明胶是一种高分子蛋白质生物材料，因其具有良好的成膜性、侧基的高化学反应活性、生物相容性、胶凝态和溶胶态的可逆转变性以及无毒等优良特性，在感光材料、食品、医药、化妆品、造纸、防腐抗蚀、化工等行业广泛使用[1]。明胶生产过程中耗水量高达1 500～2 000 t/t明胶[2]，废水产量庞大，若直接排放将会造成严重的水体和土壤环境污染[3]。另一方面，因明胶生产原料多采用牛骨等动物废弃物，生产过程中又有石灰水中和等步骤，使废水中的Ca2+浓度相对较高[4]；较高浓度Ca2+对细胞有一定毒性，污泥上的钙沉淀会降低微生物的生物活性，导致污水生物处理的效率下降；而且明胶废水中Ca2+会与碳酸根离子结合生成碳酸钙，导致次生废物剩余污泥排放量巨大，占到污水处理量的0.4%[5]。如何有效避免高浓度Ca2+引起的污水处理困扰，是明胶加工企业面临的难题之一[6]。若能将明胶废水中的Ca2+通过特定的微生物菌株进行富集吸附，则既可降低污水中Ca2+浓度，还可以生成高钙微生物进行深度利用。
目前MATHIVANAN K等[7]研究发现，赖氨酸芽胞杆菌（Lysinibacillus）作为生物吸附剂对Pb（II）的生物吸附能力和去除效率分别为43.25 mg/g和86.5%；李倩等[8]从活性污泥中筛选得到耐镉菌株，初步鉴定为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），得到最大铅离子耐受质量浓度为350 mg/L，吸附量为205 mg/g。邹水林[9]筛选得到一株对铜离子有强耐受能力和吸附性能的菌株Citrobacter sp.，该菌株对铜离子的最小抑制浓度可达400 mg/L。周防震等[10]从富硒土壤中筛选出枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），当Na2SeO3溶液质量浓度20 μg/mL，加硒时间5 h，培养温度37 ℃，富硒率为58.3%。曹礼等[11]筛选出耐锌菌株HXZ-1，当锌离子质量浓度为50 mg/L、培养时间为10 h时，最大吸附量为29.1%。但是，有关耐钙菌株的分离和鉴定鲜有报道。
本研究从明胶加工废水中筛选出有一定耐钙能力的微生物菌株N3-1，利用形态学观察、生理生化试验及16S rRNA序列分析法等方法对其进行鉴定，对其生长特性进行研究，并通过单因素试验、Box-Behnken 试验设计优化菌株N3-1的培养条件，以期为高钙含量的水体污染修复提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 废水样品
明胶加工废水样品：取自甘肃阿敏生物清真明胶有限公司污水处理站。
1.1.2 化学试剂
细菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取试剂盒：北京天根生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠、氯化钙（均为分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司。
1.1.3 培养基
液体培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，蒸馏水1 L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
固体培养基：琼脂16 g/L，其余与上述液体培养基相同，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
斜面培养基：琼脂18 g/L，其余同液体培养基，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min。
筛选培养基：称取氯化钙8.33 g（Ca2+含量为3 g/L）、27.78 g（Ca2+含量为10 g/L）、55.56 g（Ca2+含量为20 g/L）、83.33 g（Ca2+含量为30 g/L）、111.11 g（Ca2+含量为40 g/L）、138.89 g（Ca2+含量为50 g/L）分别溶于1 L液体的培养基中，121℃高压蒸汽灭菌20min，即得对应Ca2+浓度的筛选培养基。
筛选培养基Ca2+含量的计算公式如下：
式中：mc（CaCl2）为氯化钙的质量，g；c（Ca2+）为所需的Ca2+含量，g/L；M（CaCl2）为氯化钙的摩尔质量，111 g/mol；M（Ca2+）为Ca2+的摩尔质量，40g/mol；V为培养基体积，L。
1.2 仪器与设备
HVS-1300-U型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；DHP-9082型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SHZ-8Z型恒温振荡器：国华企业集团有限公司；Genesy 96T型基因扩增热循环仪：杭州郎基科学仪器有限公司；UV2600nmA紫外可见分光光度计：尤尼柯仪器有限公司；24LDJ手提式高压蒸汽灭菌器：江阴滨江医疗设备有限公司；PTC-200型聚合酶链式反应（polymeraschainreaction，PCR）仪：美国BIO-RAD公司。
1.3 方法
1.3.1 废水样品处理
从明胶污水处理站的初沉池、好氧池、厌氧池和排放口4个采样点分别取废水样品5 g，然后加入事先准备的30 mL含玻璃珠的无菌水中。
菌悬液的制备：在30℃、120r/min条件下恒温振荡10min。准确量取1 mL菌悬液加入到9 mL无菌水中得到10-1菌悬液，采用同样方法依次稀释得到10-2～10-7梯度菌悬液。
1.3.2 耐钙菌株的初筛
在超净工作台中，取Ca2+含量为3 g/L已灭菌的液体培养基中加入0.05 mL废水样品，放入37 ℃、120 r/min摇床中培养24 h，得到发酵液。用接种环将发酵液采用三区划线法接种至Ca2+含量为3 g/L的固体培养基中，放置于37 ℃恒温培养48 h。经过反复平板划线分离纯化，将筛选出的菌株进行编号，4 ℃斜面保存[12]。
1.3.3 耐钙菌株的复筛
将初筛得到的菌株按2%的接种量依次加入Ca2+含量为10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L的液体培养基中，置于37 ℃摇床中培养24 h，取100 μL培养液用涂布棒均匀涂布在固体培养基中，置于37 ℃恒温培养箱培养48 h，观察菌落形态，挑取高Ca2+含量培养基中生长良好的菌落，最终筛选出耐钙能力强的菌株，接种于斜面培养基，4 ℃保存[13]。
1.3.4 耐钙菌株的鉴定
形态学观察：制备10-6菌悬液均匀涂布于固体培养基上，置于37 ℃恒温培养箱培养48 h会形成单菌落，肉眼及显微镜观察菌落的形状、颜色、粘稠度以及边缘等特征[14]。
生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》[15]、《伯杰氏细菌鉴定手册》[16]，通过吲哚试验、柠檬酸盐试验等方法考察菌株的生理生化特征。
分子生物学鉴定：利用试剂盒提取菌体总DNA[17]；并以该DNA为模板，以27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'为引物[18]，进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR扩增体系（50 μL）：上下游引物各2 μL，Buffer 5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，双蒸水35.5 μL，DNA模板1 μL。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后94 ℃延伸7 min。扩增产物送往上海生工生物工程有限公司测序。将测序的基因序列通过与美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比对，使用MEGA 7.0生物学软件对近似序列进行比对分析，利用邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树[19]。
1.3.5 耐钙菌株培养条件的优化
单因素试验：将筛选菌株接种在30 mL液体培养基中活化18 h后，分别以5%（V/V）的接种量接入已灭菌的装液量为30 mL/250 mL液体培养基中。在37 ℃、120 r/min条件下，分别研究培养时间（0、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、21 h、24 h、27 h、30 h、33 h、36 h、39 h、42 h、45 h），培养温度（20 ℃、26 ℃、32 ℃、37 ℃、45 ℃），培养基初始pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0），初始Ca2+含量（0、0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、3.0 mg/L、4.0 mg/L、5.0 mg/L、6.0 mg/L、7.0 mg/L、8.0 mg/L）对菌悬液吸光度值（OD600nm值）的影响，每个试验进行3次平行。
响应面试验：在上述单因素试验结果的基础上，以培养温度（A），培养基初始pH值（B）和初始Ca2+含量（C）为响应因素，以菌悬液吸光度值（OD600nm值）（Y）为响应值，进行基于Box-Behnken试验设计的3因素3水平优化试验，并根据方程（1）对变量进行编码[20]。
式中：Y是响应值即菌悬液吸光度值（OD600nm值）；β0是常数；βi是线性系数；βii是二次系数；βij是变量之间相互作用系数，Xi和Xj是表示不同自变量。
通过方差分析（analysis of variance，ANOVA）检验回归系数统计的显著性及模型的充分性，自变量之间的相互作用及其影响利用响应面等值线图进行分析。最后多次试验验证优化设计及统计实验的有效性[21]。
1.3.6 数据处理
利用Excel 2010 软件整理基础数据，整理后的数据通过SPSS 20.0软件进行ANOVA分析，用Origin 8.0进行数据分析作图，用Design Expert 8.0.6 软件进行响应面试验设计并进行相关数据分析。
2 结果与分析
2.1 耐钙菌株的筛选
2.1.1 耐钙菌株的初筛
通过从Ca2+含量为3 g/L已灭菌的培养基平板中初筛获得3株菌株，依次编号为N3-1、N3-2、N3-3。
2.1.2 耐钙菌株的复筛
初筛得到的3株菌株依次通过Ca2+含量为10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L的培养基中复筛，菌株N3-2、N3-3在Ca2+含量为20 g/L的培养基中停止生长，菌株N3-1在Ca2+含量为40 g/L的培养基中缓慢生长，在Ca2+含量为50 g/L的培养基中停止生长，通过复筛获得一株耐钙菌株N3-1。
2.2 耐钙菌株的鉴定
2.2.1 菌株N3-1的形态学观察
由图1可知，菌株N3-1在37 ℃固体培养基上培养48 h后形成的表面呈同心环状，边缘锯齿状，灰白色半透明的圆形菌落，菌株N3-1革兰氏染色结果显示为革兰氏阳性菌。
图1 菌株N3-1的菌落（a）及细胞（b）形态
Fig.1 Colony (a) and cell (b) morphology of strain N3-1
2.2.2 菌株N3-1的生理生化特征
菌株N3-1的生理生化试验、糖发酵试验鉴定结果分别见表1和表2。由表1和表2可知，菌株N3-1可分解明胶、淀粉、葡萄糖、果糖、鼠李糖、蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖、甘露醇等，但不能分解木糖。菌株N3-1吲哚试验、甲基红试验、V-P试验结果均为阳性，柠檬酸盐试验结果为阴性。
表1 菌株N3-1的生理生化试验结果
Table 1 Physiological and biochemical tests results of strain N3-1
注：“+”表示结果为阳性，“-”表示结果为阴性。下同。
表2 菌株N3-1的糖发酵试验结果
Table 2 Sugar fermentation tests results of strain N3-1
2.2.3 菌株N3-1的分子生物学鉴定
将菌株N3-1的16S rDNA产物进行测序，测序结果在NCBI上进行BLAST比对，利用MEGA7.0软件中的NJ法对该菌株及与其序列相似度较高的菌株构建系统发育树，结果见图2。由图2可知，菌株N3-1与NCBI GenBank数据库中的Bacillusniabensis（登录号AY998119）同源性最高[22]，相似度为100%。结合形态学特征、生理生化试验及16S rRNA分子生物学分析，菌株N3-1被鉴定为尼阿布芽孢杆菌（Bacillus niabensis）。
图2 基于16S rDNA序列菌株N3-1的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of strain N3-1 based on 16S rDNA sequence
2.3 耐钙菌株N3-1的培养条件优化单因素试验
2.3.1 菌株N3-1的生长曲线
微生物生长有一定的规律性，分为迟缓期、对数期、稳定期和衰退期[23]。由图3可知，菌株N3-1培养0～6 h时菌液澄清，为潜伏期；培养6～21 h菌液开始浑浊，表明菌株的生长速度加快，进入对数期阶段，菌体数出现指数增长；培养21～36 h后菌体浑浊程度相对稳定，未发生明显变化，说明该菌体进入稳定期；培养36 h后吸光度值出现明显的下降趋势，可能由于部分菌体衰亡，说明该菌体进入衰退期。该试验得出菌株N3-1的最佳培养时间为21 h。
图3 菌株N3-1的生长曲线
Fig.3 Growth curve of strain N3-1
2.3.2 培养基初始pH值对菌株N3-1生长的影响
pH值是影响微生物生长的重要因素，与微生物的物质代谢、生命活动有着密切的关系[8]。由图4可知，当培养基初始pH值＜6时，菌悬液OD600nm值随着pH值的增加呈现快速增长趋势；当培养基初始pH值为6～8时，OD600nm值缓慢增加；当培养基初始pH达到8时，菌株N3-1的OD600nm值达到最大，为0.825；当培养基初始pH＞8之后，OD600nm 值随着pH的增加反而下降，过高或过低均不利其生长。因此，菌株N3-1的最适培养基初始pH值为8。
图4 培养基初始pH对菌株N3-1生长的影响
Fig.4 Effect of initial medium pH on strain N3-1 growth
2.3.3 培养温度对菌株N3-1生长的影响
温度是微生物的重要生存因子，在适宜温度范围内，酶促反应速率随着温度的升高逐渐加快，微生物的代谢速率和生长速率也相应提高，适宜的培养温度可以使微生物以最快的生长速率繁殖生长[23-24]。由图5可知，当培养温度在20～37 ℃时，随着培养温度的升高，OD600nm值明显升高，表明菌株N3-1的生长速率随着培养温度的升高而加快，生长情况较好；当培养温度为37 ℃时，菌株的OD600nm值达到最大值，为0.489，表明菌株N3-1的培养温度适宜；当培养温度＞37 ℃之后，OD600nm值明显下降，表明菌株N3-1的生长速率随着温度的升高而下降。因此，菌株N3-1的最适培养温度为37 ℃。
图5 培养温度对菌株N3-1生长的影响
Fig.5 Effect of culture temperature on growth of strain N3-1
2.3.4 初始Ca2+含量对菌株N3-1生长的影响
由图6可知，当菌株N3-1在初始Ca2+含量为0.5～1.5 mg/L时，OD600nm值随着钙离子含量的增加而增大，说明初始Ca2+含量在适当范围内能促进该菌株的生长。当初始Ca2+含量为1.5 mg/L时，OD600nm值达到最大，为0.883。当初始Ca2+含量＞1.5 mg/L之后，OD600nm值呈波动下降趋势，初始Ca2+含量过高会抑制菌株N3-1的生长。因此，菌株N3-1的最适初始Ca2+含量为1.5 mg/L。
图6 初始Ca2+含量对菌株N3-1生长的影响
Fig.6 Effect of initial Ca2+contents on strain N3-1 growth
2.4 菌株N3-1培养条件优化响应面试验
2.4.1 响应面优化试验及结果
在单因素试验基础上，以菌悬液OD600nm值（Y）为响应值，以培养温度（A）、培养基初始pH（B）和初始Ca2+含量（C）为自变量，进行响应面优化试验，Box-Behnken 试验设计及结果见表3，回归模型方差分析见表4。
表3 Box-Behnken试验设计及结果
Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments
表4 回归模型的方差分析
Table 4 Variance analysis of regression model
注：“***”表示对结果影响高度显著（P＜0.001），“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01），“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
利用Design-Expert 8.0.6软件对表3数据进行多元回归方程拟合，得到二次多项回归模型方程为：Y=0.78+0.018A+0.014B-0.050C-4.750E-0.03AB-0.047AC-6.500E-0.03BC-0.48A2-0.076B2-0.14C2
2.4.2 回归模型方差分析
由表4可知，模型F值为375.40，P值＜0.000 1，表明响应面建立的回归模型达到了高度显著水平，失拟项P值=0.052 7＞0.05，不显著，表明模型与试验数据之间拟合度好。模型决定系数R2=0.997 9，调整决定系数R2Adj=0.995 3，说明该模型的拟合度良好且试验误差较小。变异系数（coefficient of variation，CV）为4.07%，在可接受范围内，说明实验操作可行[25]。二次项A2、B2、C2对结果影响高度显著（P＜0.001），一次项C、交互项AC对结果影响极显著（P＜0.01），一次项A对结果影响显著（P＜0.05），其他项对结果影响不显著（P＞0.05）。各因素对菌株N3-1的OD600nm值影响程度高低顺序依次为初始Ca2+含量＞培养温度＞培养基初始pH值。
2.4.3 各因素交互作用对菌株N3-1生长影响的响应面分析
响应曲面图可以直观地反映出两因素交互作用对响应值的影响[26]。通过保持其中两个因素不变而改变另一个因素，以了解两个独立变量之间的交互作用对OD600nm值影响，利用Design-Expert 8.0.6软件绘制各因素交互作用响应面及等高线见图7。
图7 各因素交互作用对菌株N3-1的OD600nm值影响的响应面及等高线
Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on OD600 nm value of strain N3-1
由图7可知，温度与pH值的交互作用下，温度一定时，随着pH值的增加，OD600nm值无显著变化，当pH值一定时，随着温度增大，OD600nm值先升高后降低，表明温度影响比pH明显；温度与初始Ca2+含量的交互影响下，温度一定时，OD600nm值随Ca2+含量的增加轻微地先增加后减少，当初始Ca2+含量一定时，随温度增大，OD600nm值先增后减的变化趋势，表明初始Ca2+含量比温度影响明显；pH值与初始Ca2+含量的交互影响下，控制其他条件不变，初始Ca2+含量增加，OD600nm值先逐渐升高后降低，控制除pH值外的条件不变，pH值增加，OD600nm值无显著变化，由各因素对纯度影响效果的显著性可以得出，初始Ca2+含量比pH值影响明显。
2.4.4 验证试验
理论上菌株N3-1最佳培养条件为培养温度37.2 ℃，初始Ca2+含量1.41 mg/L，初始pH值8.31，在此条件下预测的OD600nm值为0.775。为了便于实际操作，将培养条件修正为培养温度37 ℃，初始Ca2+含量1.40 mg/L，初始pH值8.3。在此优化培养条件下进行3次平行验证试验，OD600nm值实际值为0.768。实测值与理论值的误差为0.90%，差异不显著，表明该模型可以较好的预测菌株的生长条件。
3 结论
本研究从明胶废水中筛选出一株对Ca2+有较强抗性的细菌，经过形态特征的观察、生理生化鉴定及分子生物学鉴定为尼阿布芽孢杆菌（Bacillus niabensis）。通过单因素及响应面优化确定该菌株的最适培养条件为初始Ca2+含量1.40 mg/L，培养温度37 ℃，初始pH 值为8.3。在此优化培养条件下，OD600nm值为0.768。本研究中筛选得到的Bacillus niabensis可以在高Ca2+浓度的水体环境中生长。今后将继续对该菌钙离子的吸附机理进一步研究，可以为微生物修复水体污染提供新的菌种资源。
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