火棘（Pyracantha fortuneana）果实呈红色或橙黄色，单果约0.17 g，果实成熟期系每年的8～12月[1]，其具有较强的消食健脾、降血脂、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、活血止血、增强免疫力以及美白等功效，火棘果类黄酮提取物能有效抑制小鼠B16黑色素细胞、人肝癌细胞Hep G2及人宫颈癌细胞Hela的增殖，且对抑制细胞增殖具有时间-剂量依赖性[2-6]。火棘果提取物可降低三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和丙二醛水平，升高谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性[7]。火棘果实中的水溶性聚合物原花青素及槲皮素与细胞抗氧化活性升高相关，抗氧化活性强弱为火棘果实总黄酮＋维生素C/柠檬酸＞火棘果实总黄酮＞维生素C＞柠檬酸[8-9]。邓如福等[10]研究发现，火棘果中8种人体必需氨基酸及婴儿必需氨基酸种类齐全，含量丰富。
时伟等[11]研究发现，野生火棘果保健果酒发酵的最佳条件为产酯酵母菌株T6-1和耐酸酵母菌株Y2-1的接种比例1∶4（V/V），接种量9%，初始pH值5.5，发酵温度22 ℃，发酵时间8 d，此条件下野生火棘果保健果酒酒精度为11.5% vol～12.0% vol，感官评分达到94.61分。高磊[12]在火棘果浆中加入0.15%柠檬酸和0.12%硫酸钠溶液，在温度34 ℃、接种量10%、酒精度7% vol的条件下发酵，所制得的火棘果醋饮料的香味、口感良好。杨胜敖等[13]利用保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）对火棘果进行发酵，在接种量6%、温度43 ℃条件下发酵24 h，乳酸饮料口感较好。周文斌等[14]研究发现，初始酒精度7% vol、初始pH7、温度32 ℃、接种量12%是较好的发酵条件，火棘果醋醋酸含量可达6.026 g/100 mL。周文斌等[15]用酵母发酵火棘果酒，通过正交试验得出，初始糖度为18%，初始pH值为6，发酵温度为28 ℃，接种量为0.6%是最佳的组合，发酵时间约3 d，可得到酒精含量7.8% vol、糖含量2.6%的火棘果酒。
植物乳杆菌具备较好的耐酸性且无乙醇代谢，适用于果蔬饮品的发酵[16]。因此已有大量研究将模糊综合评判法应用到工艺优化以及配方优化中[17-19]，本研究以植物乳杆菌为菌种，综合考虑各因素对发酵火棘果汁品质的影响，在单因素试验基础上采用模糊综合评判法结合响应面法优化其发酵工艺，探究火棘果汁发酵最佳工艺条件，以期为火棘果的深加工以及火棘果乳酸菌饮料的开发提供数据支撑和技术方法。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
火棘果：贵安新区采摘的野生火棘果；植物乳杆菌：山东中科嘉亿生物工程有限公司；苯酚（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；福林酚试剂（生物试剂）：上海源叶生物科技有限公司；过硫酸钾（分析纯）：成都金山化学试剂有限公司；2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力试剂盒、羟自由基测试试剂盒：南京建成生物工程研究所。
1.2 仪器与设备
1510酶标仪、ST-8R高速冷冻离心机：赛默飞世尔科技有限公司；SHP-160智能生化培养箱：上海三发科学仪器有限公司。
1.3 方法
1.3.1 火棘果汁发酵工艺流程及操作要点
新鲜火棘果→挑选→清洗→打浆→杀菌→添加白砂糖、菌种→发酵→过滤→消毒灌装→火棘果汁成品
操作要点：
挑选：选择无霉烂、无机械损伤、无杂质且成熟度在八成左右的火棘果。
清洗：用无菌蒸馏水中清洗火棘果表面灰尘和杂质后自然晾干水分。
打浆：按原料∶水=1∶3（g∶mL）进行打浆。
杀菌：火棘果浆85 ℃保持30 min进行灭菌处理。
接种：火棘果浆冷却后，将白砂糖和直投式植物乳杆菌菌粉按照不同比例加入到灭菌后的火棘果浆中，搅拌均匀后装入无菌的锥形瓶中，透气膜封口。
发酵：在一定温度条件下进行发酵，当pH达到3.6左右结束发酵。
过滤：发酵结束的火棘果发酵液通过孔径0.45 μm的滤膜，除去果渣。
消毒灌装：过滤后的火棘果汁装瓶，进行巴氏杀菌（瓶中心温度达到65～68 ℃，保持30 min）后，即得火棘果汁成品。
1.3.2 火棘果汁发酵条件优化单因素试验
以感官评分、pH、总黄酮含量、总酚含量及模糊综合评判值为考察指标，以发酵温度30 ℃、白砂糖添加量9%、接种量3%为基准，分别研究发酵时间（24 h、48 h、72 h、96 h、120 h）、白砂糖添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）、发酵温度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、36 ℃）对发酵火棘果汁品质的影响。
1.3.3 火棘果汁发酵条件优化响应面试验
在单因素试验的基础上，以发酵时间（A）、接种量（B）、发酵温度（C）为自变量，以模糊综合评判值（Y）为响应值，根据Box-Behnken中心组合设计原理，利用Design-Expert13.0软件进行响应面试验设计和分析，响应面试验因素与水平见表1。
表1 火棘果汁发酵条件优化Box-Behnken试验设计因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for fermentation conditions optimization of Pyracantha fortuneana juice
1.3.4 感官评价
由10名经过培训的食品专业的学生组成评价小组，按照参考文献[20]制定感官评分标准，分别从色泽、气味、组织状态、口感对发酵火棘果汁进行打分，满分100分，最终结果以感官评分的平均值表示。发酵火棘果汁的感官评分标准见表2。
表2 发酵火棘果汁的感官评分标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented Pyracantha fortuneana juice
1.3.5 分析检测
pH的测定：采用pH计；总黄酮含量的测定：参照参考文献[21]的方法，结果以芦丁当量（rutin equivalent，RE）表示；总酚的测定：参照参考文献[22]的方法，结果以没食子酸当量（gallic acid equivalent，GAE）表示。
DPPH自由基（DPPH·）清除能力、抑制羟自由基（·OH）能力：采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体步骤按试剂盒说明书的方法进行；ABTS自由基（ABTS+·）清除率测定：参照参考文献[24]的方法。
1.3.6 模糊综合评判模型的建立
参照参考文献[23]的方法，在单因素试验基础上，以感官评分、发酵液pH值、总黄酮以及总酚含量为评价指标，利用模糊综合评判法对相应指标进行多目标综合评判，采用极值法对相应的指标进行无量纲转化。因此，因素集X=｛X1，X2，X3，X4｝={感官评价，pH值，总黄酮含量，总酚含量}；权重系数集W=｛W1，W2，W3，W4｝={感官评价，pH值，总黄酮含量，总酚含量}=｛0.35，0.15，0.25，0.25｝。在发酵过程中pH值越小，说明发酵效果越好，因此其无量纲转化函数关系式：xi=ymin/yi；感官评分、总黄酮以及总酚含量越大，发酵力越好，发酵汁品质越好，因此其无量纲转化函数关系式：xi=yi/ymax；模糊综合评判值Y=W1x1+W2x2+W3x3+W4x4
1.3.7 数据处理
利用SPASS 13.0进行数据分析，采用Design-Expert 13.0进行响应面试验设计，采用Origin 9.0作图。
2 结果与分析
2.1 火棘果汁发酵条件优化单因素试验
2.1.1 发酵时间对发酵火棘果汁品质的影响
由表3可知，发酵火棘果汁的感官评分随发酵时间的延长呈现先升高后下降的趋势，其中发酵时间为96 h，感官评分最高为79.5分，与24 h、48 h、72 h均有显著性差异（P＜0.05），但与发酵120 h无显著差异（P＞0.05）；随着发酵时间延长，pH值逐渐降低，当发酵96 h后趋于稳定；总酚在发酵时间为72 h时含量较高，达0.61 mg GAE/mL，与其他组别存在显著性差异（P＜0.05）；而总黄酮含量在发酵24 h时最高，为0.21 mg RE/mL。研究表明，乳酸菌发酵会降低总酚和类黄酮的含量，因为乳酸菌会降解部分酚类[25]。通过模糊综合评判法可知，发酵时间为72 h，此时模糊评判值最高为0.91。因此，选择发酵时间为72 h。
表3 发酵时间对发酵火棘果汁品质的影响
Table 3 Effect of fermentation time on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice
注：表中同一指标上不同字母表示显著性差异（P＜0.05），相同字母表示无显著性差异（P＞0.05）。下同。
2.1.2 白砂糖添加量对发酵火棘果汁品质的影响
由图1a可知，发酵火棘果汁的感官评分随着白砂糖添加量的增加呈先升高后下降趋势，白砂糖添加量为7%时，感官评分最高为77.5分，此条件下pH值为3.37，且与白砂糖添加量9%组无显著性差异（P＞0.05）。由图1b可知，不同白砂糖添加量对火棘果中总酚以及总黄酮含量的影响无显著性差异（P＞0.05），其中白砂糖添加量为9%时，火棘果汁总黄酮含量为0.66 mg RE/mL。由图1c可知，通过模糊综合评判法得出白砂糖添加量为7%，此时模糊综合评判值最高为0.96。因此，选择白砂糖添加量为7%。
图1 白砂糖添加量对发酵火棘果汁品质的影响
Fig.1 Effect of sugar addition on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice
2.1.3 植物乳杆菌接种量对发酵火棘果汁品质的影响
由图2a可知，发酵火棘果汁的感官评分随着接种量的增加呈现先升高后下降的趋势，当接种量为3%时，感官评分最高为81分，与其他组存在显著性差异（P＜0.05）；接种量≥2%时，各组间的pH值无显著性差异（P＞0.05）。由图2b可知，接种量为3%时，发酵火棘果的总黄酮含量最高，达到0.57 mg RE/mL；接种量为4%时，总酚含量高达0.28 mg GAE/mL，与组别5%有显著性差异（P＜0.05）。由图2c可知，通过模糊综合评判法得出，植物乳杆菌的接种量为3%时，此时模糊评判值最大为0.952。因此，接种量选择3%。
图2 接种量对发酵火棘果汁品质的影响
Fig.2 Effect of inoculum on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice
2.1.4 发酵温度对发酵火棘果汁品质的影响
由图3a可知，发酵火棘果汁感官评分随着发酵温度的升高呈现先升高后下降的趋势，当发酵温度为32 ℃时，感官评分最高为83.5分，此条件下pH最低，达到3.14。由图3b可知，总酚随发酵温度的增加先升高后下降，在发酵温度为32 ℃时达最高为0.36 mg GAE/mL，与其他组别无显著性差异（P＞0.05）；总黄酮在发酵温度为30 ℃时含量为最高，为0.65 mg RE/mL，与组别32 ℃无显著性差异（P＞0.05），与其余组别均有显著性差异（P＜0.05）。由图3c可知，通过模糊综合评判法得出，发酵温度为32 ℃时，评判值最高达0.992。因此，选择发酵温度为32 ℃。
图3 发酵温度对发酵火棘果汁品质的影响
Fig.3 Effect of fermentation temperature on the quality of fermented Pyracantha fortuneana juice
2.2 火棘果汁发酵条件优化响应面试验设计与结果
在单因素试验的基础上，选取发酵时间（A）、接种量（B）、发酵温度（C）为自变量因素，Design-Expert 13.0软件对影响因素进行编码组合，利用Box-Behnken组合设计，以模糊综合评判值（Y）为响应值，优化火棘果汁的发酵工艺，响应面试验设计及结果见表4，方差分析结果见表5。
根据响应面试验设计原理，以模糊综合评判值为响应值，利用Design-Expert.13.0软件对表4数据进行分析，最终得到模糊综合评判值与发酵时间、接种量、发酵温度之间的二次多项回归方程：
表4 火棘果汁发酵条件优化响应面试验设计与结果
Table 4 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization of Pyracantha fortuneana juice
续表
由表5可知，在模糊综合评判值与发酵时间、接种量、发酵温度之间的二次多项回归方程模型中：P=0.004 2，结果为极显著（P＜0.01），决定系数R2=0.920 9，校正决定系数为R2Adj=0.819 1，变异系数（coefficient of variation，CV）为4.29%。综上说明，模糊综合评判值的二次回归方程拟合度比较好。在本模型中，一次项B对结果影响显著（P＜0.05），二次项B2、C2对结果的影响极显著（P＜0.01），其余项均为不显著（P＞0.05），根据表中的F值对火棘果汁的模糊综合评判值影响程度依次为B＞A＞C，即菌种接种量＞发酵时间＞发酵温度。
表5 回归模型的方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
以模糊综合评判值为响应值，响应曲面越陡峭表明响应值对发酵条件的改变越敏感，反之则发酵条件的改变对火棘果的品质影响较小。由图4可知，发酵时间与发酵温度、发酵温度与接种量、发酵时间与接种量交互作用较明显。
图4 各因素交互作用对火棘果汁模糊综合评判值影响的响应面和等高线
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of the interaction of various factors on the fuzzy comprehensive evaluation value of Pyracantha fortuneana juice
利用响应面设计软件进行发酵条件优化组合，得到最佳工艺条件为：发酵时间90.73 h、接种量3.23%、发酵温度31.73 ℃，在此条件下，模糊综合评判预测值为0.91。模糊综合评判预测值结合实际情况，将最佳工艺条件调整为：发酵时间90 h、接种量3%、发酵温度32 ℃。在此条件下进行验证试验，模糊综合评判实际值为0.94，得到的发酵火棘果汁感官评分为83分，总黄酮含量为0.43 mg RE/mL，总酚含量为0.38 mg GAE/mL，发酵后pH为3.14，与预测值偏差较小，说明回归模型可以很好的反映发酵的工艺条件。
2.3 发酵前后火棘果汁的抗氧化能力比较
发酵前后火棘果汁的抗氧化能力见表6。由表6可知，发酵后火棘果汁抑制羟自由基能力较发酵前提高了58.59%，DPPH自由基清除能力提高了36.69%，ABTS自由基清除率提高了0.15%，由此可知，植物乳杆菌发酵火棘果有利于提高其抗氧化能力。研究表明总黄酮的羟自由基清除能力与总黄酮的浓度成正比，随着浓度的增加其清除能力也增加[26]。
表6 发酵前后火棘果汁的抗氧化能力
Table 6 Antioxidant ability of Pyracantha fortuneana juice before and after the fermentation
3 结论
以植物乳杆菌为发酵菌株，将火棘果与纯水按1∶3（g∶mL）料水比进行打浆后，制备发酵火棘果汁。以发酵后火棘果汁总黄酮含量、总酚含量、感官评分、pH为评价指标，采用模糊综合评判法结合响应面试验设计，优化得到火棘果的最佳发酵工艺为：白砂糖添加量7%，发酵时间为90 h、接种量为3%、发酵温度为32 ℃。其模糊综合评判值为0.94，发酵火棘果汁感官评分为83分，总黄酮含量为0.43 mg RE/mL，总酚含量为0.38 mg GAE/mL，pH为3.14，发酵后火棘果汁抑制羟自由基能力较发酵前提高了58.59%，DPPH自由基清除能力提高了36.69%，ABTS自由基清除率提高了0.15%。在此工艺条件下，发酵后的火棘果汁感官品质良好，改善了苦涩味，同时提高了火棘果的抗氧化能力，丰富了火棘果深加工技术及其乳酸菌饮料的种类，对野生火棘果资源利用提供一定依据。
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