耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是引起医院感染的多重耐药菌[1-3]，自首次分离出MRSA以来，其临床检出率逐年上升，MRSA能引起心内膜炎、脑膜炎和败血症等危重的致死性疾病[2-5]，MRSA感染已被公认为世界三大最难解决的感染性疾病之一。随着抗生素的滥用，MRSA耐药率不断升高，唐克文等[6]研究表明，MRSA对克林霉素和红霉素的耐药率逐渐增高，因此，MRSA的多重耐药性一直受到密切关注。虽然不断有新的抗MRSA感染药物被发现和研究，体外药敏试验也显示出较好的抗MRSA活性，但其疗效和安全性尚需验证[7-8]，这使得人类需更加重视抗耐药菌株的药物开发研究。
微生物是药物先导化合物最重要的来源[9]，有研究从广西涠洲岛礁栖珊瑚、海绵和海藻等样品中分离获得5种具有丰富代谢产物及抗MRSA活性的菌株[10]。还有研究筛选到一株对MRSA具有较强的抑制作用且稳定性好的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）SC-2，并提取到对耐药鲍曼不动杆菌、大肠杆菌、幽门螺旋杆菌等常见的致病菌具有抗菌活性的化合物[11]。这些抗菌活性物质的发现为本研究提供了理论依据。红树林因其特殊的生态环境、周期性的海水侵袭、河口有机质的沉积和落叶的腐败作用而富含有机质和腐殖质，蕴含了丰富的微生物资源[12]。有研究从南海海桑根际土壤筛选出一株抗MRSA活性较强的真菌，并追踪分离到具有显著抗菌活性的天然产物嗜氮酮[13]。因此，本研究从红树林根部土壤中筛选出具有抗MRSA活性的菌株，根据形态学观察、生理生化试验及16S rDNA基因序列分析对其进行鉴定，采用不同的培养基优选抑菌物质生成条件；以有机溶剂分离纯化抑菌物质物质，采用气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析抑菌物质化学成分，以期获得抗MRSA活性物质，为开发治疗MRSA感染的药物提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品和菌株
土壤样品：海南省红树林根部土壤；指示菌株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）：本实验室提供。
1.1.2 化学试剂
革兰氏染色液试剂盒HB8278：青岛高科技工业园海博生物有限公司；细菌脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）试剂盒（D3350-01）、淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、蛋白酶K（酶活均为1 mg/mL）：上海古朵生物科技有限公司。
1.1.3 培养基
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L。LB固体培养基：LB液体培养基中加琼脂16 g/L。
淀粉培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，可溶性淀粉10 g/L。
缓冲葡萄糖蛋白胨培养基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖5 g/L，NaCl 5 g/L。
尿素培养基：蛋白胨1 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖1 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，0.4%酚红溶液3 mL，琼脂20 g/L，20%尿素溶液100 mL。
克氏双糖铁琼脂培养基（g/L）：乳糖10 g/L，葡萄糖1 g/L，氯化钠5 g/L，柠檬酸铁铵0.5 g/L，硫代硫酸钠0.5 g/L，琼脂12 g/L，酚红0.025 g/L。
营养琼脂（nutrient agar，NA）培养基：牛肉浸膏3g/L，酵母浸膏1 g/L，胰蛋白胨5 g/L，葡萄糖20 g/L。
水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）培养基：牛肉膏5 g/L，淀粉1.5 g/L，酪蛋白水解物17.5 g/L。
ZS培养基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，牛肉膏5 g/L。
葡萄糖酵母牛肉膏（ager yeast dextrose，AYDA）培养基：葡萄糖10 g/L，牛肉膏80 g/L，酵母粉5 g/L。
Landy培养基：葡萄糖20 g/L，L-谷氨酸5 g/L，KH2PO4 1 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，酵母抽提物1 g/L，MnSO45mg/L，CuSO4·5H2O0.16mg/L，FeSO4·7H2O0.15mg/L，L-苯丙氨酸2 mg/L。
金氏培养基（Kings Medium B，KMB）：蛋白胨20 g/L，MgSO4·7H2O2.5g/L，K2HPO4·3H2O1.5g/L，甘油20g/L。
牛肉蛋白胨酵母（beef peptone yeast，BPY）培养基：牛肉膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸膏5 g/L，葡萄糖5 g/L，NaCl 5 g/L。
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培养基：酵母膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。
胰蛋白胨大豆琼脂培养基（trypcasein soy agar，TSA）：胰蛋白胨17 g/L，大豆蛋白胨3 g/L，NaCl 5g/L，K2HPO4·3H2O 2.5 g/L，葡萄糖2.5 g/L。
上述培养基灭菌条件均为121 ℃、20 min。
明胶培养基：牛肉膏蛋白胨液100 mL，明胶15 g/L。112.6 ℃灭菌30 min。
1.2 仪器与设备
GI54DS型全自动高压灭菌锅：南京傲然生物科技有限公司；Microfuge 20R型高速离心机：美国Beckman Coulter Inc公司；HF-safe-1500LC（A2）型生物安全柜：上海力申科学仪器有限公司；JAN-26台式高速冷冻离心机：美国BECKMAN COULTER公司；Core ML型旋转蒸发仪：德国Heidolph Hei-VAP公司；ME204E型电子分析天平：METTLER TOLEDO集团；TONE 96G型梯度聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国耶拿Biomentra公司；BSD-YX 2400型温控回旋立式双层摇床：上海博讯实业有限公司；JY04S-3E型凝胶成像分析系统：北京君意东方电泳设备有限公司；Ni-U+DS-Ri2型正置荧光显微镜：日本Nikon公司。
1.3 方法
1.3.1 抗MRSA活性菌株的筛选
从平板挑取一环指示菌MRSA接种于5mL LB液体培养基中，37 ℃、180 r/min条件下振荡培养18～24 h，采用平板倾注法[14]，将MRSA病原菌种子液接种至LB 固体培养基中，倒平板，晾干备用。
从海南省红树林根部土壤随机取9份样品，每份土样分别取11 g与10 mL无菌水混合，37 ℃、180 r/min条件下振荡15 min，静置5 min后，吸取上层清液按10倍梯度稀释法稀释至10-2、10-3、10-4倍浓度，各取100 μL涂布于上述混有MRSA菌液的培养皿中，37 ℃恒温培养5 d，观察各土壤样品菌株有无抑菌圈，测量并比较抑菌圈大小，以抑菌圈直径大小评判抑菌活性强弱，筛选出抑菌圈最大即抗MRSA活性强的菌株。
1.3.2 筛选菌株鉴定
形态学观察及生理生化反应测定：参考东秀珠等[15]编著的《常见细菌系统鉴定手册》，观察、分析菌落形态、生长特性，通过革兰氏染色、鞭毛染色、芽孢染色和各生化试验对菌株进行检测、鉴定，方法参考《微生物学实验》[16]。
分子生物学鉴定：利用16S rDNA基因序列分析的方法对筛选菌株进一步鉴定。以筛选菌株基因组DNA为模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增16S rDNA。PCR扩增体系：EXTaq酶0.25 μL，10×Buffer 5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μL，MgCl2 4 μL，模板DNA 2 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，双蒸水（ddH2O）32.75 μL。PCR扩增条件为：95 ℃5 min；94 ℃60 s；55 ℃60 s；72 ℃90 s；循环30次，延伸72 ℃10 min。PCR扩增完成后通过1%琼脂糖凝胶检测扩增产物，将获得的特异性DNA送往华大基因科技股份有限公司进行测序，提交序列至GenBank数据库，获得序列号。将测序结果在美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）网站进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对，使用Mega7.0建立发育树获得亲缘远近关系。
1.3.3 筛选菌株产抑菌物质培养基的优选
配制LB、MH、NA、Landy、ZS、KMB、BPY、AYDA、YPD、TSA培养基，从平板挑取筛选抗MRSA活性菌株分别接种至装液量为50 mL/250 mL的上述培养基中，每组设3个重复，37 ℃，200 r/min 振荡培养24 h。将培养液于12 000 r/min离心10 min，取上清液，用0.22 μm膜过滤，收集滤液备用。采用平板倾注法，将MRSA病原菌种子液接种至LB 固体培养基中，在上述平板上分别均匀打孔，孔径为8 mm，每孔分别接入200 μL的上述各种备用滤液，每组设3个重复，37 ℃恒温箱培养24 h，以上述培养基作为相应培养基培养菌株NEL-002后发酵液滤液为抑菌对照组，利用抑菌物质不断溶解经琼脂扩散形成不同浓度梯度，在扩散过程中浓度逐渐减少，直到抑菌物质浓度与细菌对该种抑菌物质的最高耐受浓度相同，此时抑菌物质不再扩散，即形成抑菌圈，以显示其抑菌作用[17-18]，通过抑菌圈大小以判断其是否具有抑菌能力，判定标准：抑菌圈≤7 mm为无抑菌作用，抑菌圈直径＞7 mm为有抑菌作用，抑菌圈直径7～10 mm为钝敏，抑菌圈直径11～20 mm为中敏，抑菌圈直径＞20 mm为高敏。比较不同孔径中滤液抗MRSA活性的敏感性差异，确定筛选抗MRSA活性菌株的最适发酵培养基。
1.3.4 抑菌物质的分离纯化
从平板挑取1环筛选抗MRSA活性菌株接种至装液量为50 mL/250 mL LB液体培养基中，37 ℃、200 r/min振荡培养24 h，发酵液于12 000 r/min 离心10 min，取上清液，分别用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇对上清液进行反复3次的萃取，分别将得到的有机相减压蒸干，得到的沉淀1 mL加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）充分溶解，通过0.22 μm细菌过滤器除菌，收集滤液备用。采用平板倾注法，将MRSA病原菌种子液接种至LB 固体培养基中，倒平板，晾干备用，再在上述平板上分别均匀打孔，孔径为8 mm，每孔分别接入200 μL的上述各种备用滤液，每组设3个重复，37 ℃培养24 h，以乙酸乙酯、石油醚、正丁醇、DMSO为对照组，测量抑菌圈大小，比较不同孔径中滤液抗MRSA活性的差异，确定筛选抗MRSA活性菌株抑菌物质的分离纯化方法，并以此方法粗提发酵液，用二甲基亚砜充分溶解，作为样液，4 ℃保存备用。
1.3.5 抑菌物质的化学成分分析
抗MRSA活性菌株抑菌物质GC-MS分析[19-20]。GC条件：DB25 交联石英毛细管柱（30 m×0.25 mm），柱温为40 ℃，进样温度为250 ℃，柱压为49.7 kPa，载气为高纯度氦气（He），柱流量为1 mL/min，载气流量3 mL/min，进样量0.5 μL，分流比20∶1。MS条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，传输线温度250 ℃，扫描质量范围为20～500 amu。定性定量方法：将各组分的相对保留指数与文献[21-22]中真实化合物的相对保留指数进行比较，并与美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）98文献数据中的相对保留指数进行比较进行定性，采用面积归一法对各组分进行定量。
1.3.6 抑菌物质稳定性研究
热稳定性：将1.3.4中制备的抑菌物质粗提液，在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、121 ℃的不同温度下处理20 min，对照组在37℃温度下处理20 min，每处设置3个重复，过滤后用圆盘扩散法[23]测定其抑菌活性，37 ℃避光恒温培养48 h后测量抑菌圈直径，以对照组（CK）的抑菌圈大小为活性100%，计算各温度下的相对活性。
酸碱稳定性：将1.3.4中制备的抑菌物质粗提液，调节pH值至1～12，对照组为原液pH值，每处设置3个重复，过滤后采用圆盘扩散法测定其抑菌活性，37 ℃恒温培养48 h后测量抑菌圈大小，以对照组（CK）的抑菌圈大小为活性100%，计算各pH组的相对活性。
蛋白酶稳定性：将1.3.4中制备的抑菌物质粗提液，分别加入淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、蛋白酶K，酶的终质量浓度为1 mg/mL，对照组不加任何蛋白酶，每处设置3个重复，过滤后采用圆盘扩散法测定其活性，37 ℃的恒温培养48 h后测量抑菌圈大小。以对照组的抑菌圈大小为活性100%，计算各蛋白酶处理组的相对活性，通过对蛋白酶敏感性判断抑菌物质是否含有蛋白类化合物，其活性是否容易被蛋白酶破坏[24]。
1.3.7 最低抑菌浓和最低杀菌浓度测定
最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低杀菌浓度（minimal bactericidal concentration，MBC）测定：将1.3.4中制备的抑菌物质粗提液，用LB液体培养基稀释至质量浓度为2 000 μg/mL，再依次稀释为1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.62 μg/mL、7.81 μg/mL。采用96孔板法，设置3个重复，以含等量DMSO（5%）的LB液体培养基作对照，37 ℃恒温静置培养24 h后，观察并统计结果，阴性孔显示清亮，阳性孔显示混浊，MIC值为96孔板上横排中未有混浊的最后一孔所对应的浓度。
读取MIC值结果后，分别移取各组药物阴性孔液体50 μL，涂布于LB固体培养基，37 ℃恒温静置培养24 h；读取菌落个数，分别计算对应孔内细菌数量，能够杀死＞99.9%初始细菌含量（＜100 CFU/mL）的最低药物浓度为MBC。
2 结果与分析
2.1 抗MRSA活性菌株的筛选
37 ℃恒温静置培养5 d后，结果见图1。由图1可知，筛选出5株抗MRSA活性菌株，得到抗MRSA生长能力最强的菌株，编号NEL-002，抑菌圈直径约为（28.77±0.42）mm，其他4株抗MRSA活性菌株的抑菌圈直径＜10 mm，抑菌活性较弱，不作为后续研究对象。
图1 菌株NEL-002抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性
Fig.1 Activity of methicillin-resistant Staphylococcus aureus of strain NEL-002
2.2 菌株NEL-002的鉴定
2.2.1 形态学观察
菌株NEL-002在LB固体培养基，37 ℃恒温静置培养18 h，菌株NEL-002的形态特征见图2。
由图2A可知，菌落生长茂盛，似圆形、乳白色，不透明，边缘形态不规则，表面粗糙、较干燥。由图2B可知，经革兰染色，在显微镜下观察到菌体呈紫色，为革兰阳性菌。由图2C可知，经鞭毛染色，在显微镜下观察发现菌体端生鞭毛1根。由图2D可知，经芽孢染色，在显微镜下观察到红色的菌体和绿色的芽孢。
图2 菌株NEL-002的形态特征
Fig.2 Morphological characteristics of strain NEL-002
A：菌落形态；B：革兰氏染色；C：鞭毛染色；D：芽孢染色。
2.2.2 菌株NEL-002生理生化特征
菌株NEL-002其生理生化特征结果见表1。由表1可知，V-P试验阳性、M.R.试验阴性说明该菌株分解利用葡萄糖产生乙酰甲基甲醇，过氧化氢酶试验阳性符合革兰阳性菌特征，淀粉酶试验、尿素酶试验阳性，说明该菌株不产生淀粉酶和尿素酶，不能分解利用淀粉和尿素，明胶液化试验、硫化氢试验阴性，说明该菌株不能分解氨基酸。
表1 菌株NEL-002的部分生理生化特征
Table 1 Some physiological and biochemical characteristics of strain NEL-002
注：“+”表示结果呈阳性；“-”表示结果呈阴性。
2.2.3 菌株NEL-002分子生物学鉴定
菌株NEL-002的16S rDNA PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示，扩增条带在1 000～2 000 bp之间，说明重组质粒构建成功，可回收扩增产物，连接转化，筛选阳性克隆，进行测序和序列分析。经基因测序，提交序列数据至Genbank，序列号为MN640828。使用Mega 7.0建立发育树结果如图4所示，综合NCBI的BLAST搜索，细菌的16S rDNA 进行比对，结果显示菌株NEL-002与萎缩芽孢杆菌同源性达到99%，菌株NEL-002被鉴定为萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophiae）。
图3 菌株NEL-002基于16S rDNA序列PCR扩增产物电泳结果
Fig.3 PCR amplification product electrophoresis results of strain NEL-002 based on 16S rDNA sequence
M：DNA Marker DL2000；1、2：菌株NEL-002、16S rDNA序列PCR扩增产物。
图4 菌株NEL-002基于16S rDNA基因序列构建的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of strain NEL-002 based on 16S rDNA sequences
2.3 菌株NEL-002活性物质研究
2.3.1 最适发酵培养基的筛选
用不同培养基对菌株NEL-002培养，观察其抗菌活性，结果见图5。
由图5可知，菌株NEL-002在TSA、YPD培养基上抑菌圈直径＜7 mm无抑菌活性，在BPY、AYDA培养基上抑菌圈直径在7～10 mm，为钝敏，有微弱抑菌活性，在KMB、ZS、Landy、NA培养基上抑菌圈直径在11～20 mm，为中敏，抑菌活性较强，在MH、LB培养基上抑菌圈直径＞20 mm，为高敏，抑菌活性强，其中在LB液体培养基抑菌圈直径为（25.91±0.38）mm，较其他培养基抗菌活性最强，对照组未出现抑菌圈，无抑菌活性。因此，选用LB液体培养基培养菌株NEL-002。
图5 不同发酵培养基对菌株NEL-002抑菌活性的影响
Fig.5 Effects of different fermentation media on antibacterial activity of strain NEL-002
1：ZS培养基；2：MH培养基；3：LB培养基；4：BPY培养基；5：YPD培养基；6：Landy培养基；7：TSA培养基；8：NA培养基；9：AYDA培养基；10：KMB培养基。
2.3.2 抗菌活性物质的分离纯化
分别采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种有机溶剂对菌株NEL-002发酵上清液进行萃取，石油醚萃取物抗菌活性最强，抑菌圈直径为（25.48±0.01）mm，正丁醇萃取物抑菌圈直径为（17.70±0.00）mm，乙酸乙酯萃取物抑菌圈直径为（17.70±0.02）mm抗菌活性较低，对照组各有机溶剂及DMSO未出现抑菌圈，无抑菌活性。因此，选用石油醚粗提物进行后续实验。
2.3.3 菌株NEL-002抑菌物质化学成分分析
采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析了该菌株粗提物中可能具有抗MRSA活性的化合物，结果见表2。由表2可知，在粗提物中共鉴定出3种已知化合物，包括邻苯二甲酸二丁酯、十甲基环戊硅氧烷和十二甲基环六硅氧烷，与文献[25-26]报道的邻苯二甲酸二丁酯、十甲基环戊硅氧烷和十二甲基环六硅氧烷相关信息基本一致。
表2 菌株NEL-002抑菌物质粗提物主要成分
Table 2 Main components of crude extract of antibacterial material from strain NEL-002
2.3.4 菌株NEL-002活性物质稳定性分析
由图6可知，粗提物经不同温度处理20 min后，在40～80 ℃的温度范围内随着温度的升高，抑菌活性无明显差异，抑菌圈直径均在18.00 mm以上，90 ℃开始抑菌活性随温度升高开始降低，加热至121℃，抑菌圈直径为（9.26±0.05）mm，相对活性49.34%。说明石油醚粗提物不耐高温，但在温度40～80 ℃范围内粗提物热稳定性良好。
图6 菌株NEL-002粗提活性物质热稳定性
Fig.6 Thermal stability of the crude extracts from strain NEL-002
由图7可知，粗提物经不同pH值处理后，pH值在5～10时，抑菌圈直径较大，在碱性条件pH值为8时抑菌圈直径最大，约为（17.87±0.02）mm，pH值在1～4抑菌圈直径较小，与对照组相比抑菌活性降低，相对活性均在62.27%以上，而pH值在11～12条件下无抑菌活性，说明提取菌株NEL-002的粗提物在pH值在5～10范围内稳定性良好。
图7 菌株NEL-002粗提活性物质酸碱稳定性
Fig.7 Acid and alkali stability of the crude extracts from strain NEL-002
由图8可知，分别用淀粉酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、蛋白酶K处理30 min培养后，抗菌活性均较稳定，说明菌株NEL-002产生的抗菌物质对上述蛋白酶不敏感，不易被酶破坏其活性。
图8 不同蛋白酶对菌株NEL-002发酵液抑菌活性的影响
Fig.8 Effect of different protease on antibacterial activity of strain NEL-002
1：胰凝乳蛋白酶；2：胃蛋白酶；3：链霉蛋白酶E；4：蛋白酶K；5：胰蛋白酶；6：淀粉酶；7：CK。
2.4 最低抑菌浓度及杀菌浓度
采用微量稀释法测定，菌株NEL-002粗提活性物质的MIC和MBC，结果如图9所示。在96孔板上横排阴性孔中最后一孔所对应的浓度即最低抑菌浓度（MIC）为62.5 μg/mL。菌落计数为0的平板所对应的阴性孔浓度，即菌株NEL-002粗提活性物质能够拮抗MRSA菌生长的最低杀菌浓度（MBC）为500 μg/mL。
图9 菌株NEL-002粗提活性物质最低抑菌浓度及最低杀菌浓度
Fig.9 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of the crude extracts from strain NEL-002
1：62.5 μg/mL；2：125 μg/mL；3：250 μg/mL；4：500 μg/mL。
3 结论
本研究对红树林根部土壤拮抗微生物进行研究，对土壤悬浮液处理、分离筛选得到具有抗MRSA活性的菌株NEL-002，经细菌形态观察、生理生化特性及16S rDNA 序列分析等方法鉴定该菌株为萎缩芽孢杆菌（Bacillusatrophiae）。菌株NEL-002采用LB液体培养基得到发酵液经石油醚萃取粗体物抗MRSA菌活性最强，且在40～80 ℃、pH在5～10较稳定，对多种蛋白酶不敏感；最低抑菌质量浓度为62.5 μg/mL，最低杀菌质量浓度为500 μg/mL。GC-MS鉴定出抗菌活性物质为十甲基环戊硅氧烷、十二甲基环六硅氧烷及邻苯二甲酸二丁酯。
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