鲜菜类调味品是指有特殊香味被直接用作调味品的新鲜蔬菜，也是部分酱腌菜的原料[1-2]，通常认为包含葱、姜、蒜、香菜、辣椒等，是我国居民日常生活中不可缺少的蔬菜品类，在我国各地都有使用此类蔬菜调味或者作为辅助食材的习惯。鲜菜类调味品的产量已经占到中国蔬菜总产量的7%[3]。为避免种植、生长、采摘、运输过程中的害虫、微生物的侵袭，鲜菜类调味品在种植、生产等环节会使用杀菌剂等农药[4-5]，杀菌剂残留状况不容乐观[6-7]。目前使用率较高的广谱杀菌剂如丙环唑[8]、苯醚甲环唑[9]、多菌灵、甲霜灵、嘧霉胺、三唑酮[10]、戊唑醇[11]、烯酰吗啉、咪鲜胺、甲基硫菌灵等均有一定的毒性。但研究多集中在杀虫剂的检测[13-14]，鲜菜类调味品的检测研究较少。
目前测定蔬菜中杀菌剂的检测方法主要有分光光度法[15]、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[16]、气相色谱法（gas chromatography，GC）[17]、气相色谱质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[18]、液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（liquid chro matography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[19]。常用分析方法中，分光光度法操作简单但选择性不高，易受本底干扰；高效液相法（HPLC）分离度好，但对样品前处理要求高，基质干扰大时易出现假阳性的情况；气相色谱法（GC）、气相色谱质谱联用法（GC-MS）仅适用于易挥发成分的测定，用于难挥发种类的杀菌剂检测时需要提前进行成分衍生化，操作繁琐，耗时长，样品回收率难以保证；液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（LC-MS/MS）具有受基质干扰小，抗干扰能力强等优点，越来越多的用于农药残留的检测。目前国标GB/T 20769—2008《水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法》[19]应用广泛，但该方法未包含常用的杀菌剂种类，且采用旋转蒸发、固相萃取等方法进行样品前处理，因此存在样品、溶剂用量大，操作费时等缺点。近年来，QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前处理方法在农药残留检测领域得到了广泛应用，能够快速净化样品中的干扰杂质[20]。由于鲜菜类调味品中富含的砜类、酯类、醚类、芳香性挥发油等挥发性化合物，常规前处理方式难以去除，对目标化合物的检测造成严重干扰[13]，有文献表明，QuEChERS方法因其快速、简便、具备多种可调的净化试剂等优势，可有效净化此类物质[14]，成为鲜菜类调味品杀菌剂检测理想的前处理方法。
本研究针对鲜菜类调味品复杂基质的特点，摸索并优化QuEChERS前处理方法和液相色谱-三重四级杆质谱联用仪的色谱、质谱条件，最终建立一种可同时测定鲜菜类调味中10种杀菌剂残留的检测方法。通过本研究，可以了解不同鲜菜类调味品中残留的杀菌剂种类和浓度水平，以期检测鲜菜类调味品中杀菌剂残留的种类和水平，同时对完善限量标准的制定提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
葱、姜、蒜、香菜、辣椒：烟台地区市场购买。
乙腈、甲酸（均为色谱纯）：德国默克公司；氯化钠（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；无水硫酸镁（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）（40～63 μm），C18（石墨化碳黑）（graphitized carbon black，GCB）：德国CNW科技公司；实验用水均达到国标GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》中的一级水标准。
丙环唑、苯醚甲环唑、多菌灵、甲霜灵、嘧霉胺、三唑酮、戊唑醇、烯酰吗啉、咪鲜胺、甲基硫菌灵标准品（纯度均＞99%）：农业部环境保护科研监测所。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260-G6460高效液相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪（配有电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI））：美国安捷伦公司；3K15高速冷冻离心机：德国西格玛公司；Multi Reax多通道涡旋振荡器：德国海道尔夫公司；B-400均质仪：瑞士BUCHI公司；AE100电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司。
1.3 方法
1.3.1 样品前处理
将适量样品置于粉碎均质器内粉碎。取5.00 g均质后样品于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋均匀，加入1 g氯化钠，涡旋1 min，静置至分层完全。取5 mL上清液冷藏至4 ℃，加入2 g无水硫酸镁，涡旋1 min至分散完全，4 ℃、10 000 r/min离心5 min，取上清液1.0 mL，加入60 mg PSA涡旋1 min，10 000 r/min离心3 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后用于测定。
1.3.2 标准溶液配制
使用乙腈稀释标准溶液制备混合标准储备溶液（1 000 μg/L）；分别取适量混合标准储备溶液至空白样品基质（检测不同种类的样品需使用相应种类的空白样品基质）中，获得基质匹配标准系列（目标质量浓度0.2μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、40.0μg/L、60.0μg/L）。
1.3.3 色谱条件
Agilent ZORBAX SB-Aq液相色谱柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm），采用梯度洗脱方法，流动相A为0.05%（体积分数，下同）甲酸/水，B为0.05%甲酸/乙腈，梯度洗脱程序见表1。设置后运行时间2min，流速为0.300mL/min，进样量为2.0μL，柱温为40 ℃。
表1 梯度洗脱程序
Table 1 Programs of gradient elution
1.3.4 质谱条件
电喷雾离子源、正离子模式扫描（ESI+），离子源温度300 ℃，离子喷雾电压4 000 V，雾化气流速：氮气（N2）流速5.0 mL/min，喷雾器压力40 psi，脱溶剂气流速：10.0 mL/min，脱溶剂气温度：400 ℃，多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）正离子模式，离子对及碰撞能量等参数见表2。
表2 10种杀菌剂的质谱参数及保留时间
Table 2 Mass spectrum parameters and retention time of the 10 fungicides
注：“*”表示定量离子。
2 结果与分析
2.1 前处理优化
选择对杀菌剂溶解性能好的乙腈作为提取溶剂，乙腈在氯化钠的参与下可以与水层较好的分离。本研究对QuEChERS前处理方法[20]中常用的试剂无水硫酸镁、PSA、C18、GCB进行考察。无水硫酸镁用于去除基质中的水分，但直接加入硫酸镁会产生大量的热，可能导致目标化合物分解。本文通过对样品进行预降温和低温离心的方式来减少硫酸镁吸水放热的影响；PSA用于吸附基质中的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类和少量的色素。本研究空白试样为葱，加标水平为20 μg/L，通过采用测定加标回收率的方式对PSA加入量进行考察，结果见图1。由图1可知，PSA加入量为60 mg时，能够有效提高10种杀菌剂的回收率（P＜0.05）；GCB主要用于去除色素、甾醇类和非极性干扰物，其对多种杀菌剂回收率影响严重；C18对回收率影响不大。所以本研究最终选用氯化钠、硫酸镁、PSA作为净化方案。
图1 不同PSA加入量对测定结果加标回收率的影响
Fig.1 Effect of different PSA addition on adding standard recovery of determination results
2.2 质谱及色谱条件选择
在质谱电喷雾离子源正模式下分别对10种杀菌剂进行全扫描（full scan），选出适宜的母离子（均为[M+H]+）。在子离子扫描模式下，通过优化碰撞能（collision energy）和碎裂电压（fragmentor）等条件，选择合适定性离子与定量离子。在MRM正离子模式下对驻留时间进行优化，获得良好的响应与峰形。优化得到的相关质谱条件见表2，MRM质谱图见图2。
图2 10种杀菌剂在多反应监测模式下质谱图
Fig.2 Mass spectrogram of 10 fungicides under multiple reaction monitoring mode
A：多菌灵、B：甲基硫菌灵、C：嘧霉胺、D：甲霜灵、E：烯酰吗啉、F：咪鲜胺、G：戊唑醇、H：三唑酮、I：丙环唑、J：苯醚甲环唑，下同。
采用上述优化质谱条件下，对加标样品进行液相色谱检测。采用体积分数为0.05%甲酸/水及0.05%甲酸/乙腈进行梯度洗脱，通过不断优化梯度洗脱程序获得较为理想的峰形及信噪比，使10种杀菌剂可在色谱上较好的分离。梯度洗脱程序见表1，加标样品（加标水平20 μg/L）色谱图见图3。
图3 10种杀菌剂在多反应监测模式下液相色谱图
Fig.3 Liquid chromatograms of 10 fungicides under multiple reaction monitoring mode
从左到右依次为多菌灵、甲基硫菌灵、嘧霉胺、甲霜灵、烯酰吗啉、咪鲜胺、戊唑醇、三唑酮、丙环唑、苯醚甲环唑。
2.3 检测方法的线性关系和检出限
按照1.3.2的方法配制标准溶液（空白基质为葱），按上述仪器条件上机测试，以质量浓度（x，μg/L）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线线性回归方程。同时以3倍信噪比（signal-to-noise ratio，SNR）计算检测方法检出限，结果见表3。由表3可知，10种杀菌剂在0.2～60 μg/L质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数R2均＞0.999，可满足准确定量的要求。10种杀菌剂的检出限为0.2～0.6 μg/kg。
表3 10种杀菌剂的线性回归方程、线性范围、相关系数及检出限
Table 3 Linear regression equations,linear range,correlation coefficient and detection limits of 10 fungicides
2.4 加标回收率和方法精密度
为验证方法的准确性和精密度，选取葱、姜、蒜、香菜、辣椒五种阴性样品分别添加杀菌剂做加标回收试验，加标水平分别为2 μg/kg、20 μg/kg、100 μg/kg，重复6次。如表4中所示，加标回收率为73.0%～104.7%，精密度试验结果相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.9%～9.8%。试验结果表明，此方法的准确性和精密度可满足杀菌剂定量分析的要求[21]。
表4 10种杀菌剂的精密度及加标回收率试验结果
Table 4 Results of precision and standard recovery rates tests of 10 fungicides
续表
2.5 实际样品分析
随机抽取市售鲜菜类调味品20份，其中包含葱、姜、蒜、香菜、辣椒各4份，应用本方法进行测定。20份样品中4份样品有杀菌剂检出，其中葱中检出多菌灵（57.6 μg/kg）一份，香菜中检出苯醚甲环唑（85.7 μg/kg）一份，大蒜中检出烯酰吗啉（28.1 μg/kg、101 μg/kg）两份。依据GB 2763—2019《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》[22]的要求，大蒜中检出的烯酰吗啉低于限量值（0.6 mg/kg），其他两种检出农药无限量值要求。
3 结论
本研究以烟台地区鲜菜类调味品为样本，对QuEChERS法的试剂进行考察，确定提取鲜菜类调味品中杀菌剂的最优前处理方法，结合液相色谱串联三重四级杆质谱仪建立了同时检测鲜菜类调味品中10种杀菌剂残留的快速检测方法。10种杀菌剂在测定范围内相关系数R2均＞0.999，检出限为0.2～0.6 μg/kg，加标回收率为73.0%～104.7%，精密度试验结果相对标准偏差（RSD）为1.9%～9.8%。该方法与现行国标方法[15-19]相比可同时测定10种常见杀菌剂，并且有前处理耗时短、准确性好、灵敏度高的优点，适用于对鲜菜类调味品中杀菌剂残留的定性及定量分析，可为鲜菜类调味品中杀菌剂残留的持续监测和完善限量标准的制定提供技术支撑和理论依据。
[1]张云甫.调味品与调味的关系[J].中国调味品，2002，27（6）：35-36.
[2]王永彬.调味品行业研究[D].成都：西南财经大学，2014.
[3]连恒博.葱姜蒜价格波动特征及关联性研究[D].保定：河北农业大学，2019.
[4]王佳韵，张一宾.全球三唑类杀菌剂的市场概况及发展趋势[J].农药，2017，56（2）：86-87.
[5]胡瑞兰，龚道新，刘灵宁，等.30%苯醚甲环唑·丙环唑乳油在水稻中的残留分析[J].农药，2010，49（3）：194-196.
[6]凌淑萍，付岩，王全胜，等.苯醚甲环唑和吡唑醚菌酯在西瓜中的残留分析及膳食风险评价[J].食品安全质量检测学报，2021，12（3）：1215-1223.
[7]徐立伟.蔬菜清洗技术和杀菌剂发展研究[J].农业科技与装备，2021（2）：54-55.
[8]LV X,PAN L,WANG J,et al.Effects of triazole fungicides on androgenic disruption and CYP3A4 enzyme activity[J].Environ Pollut,2017,222(3):504-512.
[9]陈源，陈昂，蒋桂芳，等.苯醚甲环唑对水生生物急性毒性评价[J].农药，2014（12）：900-903.
[10]穆希岩.苯醚甲环唑对斑马鱼毒性及作用机制研究[D].北京：中国农业大学，2015.
[11]葛婧，蒋金花，蔡磊明.3 种三唑类杀菌剂对斑马鱼的毒性研究[J].浙江农业学报，2018，30（5）：744-755.
[12]齐素贞.戊唑醇对映异构体对大型溞的毒性差异及双酰胺类杀虫剂结合位点的选择性研究[D].北京：中国农业大学，2014.
[13]陈健航，叶瑜霏，程雪梅，等.分散固相萃取-气相色谱-质谱联用法检测葱、韭菜和姜中多种农药残留[J].质谱学报，2011，32（6）：341-349.
[14]苏建峰，赵建晖，熊刚，等.超高效液相色谱-串联质谱法快速测定葱、姜、蒜与辣椒酱中的66 种有机磷农药残留[J].分析测试学报，2011，30（10）：1094-1099.
[15]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.188—2003 蔬菜、水果中甲基托布津、多菌灵的测定[S].北京：中国标准出版社，2014.
[16]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 23380—2009 水果、蔬菜中多菌灵残留的测定高效液相色谱法[S].北京：中国标准出版社，2009.
[17]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.126—2003 植物性食品中三唑酮残留量的测定[S].北京：中国标准出版社，2014.
[18]中华人民共和国国家卫生健康委员会，中华人民共和国农业农村部，国家市场监督管理总局.GB 23200.113—2018 植物源性食品中208种农药及其代谢物残留量的测定气相色谱-质谱联用法[S].北京：中国农业出版社，2018.
[19]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.GB/T 20769—2008 水果和蔬菜中450 种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法[S].北京：中国标准出版社，2008.
[20]白小东，程超.浅析QuEChERS 方法结合色谱串联质谱技术在果蔬农药残留检测中的优势[J].食品安全导刊，2021（7）：40-41.
[21]中华人民共和国农业农村部.NY/T 788—2018 农药残留试验准则[S].北京：中国标准出版社，2018.
[22]中华人民共和国国家卫生健康委员会，中华人民共和国农业农村部，国家市场监督管理总局.GB 2763—2021 食品安全国家标准食品中农药最大残留限量[S].北京：中国农业出版社，2021.