玛咖（Lepidium meyenii Walp.）为十字花科独行菜属一年生或两年生草本植物，原产于高海拔南美安第斯山地区，我国自20世纪初引种，在云南、西藏、新疆和四川等地种植，2011年被中国卫生部批准为新食品原料[1-3]。目前以玛咖作为原料已经开发生产了47种保健食品，其中与中药配伍的有27种，同时还有多项专利对玛咖进行研究[4]。而玛咖作为配制酒原料也已得到普遍应用。玛咖中的化学物质如氨基酸[5-6]、玛咖酰胺和玛咖烯类[7]、芥子油苷和异硫氰酸酯类[8]、生物碱[9]、黄酮[10]等都已有相应的研究进展。玛咖中含有丰富的皂苷类物质，是有效的活性成分之一，作为配制酒中的原材料应用愈加广泛。玛咖中含有丰富的皂苷类物质，是有效的活性成分之一，作为配制酒中的原材料应用愈加广泛。
皂苷类物质研究方法多为高效液相色谱法及高效液相色谱质谱法[11-20]，但目前针对玛咖及其配制酒中总皂苷含量测定的研究较少，不能有效的表征该类产品中总皂苷的含量水平。现有的测定总皂苷标准方法有4项[21-24]，其中保健食品中总皂苷的检测方法主要为《保健食品理化及卫生指标检验与评价技术指导原则（2020年版）》，采用Amberlite-XAD-2大孔树脂（或D-101大孔树脂）纯化样品总皂苷[23]；普通食品多引用T/AHFIA 004—2018《食品中总皂苷含量的测定分光光度法》，采用XAD-2大孔树脂分离纯化[24]。比较已有的方法可以看出，总皂苷的纯化分离均使用树脂填充柱，在检测过程中由于手工填柱导致可重现性和准确度均偏低，操作时间偏长。因此本实验拟采用SPEC18柱作为固相萃取方式进行玛咖酒中总皂苷的纯化分离，通过方法确认来考察该方法的可行性。以期建立一种准确性、重复性高，操作性强的玛咖酒试样中总皂苷检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
玛咖酒（52% vol）：泸州老窖养生酒业有限责任公司；人参皂苷Re标准品（纯度＞98%）：中国药品生物制品检定所；Amberlite-XAD-2大孔树脂：美国Sigma化学公司；D101大孔吸附树脂：成都市科龙化工试剂厂；甲醇（色谱纯）：美国Thermo Fisher公司；中性氧化铝（100～200目）、乙醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；试验用水均为一级水。
1.2 仪器与设备
U-3900紫外可见分光光度计：日本HITACHI公司；MPEva GS平行浓缩仪：睿莱博仪器（广州）有限公司；CPA225D电子天平：德国赛多利斯公司；SPE-12固相萃取装置：上海安谱科学仪器有限公司；SPEC18柱（500 mg填料，3 mL）：天津博纳艾杰尔科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 人参皂苷标准储备溶液溶液配制
称取人参皂苷Re标准品10.0 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容。
1.3.2 最大吸收波长测定及标准曲线绘制
分别取0、0.05mL、0.075mL、0.100mL、0.150mL、0.175mL、0.200 mL人参皂苷Re标准溶液于10 mL比色管中，60 ℃氮吹至干。加0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液，0.8 mL高氯酸后于60 ℃水浴中保温10 min，自来水冷却后加入5 mL冰乙酸，混匀后以试剂空白为参比，用系列标准溶液全波段扫描确定最大吸收波长后，测定系列标准溶液吸光度值。以人参皂苷Re质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.3 大孔树脂填充柱及SPEC18柱预处理
大孔树脂填充柱：取适量Amberlite-XAD-2大孔树脂和D101大孔吸附树脂适量于烧杯中，使用无水乙醇浸泡（覆盖树脂2.5～5.0 cm），缓慢搅拌树脂1 min以充分混合，静置2 h。倒出乙醇，用一级水冲洗，直至无醇味。然后再用等量的无水乙醇洗涤，充分混合静置20 min，再用一级水洗至无醇味，备用。用10 mL玻璃注射器作层析管，分别装入柱高3 cm预处理过的D101大孔吸附树脂和Amberlite-XAD-2大孔树脂，用一级水洗至无醇味后，加入柱高1 cm中性氧化铝。先用25 mL体积分数70%的乙醇洗柱，再用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，待上样。
SPEC18柱：取20 mL一级水淋洗SPEC18柱，然后用20 mL甲醇进行活化，再用20 mL一级水平衡，待水与柱筛板近平时上样。
1.3.4 大孔树脂填充柱及SPEC18柱分离能力比较
取玛咖酒试样20 mL于50 mL蒸发皿中，60 ℃水浴上挥干，5 mL水溶解后洗脱至10 mL容量瓶中，定容为样品提取液。
树脂填充柱分离：取样品提取液2 mL注入填充柱中保留20 min，先用25 mL水洗柱，控制流速1.5～2.0 mL/min，弃去洗脱液，再用25 mL体积分数70%的乙醇洗脱，控制流速1.5～2.0 mL/min，收集洗脱液于蒸发皿中，60 ℃水浴挥干，测定（同1.3.2中标准溶液测定方法）。
SPEC18柱分离：取样品提取液2 mL注入预先处理的SPEC18柱中，保留20 min后控制流速在1滴/s流出，待测液与柱筛板近平时加入10 mL水淋洗SPEC18柱，弃去流出液。加入6 mL体积分数70%的乙醇洗脱SPEC18柱，收集洗脱液于蒸发皿中，60 ℃水浴挥干，测定（同1.3.2中标准溶液测定方法）。
1.3.5 检测方法优化及确认
洗脱液浓度对皂苷含量影响：分别取6组提取液2 mL注入预先处理的SPEC18柱中，保留20 min后控制流速在1滴/s流出，待测液与柱筛板近平时加入10 mL水淋洗SPEC18柱，弃去流出液。分别加入6 mL体积分数为70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇洗脱SPEC18柱，收集洗脱液于蒸发皿中，60 ℃水浴挥干，测定（同1.3.2中标准溶液测定方法）。
方法检出限：参考GB/T 27417—2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中检出限目视评价法[25]。以52% vol的浓香型白酒为空白基质添加已知浓度的标准品溶液，配制成5个质量浓度梯度（5.5mg/L、5.0mg/L、4.5mg/L、4.0mg/L、3.0 mg/L）的人参皂苷Re溶液，进行检测，每个浓度的平行测试次数7次。以正好不能检出目标组分的浓度为参考，将其上一个正好能被检出的浓度作为检出限参考值。计算该浓度下7组测定值平均值m¯及总标准偏差S，检出限即为m¯+3S。
方法正确度：以52% vol的浓香型白酒为空白基质，配制成人参皂苷Re质量浓度分别为5 mg/L、15 mg/L、50 mg/L。分别取上述6组溶液20 mL于水浴锅60 ℃挥干，5 mL水溶解后洗脱至10 mL容量瓶中定容。取2 mL提取液于已预处理的SPEC18柱保留20 min后控制流速在1滴/秒流出，待测液与柱筛板近平时加入10 mL一级水淋洗SPEC18柱，弃去流出液。加入6 mL（95%）乙醇洗脱SPEC18柱，收集洗脱液于10 mL比色管中，60 ℃氮吹至干，显色测定。以平行试验的均值与加入浓度后测定值比较。
方法精密度：分别取6组玛咖酒样各20 mL，60 ℃水浴挥干，用5 mL水溶解后洗脱至10 mL容量瓶中定容。于SPEC18柱净化后60 ℃氮吹至干（同正确度实验方法），显色测定。计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）（n=6）。
方法加标回收率：分别取3组玛咖酒样各20 mL，每组加标量的质量浓度分别为5 mg/L、10 mg/L、25 mg/L，于水浴锅60 ℃挥干，5 mL水溶解后洗脱至10 mL容量瓶中定容。SPEC18柱净化后测定（同正确度实验方法）。其回收率计算方式为回收率=（标准加入测定值-本底值）/标准加入值×100%。
2 结果与分析
2.1 最大吸收波长及标准曲线
按照1.3.2方法进行试验，通过全波段扫描该方法最大吸收波长为560 nm，绘制标准曲线见图1。由图1可知，以人参皂苷Re质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程A=4.457 2C-0.0.052 0（R2=0.990 1），线性范围0～0.20 mg/mL。
图1 人参皂苷Re的标准曲线
Fig.1 Standard curve of ginsenoside Re
2.2 树脂填充柱和SPEC18柱测定结果比较
按照1.3.4的方法进行两次平行试验，比较不同方式固相萃取纯化分离总皂苷的差异，结果见表1。由表1可知，填充柱测定值结果相对偏小且相对标准偏差大于10%，而SPEC18柱结果值稳定且纯化分离结果较好。同时在试验过程中发现填充柱容易出现柱塌陷，流速难以控制，不同批次之间回收结果差异大。因此选用SPEC18柱作为固相萃取纯化柱具有良好的实用性和高效性。
表1 树脂填充柱和SPEC18柱总皂苷测定结果比较
Table 1 Comparison of total saponins determination results between resin packed column and SPEC18 column
2.3 检测方法优化及确认结果
2.3.1 洗脱液浓度对检测结果的影响
按照洗脱液浓度对皂苷含量影响的方法进行试验，考察乙醇洗脱液浓度对总皂苷检测结果的影响，结果见表2。由表2可知，70%～95%乙醇体积分数下总皂苷含量无明显差异，而在试验中发现转移至蒸发皿水浴挥干和比色管中氮吹两种方式下，氮吹法更为稳定且不需再显色后再转移，因此选择体积分数95%的乙醇作为洗脱剂以达到快速氮吹至干的目的。
表2 乙醇洗脱液体积分数对总皂苷测定结果的影响
Table 2 Effect of ethanol elution volume fraction on total saponins determination results
2.3.2 方法检出限
根据试验结果可知，空白基质质量浓度＞5 mg/L以上的阳性检出率为100%，空白基质质量浓度＜5 mg/L的阳性检出率为0%，测定值平均值为4.07 mg/L，计算总标准偏差S为0.18，因此检出限为4.6 mg/L。
2.3.3 方法正确度
方法的正确度试验测定结果见表3。由表3可知，检出限、中值（1～10倍检出限）、高值（10倍检出限）3水平下空白基质加标后平均值与加标浓度比较偏差分别＜20%、＜10%，均在可信任区间范围内，由此可证明该方法系统误差较小。
表3 方法正确度试验测定结果
Table 3 Determination results of method accuracy
2.3.4 方法精密度
方法的精密度试验测定结果见表4。由表4可知，对总皂苷精密度试验的数据进行处理，可得相对标准偏差（RSD）（n=6）为2.24%。试验表明，该方法测定总皂苷含量具有较好的可重复性。
表4 方法精密度试验测定结果
Table 4 Determination results of method precision
2.3.5 方法加标回收率
按照回收率方法进行试验，结果如表5所示。试验表明，以玛咖酒中总皂苷含量（平均值15.60 mg/L）为基础值，3水平下回收率均在90%～103%之间，满足GB/T 27417—2017中1～100 mg/kg质量浓度下回收率偏差要求90%～110%[12]。该方法测定总皂苷含量偏倚度小具有较高的准确性。
表5 方法的加标回收率试验结果
Table 5 Results of standard recovery rate of the method
3 结论
该实验对玛咖酒试样中总皂苷含量测定的前处理方法进行优化，并考察该方法的可行性。结果表明，玛咖酒试样采用SPEC18柱纯化，选用体积分数95%的乙醇作为洗脱剂；人参皂苷Re吸光度值与其质量浓度呈良好的线性关系（R2=0.990 1），线性范围0～0.20 mg/mL；方法检出限为4.6 mg/L；方法正确度的偏差在5 mg/L添加水平＜20%、在15 mg/L及50 mg/L添加水平均＜10%，符合要求；精密度实验结果相对标准偏差（RSD）为2.24%；加标回收率在90%～103%。建立的玛咖酒试样中总皂苷检测方法正确度及精密度高，适用于该产品总皂苷含量的测定。
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