd 0.10±0.03b 81.02±3.13b 82.28±3.17b 0.03±0.00a 0.02±0.01a 0.20±0.01a 83.38±1.48a 84.58±1.50a 0.03±0.01a 0.01±0.00b 0.16±0.05ab 41.04±1.11d 42.38±1.18d 0.015[23]0.001 0.004[25]＞1＞1＞1生青味、辛辣味[23]新鲜味、生青味花香、蜂蜜[25]
2.2.1 品种香气化合物分析
由表2可知，酒样中共检测到7种品种香气化合物，包括1种C6化合物，5种萜烯类和1种C13-降异戊二烯类化合物，其中风味活性化合物（OAV＞1）有芳樟醇、香茅醇、香叶醇、香叶基丙酮和β-紫罗兰酮。与Control相比，Ile-w中芳樟醇和香茅醇含量显著增加（P＜0.05），1-己醇含量显著减少（P＜0.05）；Leu-w中芳樟醇和香茅醇含量显著增加（P＜0.05）；Phe-w中β-紫罗兰酮含量显著增加（P＜0.05）；而Val-w中风味活性化合物含量降低（P＜0.05），1-己醇含量显著增加（P＜0.05）。另外，除Phe-w中品种香气化合物含量显著降低（减少了0.08 mg/L）外，Ile-w、Leu-w和Val-w中品种香气化合物的含量无明显变化。这说明，外源添加氨基酸仅会影响部分品种香气化合物的含量，对品种香气的总含量影响较小。
2.2.2 发酵香气化合物分析
由表2可知，33种发酵香气化合物中包括了9种高级醇类，6种乙酸酯类、8种脂肪酸乙酯类、1种其他酯类、6种脂肪酸类和3种醛酮类化合物，其中风味活性化合物（OAV＞1）有1-壬醇、正庚醇、辛烯醇、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸、壬醛、癸醛和苯乙醛。与对照相比，Ile-w、Leu-w、Phe-w和Val-w中发酵香气化合物，尤其是高级醇类和乙酸酯类化合物的含量显著提高（P＜0.05）。Ile-w中活性戊醇和乙酸活性戊酯的含量显著提高（P＜0.05），分别为40.67 mg/L和4.82 mg/L，但其异戊醇含量显著降低（P＜0.05）。Leu-w中异戊醇和乙酸异戊酯含量显著增加（P＜0.05），分别为45.20 mg/L和10.42 mg/L，但活性戊醇含量显著降低（P＜0.05）。Phe-w中苯乙醇和乙酸苯乙酯含量显著增加，分别为47.46 mg/L和4.79 mg/L，且苯乙醇含量是对照的9.89倍。Val-w中异丁醇和乙酸异丁酯含量显著提高（P＜0.05），其异丁醇为9.70 mg/L，乙酸异丁酯含量为对照的5.50倍。这主要是因为添加的亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸分别为异戊醇、活性戊醇、苯乙醇和异丁醇的前体物，因此在桑葚酒中单一添加不同种类氨基酸可增加相应高级醇的含量，从而提高其相应的酯类物质含量，这与LYUMUGABE F等[31-32]所报道的一致。
此外，添加不同种类氨基酸不仅可提高桑葚酒中对应高级醇及其酯的含量，还可对异丁醇、1-壬醇、正庚醇、乙酸丙酯和辛酸乙酯等化合物的含量产生显著影响。如除Val-w外，添加其他种类氨基酸的桑葚酒中异丁醇含量均增加，Phe-w和Val-w中1-壬醇含量显著增加（P＜0.05），Ile-w和Leu-w中正庚醇含量显著降低（P＜0.05），而Val-w中乙酸丙酯含量显著增加（P＜0.05）。同时，添加异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸均可提高辛酸乙酯的含量。
2.3 桑葚酒的挥发性风味物质聚类分析
桑葚酒的40种挥发性风味化合物的聚类分析结果如图1。结果表明，5种桑葚酒被分为2类，Ile-w和Leu-w聚为一类，Control、Phe-w和Val-w聚为一类。40种风味物质被分为5类，分别命名为Ⅰ类、Ⅱ类、Ⅲ类、Ⅳ类和V类风味化合物。Control富含部分Ⅱ类风味化合物（苯乙醛、壬醛、正庚醇和辛酸）和部分Ⅳ类风味化合物（己酸、1-己醇和1-辛醇）。Ile-w富含全部Ⅰ类风味化合物（香茅醇、乙酸丁酯、乙酸活性戊酯、活性戊醇和2-甲基丁酸）和部分V类风味化合物（芳樟醇、松油醇和9-癸烯酸乙酯）。Leu-w富含全部V类风味化合物，包括芳樟醇、松油醇、香叶基丙酮、壬酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、癸酸乙酯、辛酸乙酯等萜烯类化合物和酯类化合物。Val-w富含全部Ⅳ类风味化合物（异丁醇、乙酸丙酯、乙酸异丁酯、异丁酸等）、部分Ⅱ类风味化合物（壬醛、正庚醇、1-壬醇、辛酸和癸酸）和部分V类风味化合物（松油醇、壬酸乙酯和庚酸乙酯等）。Phe-w富含全部Ⅱ类和Ⅲ类风味化合物，包括癸醛、苯乙醛、苯乙醇、香叶醇、β-紫罗兰酮、乙酸苯乙酯、丁酸乙酯和月桂酸乙酯等化合物。由此可知，单一添加氨基酸除了影响与其代谢直接相关的高级醇及酯类物质的含量外，也会影响其他香气化合物的代谢。总之，与对照相比，单一添加氨基酸增加了桑葚酒萜烯类、高级醇类及酯类物质的种类与含量。
图1 添加单一氨基酸的桑葚酒中挥发性风味物质聚类分析
Fig. 1 Cluster analysis of volatile flavor compounds in mulberry wine with single amino acid addition
2.4 桑葚酒的感官评定结果
添加单一氨基酸的桑葚酒感官评定结果见图2。结果表明，所有桑葚酒的外观无显著差异（P＞0.05），平均分数均在5.0～5.5分，外观均为紫红色、澄清且有光泽。氨基酸的添加降低了桑葚酒中不良的草本味，这可能与酒样中C6化合物等具有生青味物质减少有关。添加不同种类的氨基酸对桑葚酒的感官品质有不同的影响。Phe-w的花香评分较高，但其果香评分低于Control。与Control相比，Ile-w、Leu-w和Val-w果香评分较高，而花香并无显著改变（P＞0.05）。此外，与Control相比，添加不同氨基酸的桑葚酒的口感评分均显著提高（P＜0.05）。以上结果说明，添加单一氨基酸可以改良桑葚酒的感官品质，但可能会使桑葚酒某一香气较为突出。这与HERNÁNDEZ-ORTE P等[33]在使用酿酒酵母单独发酵葡萄酒中添加单一氨基酸所得结果一致。
图2 添加单一氨基酸的桑葚酒的感官评定结果
Fig. 2 Sensory evaluation results of mulberry wine with single amino acid addition
3 结论
在桑葚汁中添加Ile、Leu、Phe和Val不影响桑葚酒的理化指标，但能显著增加桑葚酒的挥发性风味物质含量（P＜0.05），尤其是发酵香气化合物。不同氨基酸添加可显著影响桑葚酒中不同类型风味化合物的含量，如添加异亮氨酸显著增加了桑葚酒中活性戊醇、乙酸活性戊酯及辛酸乙酯的含量；添加亮氨酸显著增加了桑葚酒中异戊醇、乙酸异戊酯及辛酸乙酯的含量；添加苯丙氨酸显著增加了桑葚酒中β-紫罗兰酮、苯乙醇及乙酸苯乙酯的含量，降低了1-己醇的含量；添加缬氨酸显著增加了桑葚酒中异丁醇和乙酸异丁酯的含量（P＜0.05）。此外，外源添加氨基酸可显著改善桑葚酒的感官品质，但过多添加单一氨基酸可能会导致桑葚酒风味失去平衡。研究结果将为桑葚酒风味品质的改良提供新思路，为其他果酒风味品质改良提供借鉴。
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