近年规模化畜禽养殖业迅速发展，产生大量禽畜粪便固体废弃物[1-2]。畜禽粪便的弃置不仅对生态环境造成严重威胁，而且造成巨大的资源浪费，成为农牧业可持续发展的制约因素[3]。因此，处理畜禽粪便，减少对环境的污染，具有重要的现实意义[4-5]。畜禽粪便中含有大量的有机质、氮、磷、钾、微量元素等营养成分，通过有益微生物的处理转变成活性有机肥[6-8]，既对畜禽粪便无害化处理，又可以产生巨大的经济效益[9-10]。
市场上生物有机肥种类繁多[11]，生物有机肥产品质量的关键指标是产品的有效活菌数[12-14]，有效活菌数不达标等问题导致生物有机肥的质量参差不齐[15]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）具有较强的产胞外蛋白酶的能力，而施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）分解脂肪类物质以及杂环物质的能力很强[16-19]，因此本试验以枯草芽孢杆菌和施氏假单胞菌为复合菌种，以新鲜羊粪、玉米秸秆为原料发酵生产生物有机肥，研究堆肥发酵过程中原材料配比、初始含水率、复合菌液接种量、翻堆频率对有效活菌数的影响，寻求有机肥生产中的最佳发酵工艺条件和参数，以期实现环境效益、经济效益和社会效益最大限度的统一[20-22]。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）YJF1、施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）YJF3：甘肃省微生物菌种保藏中心。复合菌液：将菌株YJF1、YJF3分别接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基500 mL摇瓶中，30 ℃、200 r/min振荡培养24 h，然后将YJF1、YJF3菌悬液按照1∶1制成复合菌液。
新鲜羊粪、玉米秸秆：甘肃绿能农业科技股份有限公司。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，水1 000 mL，pH7.4～7.6，琼脂20.0 g，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。上述培养基不添加琼脂即为牛肉膏蛋白胨液体培养基。
1.2 仪器与设备
YXQ-LS-30SII立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅实业有限公司；SW-CJ-2D超净工作台：苏州净化设备有限公司；SKY-100C恒温摇床：上海苏坤实业有限公司；MJ-150Ⅱ培养箱：上海一恒科技有限公司；AS型干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司；LBH-300T多功能粉碎机：永康科徠尔有限公司。
1.3 方法
1.3.1 以畜禽粪便为基质的生物有机肥发酵工艺流程
新鲜羊粪、玉米秸秆→干燥→粉碎→配料（新鲜羊粪与玉米秸秆按照要求配比、混匀）→增湿（调节物料的初始含水率）→堆量（物料堆积成宽1.5 m、高1 m的条形垄）→接种（接入复合菌液）→发酵（堆体温度控制在45～65 ℃）→翻堆（从发酵的第1天开始按照要求频率进行，直至发酵结束）→有效活菌数检验→干燥
1.3.2 以畜禽粪便为基质的生物有机肥发酵条件优化单因素试验
设置基本发酵条件为原材料质量比（新鲜羊粪∶玉米秸秆=1.0∶1.0），初始含水率为50%，复合菌液（YJF1∶YJF3=1∶1）接种量为15%，翻堆频率1次/1 d。保持其他因素不变，只改变其中一个因素，分别考察原材料质量比（新鲜羊粪∶玉米秸秆=1.0∶2.0、1.0∶1.5、1.0∶1.0、1.5∶1.0、2.0∶1.0），初始含水率（40%、45%、50%、55%、60%），复合菌液接种量（5%、10%、15%、20%、25%），翻堆频率（1次/1 d、1次/2 d、1次/3 d）对生物有机肥发酵的影响。
1.3.3 以畜禽粪便为基质的生物有机肥发酵条件优化正交试验
在单因素试验的基础上，采用4因素3水平正交试验考察原材料配比（新鲜羊粪∶玉米秸秆）、初始含水率、复合菌液接种量、翻堆频率对生物有机肥发酵的影响。正交试验因素与水平见表1。
表1 生物有机肥发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of bio-organic fertilizer
1.3.4 测定方法
有效活菌数：按照NY/T 2321—2013《微生物肥料产品检验规程》中的方法进行测定[23]。
生物有机肥产品技术指标：按照NY884—2012《生物有机肥》中的方法测定[24]。
1.3.5 数据统计与分析
采用Excel 2010进行数据分析，用SPSS 17.0 软件进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 生物有机肥发酵条件优化单因素试验
2.1.1 原材料质量比对生物有机肥发酵的影响
由表2可知，随着原材料配比的变化，生物有机肥的有效活菌数呈先上升后下降的趋势，当新鲜羊粪与玉米秸秆质量比为1.0∶1.5时，生物有机肥的有效活菌数最高，为0.82×108CFU/g。在发酵过程中，添加玉米秸秆主要是提供碳源和增加物料的孔隙度使得微生物的营养处于平衡状态，最大限度满足微生物生长的需要。当玉米秸秆比例较高时，堆肥物料孔隙度大，通风时有利于氧气扩散，可以加快好氧发酵。因此，选择新鲜羊粪与玉米秸秆最适质量比为1.0∶1.5。
表2 原材料质量比对生物有机肥发酵的影响
Table 2 Effect of raw material mass ratio on bio-organic fertilizer fermentation
2.1.2 初始含水率对生物有机肥发酵的影响
由表3可知，随着初始含水率的升高，生物有机肥的有效活菌数呈先上升后略有下降的趋势，当初始含水率为40%～55%时，随着初始含水率的升高，生物有机肥中的有效活菌数也随之增加；当初始含水率为55%时，生物有机肥有效活菌数最高，为1.04×108 CFU/g；当初始含水率为60%时，生物有机肥有效活菌数略低于初始含水率为55%的处理。基质初始含水率是决定固态发酵成败的关键因素之一，微生物生命活动需要不断从周围环境中吸收水分以维持正常的新陈代谢。当含水率过高时，水分取代空气而占据了堆料孔隙，不利于微生物的生长繁殖；当含水率较低时，有机物中的营养成分无法充分溶解，阻碍微生物的生长。因此，选择初始含水率为55%。
表3 初始含水率对生物有机肥发酵的影响
Table 3 Effect of initial water contents on bio-organic fertilizer fermentation
2.1.3 复合菌液接种量对生物有机肥发酵的影响
由表4可知，随复合菌液接种量的增加，生物有机肥有效活菌数逐渐增加；当复合菌液接种量为25%时，有效活菌数达到最高，为1.31×108 CFU/g。当复合菌液接种量为20%、25%时，生物有机肥有效活菌数相差不大。菌株接种量的多少直接影响到降解蛋白质速度的快慢，接种量过少会导致发酵过程缓慢，降解效果不佳；接种量过高，可能菌体过度生长抑制了蛋白酶的分泌，造成蛋白质降解率下降。因此综合考虑，选择复合菌液接种量为20%。
表4 复合菌液接种量对生物有机肥发酵的影响
Table 4 Effect of compound bacteria liquid inoculum on bio-organic fertilizer fermentation
2.1.4 翻堆频率对生物有机肥发酵的影响
由表5可知，随翻堆频率的变化，生物有机肥的有效活菌数逐渐降低；翻堆频率为1次/1 d时生物有机肥的有效活菌数最高，为0.70×108 CFU/g。充足的氧气供应是好氧堆肥的必备条件之一，堆肥系统常用的通风供氧方式有定期翻堆、自然通风和强制通风，其中定期翻堆是目前最经济方便的供氧方式，有利于氧的供给、微生物的分解[25]。因此选择翻堆频率为1次/1 d。
表5 翻堆频率对生物有机肥发酵的影响
Table 5 Effect of turning frequency on bio-organic fertilizer fermentation
2.2 生物有机肥发酵条件优化正交试验
由表6可知，根据正交试验的极差R，各因素对生物有机肥有效活菌数的影响次序为C＞A＞B＞D，即复合菌液接种量＞原材料质量比＞初始含水率＞翻堆频率。生物有机肥发酵条件最优组合为A2B2C3D1，即原材料配比（新鲜羊粪∶玉米秸秆）为1.0∶1.5，初始含水率为55%，复合菌液接种量为25%，翻堆频率为1次/1 d。在此优化条件下，发酵后的生物有机肥有效活菌数达到1.94×108 CFU/g。
表6 生物有机肥发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 6 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions optimization of bio-organic fertilizer
2.3 生物有机肥发酵产品检测结果
按最优条件生产出生物有机肥产品，按标准取样进行指标检测，结果见表7。
表7 生物有机肥产品的技术指标
Table 7 Quality indexes of bio-organic fertilizer product
由表7可知，按最优条件生产出的生物有机肥产品各项指标均符合NY 884—2012《生物有机肥》的要求。
3 结论
以有效活菌数为考察指标，通过单因素试验、正交试验优化生物有机肥发酵条件，得到最优发酵条件为新鲜羊粪∶玉米秸秆=1.0∶1.5（g∶g），初始含水率为55%，复合菌液接种量为20%、翻堆频率为1次/d。在最佳发酵工艺条件下进行堆肥发酵试验，生产出生物有机肥产品有效活菌数达到1.76×108 CFU/g、有机质含量达到47.4%、水分含量为25%、pH值为7.39、粪大肠菌群数86个/g、蛔虫卵死亡率100%，符合NY884—2012《生物有机肥》的技术标准。利用畜禽粪便生产生物有机肥既可有效地解决规模化养殖场畜禽粪便引起的环境污染问题，又可提高经济效益，具有广阔的应用前景。
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