小米营养成分丰富，有悠久的食用历史。许多地方都有将小米粥自然发酵后饮用的习惯，但传统的方法依靠自然发酵，发酵过程不好控制，最终产品的风味也不好，因而利用选育的乳酸菌结合现代加工工艺技术进行益生菌发酵，不仅可以实现定向发酵，而且可显著提高小米淀粉及蛋白质的消化率，提高营养价值，改善口感及风味，使发酵过程容易控制，有利于实现工业化生产[1-3]。
国内外有关小米发酵的研究报道较多，KOUAKOU B等[4]研究发现，小米发酵1～2 d时还原糖的含量显著增加，而蛋白含量降低。SONGRÉ-OUATTARA L T等[5]从传统的ben-saalga中筛选的两株植物乳杆菌A6.1及A6发酵小米花生混合粥，发现植物乳杆菌A6比A6.1的水解及酸化作用更显著，且植物乳杆菌A6.1发酵后小米花生混合粥中有大量的麦芽三糖和四糖。姚世聪等[6]报道小米经过米曲霉和米根霉3.2751发酵后的总酸、还原糖以及氨基酸态氮含量显著提高。秦慧彬等[7]研究发现，单一乳酸菌在1%接菌量下发酵48 h后得到的酸粥风味最佳，自由氨基酸含量达到177.23 μg/mL。张丽萍等[8]得出富含L-乳酸小米发酵饮料的最佳工艺参数为发酵温度36.6 ℃，发酵剂接种量3.15%，氮源添加量2.86%，发酵时间7.76 h。王丹丹[9]研究发现，从传统酸粥中分离得到的乳酸菌和酵母菌（3∶1）按照10%接种量在34 ℃进行24 h发酵后的小米饮料风味最好。张桂芳等[10]研究得到在白砂糖添加量8%，嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和双歧杆菌（1∶1∶2）接种量2.5%，38 ℃条件下发酵9 h得到的发酵小米浆感官评分和多酚含量较高。谭海刚等[11]研究发现，小米与玉米粉以1∶5的比例配比后添加神曲0.26%，添加纤维素酶167 U/g，然后发酵1.5 d后的饮品口感较好。靳志强等[12]将湿热处理后的小米进行发酵，发现赖氨酸、总氨基酸的生物可给性以及抗氧化活性都得到提高。还有相关的研究发酵对小米淀粉结构及物化特性的影响[13-14]，但对熟制小米浆益生菌发酵工艺的研究及特性分析鲜有报道，因而本试验以熟制小米浆为原料，利用植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌为复合菌种进行发酵，以感官评分和菌落总数为评价指标，采用单因素试验和正交试验优化发酵工艺，以期为开发风味独特、富含营养成分且具有一定功能的发酵小米饮品提供理论支持。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
小米（山西晋谷21）、白砂糖：市售；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）：山西农业大学食品科学与工程学院畜产品加工实验室。
蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二钾、柠檬酸氢二铵、乙酸钠、无水硫酸镁、硫酸锰、琼脂、吐温-80、硫酸铜：天津市大茂化学试剂厂；亚甲基蓝、酒石酸钾钠、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、苯酚：索莱宝（北京）有限公司；福林酚（分析纯）：美国Sigma公司。试验所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.2 仪器与设备
CP114电子天平：帝豪斯仪器有限公司；LDZX-50S立式高压蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司；HPP-9272电热恒温培养箱：北京东联哈尔仪器制造有限公司；SHZ-B水浴恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂；LC-406立式冷藏陈列柜：江苏阪神电器股份有限公司；LD5-2B低速离心机：北京雷勃尔医疗器械有限公司；pHSJ-3F pH计：上海精密科学仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 发酵小米浆工艺流程及操作要点
小米→淘洗、浸泡→煮制→磨浆→加糖→杀菌→冷却→接种→发酵→成品
淘洗、浸泡：用适量水将小米淘洗干净，为充分溶出小米中的可溶性物质和煮制方便，淘洗后的小米中加入25倍的水，室温条件下浸泡12 h。
煮制：将浸泡好的小米在95 ℃条件下连续煮制20 min。
加糖、杀菌：为保证产品的安全，磨浆后的小米浆再进行杀菌（90 ℃、5 min），在杀菌过程中加入7%的白砂糖，充分溶解后冷却至37 ℃。
接种、发酵：为了进行充分的发酵，接入4%（V/V）的复合菌种（植物乳杆菌∶鼠李糖乳杆菌=1∶1），充分搅拌均匀后在37 ℃条件下发酵24 h。
1.3.2 单因素试验
在复合菌种接种量4%、发酵时间24 h的条件下，考察不同白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）对发酵小米浆活菌数和感官评分的影响；在发酵时间24 h、白砂糖添加量7%的条件下，考察不同复合菌种（1∶1）接种量（2%、3%、4%、5%、6%）对发酵小米浆活菌数和感官评分的影响；在复合菌种接种量4%、白砂糖添加量7%的条件下，考察不同发酵时间（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h）对发酵小米浆活菌数和感官评分的影响。
1.3.3 正交试验
在单因素试验的基础上，设计3因素3水平正交试验考察各因素对发酵小米浆活菌数和感官评分的影响，正交试验因素与水平见表1。
表1 小米浆发酵条件优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for millet pulp fermentation condition optimization
1.3.4 测定方法
感官评价：取一定量的样品于烧杯中，由10名具有一定专业知识且经过培训的感官评定小组成员依照感官评分标准对其色泽、滋味及气味、状态进行打分。感官评分标准见表2[9-11]。
表2 发酵小米浆的感官评分标准
Table 2 Standards of sensory evaluation of fermented millet pulp
菌落总数：采用稀释平板法[7]，取1 mL样品加入9 mL灭菌生理盐水，依次进行梯度稀释，取合适稀释度的样液1 mL倒入培养皿中，再加入MRS培养基，37 ℃培养48 h后进行菌落计数；
pH值：参考姚世聪等[6]的方法，取一定量的样品用pH计直接测定；
还原糖：采用菲林试剂法[15]，取样品1.0 mL定容至25 mL容量瓶中，加入2.5 mL DNS试剂，充分混匀后沸水浴加热5 min，流水冷却，以去离子水为空白，分光光度计于波长540 nm处测定吸光度值，根据标准曲线计算还原糖的含量。
总酚：采用Folin-Ciocalteu法[12]。取1 mL样品，加入30 mL去离子水和2.5 mL福林酚试剂，充分混合均匀后避光放置6 min，再加入7.5 mL 20%碳酸钠溶液，定容至50 mL。避光室温条件下静置2h，分光光度计于波长760nm处测定吸光度值。
矿物质释放率：参照XIA Q等[16]的方法。取一定量的样品，加入6 mL 体积分数65%的硝酸、2 mL 体积分数30%的过氧化氢在130 ℃条件下消解4 h。过滤取滤液，用去离子水定容至10 mL后用电感耦合等离子体光谱仪测定钙、铁、锌等矿物质的含量，并通过发酵后的游离矿物质含量和总矿物质含量的比值计算矿物质释放率。
氨基酸态氮：三氯乙酸沉淀法[17]，取一定量的样品加入20%三氯乙酸溶液，混匀后静置60 min，4 000 r/min离心10 min，凯氏定氮仪测定上清液中的总氮含量。
2 结果与分析
2.1 白砂糖添加量对小米浆发酵的影响
由图1可知，不同的白砂糖添加量对小米浆发酵后的感官评分和菌落总数影响较小，在添加量为5%时，发酵完成后小米浆菌落总数和感官评分较低，此后随着白砂糖添加量的增加，感官评分和菌落总数不断增加，当白砂糖添加量为7%时，发酵小米浆感官评分达最高值81.44分，菌落总数也达到最高值8.23 lg（CFU/mL）。与张桂芳等[10]报道的在糊化酶解后的小米浆加入8%的白砂糖经过嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和双歧杆菌菌（1∶1∶2）发酵后的感官评分较高的结果接近，与杨健等[18-19]报道的结果一致。复合菌种发酵中白砂糖主要影响发酵后小米饮料甜度和口感，当加入量较低时甜度不够，而加糖量较高时甜度太大，而复合菌种发酵过程中优先利用小米浆中的低聚糖、还原糖产酸，在本试验的浓度范围内，白砂糖对发酵后乳酸菌的数量影响较小。因此，确定白砂糖添加量以7%为宜。
图1 白砂糖添加量对发酵小米浆菌落总数和感官评分的影响
Fig.1 Effect of sugar addition on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp
2.2 接种量对小米浆发酵的影响
由图2可知，不同的接种量对小米浆发酵后的感官评分和菌落总数有一定影响，复合菌种接种量低时，发酵时间延长且发酵不充分，发酵完成后菌落总数较低，代谢产生的酸也较少，致使发酵后的小米浆感官评分较低，随着复合菌种接种量的增加，感官评分和菌落总数都不断增加，当接种量达到4%时，发酵完成后菌落数上升不明显，而感官评分在接菌量为4%时也不再有明显变化，此时发酵小米浆感官评分和菌落总数分别为83.20 lg（CFU/mL）和8.30 lg（CFU/mL）。这一结果与宋忠励[20]研究得出的植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌分别发酵小米饮料时最适接种量的结果一致，而与辛泓均[21]研究得到的嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和副干酪乳杆菌（1∶1∶1）发酵小米饮料最适接种量2%的结果不同，与赵修报等[22]研究得出的酵母菌、乳酸菌共同发酵糊化、糖化的大麦芽、小米、赤小豆、燕麦谷物饮料时2.5%的最适接种量也不同，可能与前体原料处理不同以及所用复合菌种不同有关。因此，确定复合菌种接种量以4%为宜。
图2 复合菌种接种量对发酵小米浆菌落总数和感官评分的影响
Fig.2 Effect of compound strains inoculum on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp
2.3 发酵时间对小米浆发酵的影响
由图3可知，不同的发酵时间对小米浆发酵后的感官评分和菌落总数影响较大，发酵时间太短，发酵不完全，产酸量也不够，致使发酵小米浆菌落总数和感官评分都较低，而延长发酵时间后菌落数和感官评分都不断增加，但在发酵24 h后发酵小米浆菌落总数达到8.45 lg（CFU/mL）且不再随着发酵时间的延长而明显增加，感官评分也在发酵32 h后下降，可能因为小米浆中可利用的低聚糖、还原糖等底物在24 h发酵后大大降低，加上菌体代谢产生的酸等物质对自身的抑制，因而再延长发酵时间菌落数不再明显增加。而感官评分在发酵32 h时达到最高值86.46分，可能因为尽管乳酸菌在24 h后增长不明显，但其自身代谢产生的酶可以促进部分生化反应，进而生成对风味有益的物质。与宋忠励等[20-21]研究得出的结果一致，而与张桂芳等[10，18，23]的结果不一致，可能与选取的发酵菌种不同有关。为降低长时间发酵过程中污染的风险，综合感官评分和菌落数的结果，选择发酵时间为24 h为宜。
图3 发酵时间对发酵小米浆菌落总数和感官评分的影响
Fig.3 Effect of fermentation time on total bacterial count and sensory score of fermented millet pulp
2.4 正交试验
以发酵后的菌落总数作为参照指标，作为活菌型的发酵制品，期望发酵后的活菌数越高越好，通过对正交试验结果分析可知，对菌落总数变化的影响因素顺序为C＞B＞A，即发酵时间＞接种量＞加糖量。可知3种影响因素中对活菌数影响最大的是发酵时间，其次是接种量，影响最小的是加糖量。而以感官评分作为评价指标，各因素对感官评分的影响顺序为C＞B＞A，即发酵时间＞接种量＞加糖量。
表3 小米浆发酵条件优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for millet pulp fermentation condition optimization
9个试验处理中菌落总数最高8.98 lg（CFU/mL）的水平组合为A2B3C3，对应的感官评分为82.12分，而9个试验处理中感官评分最高（87.81分）的水平组合为A1B2C3，对应的菌落总数为8.79 lg（CFU/mL）。二者不一致，但作为发酵饮品，优先考虑感官评分，同时感官评分最高组合A1B2C3对应菌落总数8.79 lg（CFU/mL）和最高菌落总数8.98 lg（CFU/mL）接近，因而综合确定最优的组合为A1B2C3，即白砂糖添加量6.5%、接种量4.0%、发酵时间28 h。
2.5 发酵小米浆的理化指标
为进一步分析发酵后小米浆的理化指标，对发酵前后的小米浆pH值、还原糖含量、总酚含量、矿物质释放率以及氨基酸态氮含量进行比较，结果见表4。
表4 发酵小米浆的部分理化指标
Table 4 Some physicochemical indexes of fermented millet pulp
由表4可知，发酵后小米浆的pH由6.51降低至4.58，而同时淀粉被糊化后经益生菌代谢生成了更多的还原糖，达到0.66 mg/100 g，经过发酵后总酚含量由0.13增加至0.75 μg/mL，可能因为小米中的大部分酚类与蛋白质、淀粉等生物大分子结合变得不可溶，发酵过程中微生物产生的水解酶作用于蛋白质和淀粉，从而释放了复合物中的酚类，与靳志强等[12，24]的研究结果相似。矿物质释放率经过发酵后也大大提高，可能因为植酸、酚类化合物等矿物质螯合剂影响矿物质的释放，发酵过程中微生物产生的植酸酶将植酸降解，从而可提高矿物质的释放率[25]。发酵可以降低抗营养因子含量，同时发酵过程中产生的丰富酶系可以将原料中的蛋白质分解成游离的氨基酸，从而增加蛋白质的消化率，同时部分氨基酸也会增加产品的风味，小米浆经过发酵后的氨基酸态氮大大提高，达到25.76 mg/100 g，说明发酵可以促进小米浆中的蛋白降解，进而提高其营养价值。
3 结论
以发酵小米浆感官评分和菌落总数为评价指标，通过单因素试验和正交试验设计优化了益生菌发酵小米浆的工艺参数，优化后的发酵工艺参数为白砂糖添加量6.5%、接菌量4.0%、37℃条件下发酵28h。在此工艺下发酵后的小米浆具有较高的感官评分和活菌数，同时还原糖含量、总酚含量、矿物质释放率和氨基酸态氮分别由原来的0.28g/100g、0.13 μg/mL、1.28%、6.32 mg/100 g提高至0.66 g/100 g、0.75 μg/mL、5.43%、25.76 mg/100 g。
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