多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）属于卤代芳烃类化合物，可作为树脂、防火剂、涂料等多种工业品的添加剂[1-2]，是一种用途很广的工业化学品。而该物质属于致癌物，容易在人体的脂肪组织中积累，对神经系统、生殖系统、免疫系统均有危害作用；同时对水体和大气环境均可造成污染[1-2]。虽然大多数国家已停止了生产和使用多氯联苯，但其物理化学性质非常稳定，会长期存在于地球的生态系统中[3]。在PCBs的209种同系物中，多氯联苯PCB118是毒性较强的一种。因此，检测PCB118残留量是必要的[4]。
目前，检测多氯联苯的方法有气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、光电化学传感器法等。其中，蓝梦哲[5]建立了鱼粉饲料中多氯联苯残留量的气相色谱分析方法，对7种指示性多氯联苯（PCBs）在3个添加水平的平均回收率（n=5）为83.1%～109.4%，相对标准偏差为0.70%～7.28%。陈丽金[6]建立了测定饲料中多氯联苯残留量的气相色谱析方法，测定结果显示，18种多氯联苯的检出限为0.004～0.010 mg/kg。张桃英等[7]建立了使用快速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）技术提取，毛细管柱为分离柱，以电子捕获检测器检测，用气相色谱法同时测定果蔬中15种有机氯农药的残留量，最低检出限为1.1～20 μg/kg。王文兰等[8]建立了一种气相色谱内标标准曲线法测定鱼肉中7种指示性多氯联苯不确定度的分析方法。时磊等[9]用气相色谱法测定了稻谷中18种有机氯农药和7种多氯联苯的含量。侯圣军等[10]建立了大米中12种有机氯农药气相色谱-电子捕获检测器检测方法。杜静等[11-14]也应用了气相色谱法测定多氯联苯残留量。何芳等[15]为监测小麦中多氯联苯污染状况，应用超声波提取、分散固相萃取净化、气相色谱-质谱法（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）检测，建立了一种简单、快速测定小麦中7种指示性多氯联苯（PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180）的分析方法。王定森等[16]研究了Aroclor系列多氯联苯的组成特点，提出了选取各Aroclor系列多氯联苯中5～10个特征峰，将选取的特征峰面积加和与浓度制作标准曲线进行定量的方法，作为标准方法的补充说明。杨代凤等[17]建立了气相色谱-质谱法同时快速测定小麦中12种二噁英类多氯联苯（dioxin-like polychlorinated biphenyls，DL-PCBs）的分析方法。朱芸等[18]建立了加速溶剂萃取-气相色谱质谱法同时测定34种有机氯农药（organochlorine pesticides，OCPs）和18种多氯联苯类化合物（PCBs）的方法。杨梅[19]研究了固相萃取-气相色谱串级质谱联用方法测定食品中多氯联苯的方法。宋梓亮等[20]建立了饲料中多氯联苯Aroclor 1242系列的气相色谱-质谱联用分析方法。潘娟等[21-23]同样应用了气相色谱-质谱法对多氯联苯残留量进行了测定。王贵珍[24]以单个多氯联苯的适配体为识别元件，将适配体修饰于不同的纳米材料上，构建不同的电化学和光电化学适配体传感器实现对多氯联苯（PCBs）单体PCB77和PCB72的测定。
与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点[25-26]。而免疫化学法检测多氯联苯的前提是具备抗多氯联苯的抗体，本研究制备出一种多氯联苯单克隆抗体，并应用于胶体金免疫层析试纸条，费用及检测时限均能够满足基层实验室的检测需求，该产品已市场化，具有实际应用价值。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
多氯联苯PCB118、PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等标准品（纯度≥95%）：北京标准物质研究中心。
1.2 仪器与设备
GT-700胶体金分析仪：北京勤邦生物技术有限公司；HFJ-10均质器、MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司；JA2003电子天平：上海力辰仪器科技有限公司。
1.3 方法
1.3.1 多氯联苯半抗原的制备
取多氯联苯PCB118326mg，加N，N-二甲基甲酰胺20mL溶解，充分搅拌，加入氢氧化钾0.56 g，加入50%乙醛酸水溶液0.51 mL，加热至90 ℃，反应8 h，停止反应，加1 mol/L盐酸，调节pH值至6，加水60 mL，加1,2-二氯乙烷100 mL萃取，静置分层，分去水相，有机相水洗，干燥，蒸干，上硅胶柱，二氯甲烷/甲醇（10/1，V/V）洗脱分离，得到羧基多氯联苯PCB118 0.24 g，回收率60%。氯联苯半抗原合成途径如下：
1.3.2 免疫原的制备
取羧基多氯联苯15 mg，加二甲基甲酰胺1 mL溶解，加1-羟基苯并三唑11.4 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺14 mg，室温反应3 h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白50 mg，加0.05 mol/L碳酸盐缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4 ℃反应12 h，0.02 mol/L磷酸盐缓冲液透析纯化3 d，每天换液3次，得到多氯联苯-牛血清白蛋白偶联物，即为免疫原，-20 ℃保存，备用。
1.3.3 包被原的制备
取羧基多氯联苯9 mg，加二甲基亚砜1 mL溶解，加N-羟基琥珀酰亚胺7.9 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺8.4 mg，室温反应3 h，得到半抗原溶液A液；取卵清蛋白50 mg，后续步骤同1.3.2，得到包被原。
1.3.4 微孔试剂的制备
取0.01%氯金酸水溶液100 mL加热至沸腾；一边搅拌，一边准确加入1%柠檬酸三钠溶液1.5 mL；待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸15 min，冷却后，4 ℃避光保存。在磁力搅拌作用下，用0.2 mol/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2，加入60 μg多氯联苯单克隆抗体/mL胶体金溶液，混匀，静置10 min，加入10%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），使其在胶体金溶液中的体积分数为1%，静置10 min。离心、洗涤、重悬，4 ℃保存备用。
试纸条的检测线T线包被有1.3.3制备的包被原，包被量为1.0 μg/cm2；质控线C线包被有羊抗鼠抗抗体，包被量为1.0 μg/cm2。
将100 μL多氯联苯单克隆抗体-胶体金标记物加入微孔板中，置于冷冻干燥机，冷阱温度为-50 ℃，预冻3 h，再真空干燥15 h，得到微孔试剂。
1.3.5 样本前处理方法
用均质器均质饲料样本；称取（5.0±0.05）g均质后的饲料样本至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入25 mL体积分数50%甲醇，用振荡器剧烈振荡5 min，室温条件下3 000×g离心5min；移取500μL上清液至2 mL聚苯乙烯离心管中，加入500 μL10%氯化钠水溶液，用振荡器振荡1 min，混匀；待用。
1.3.6 检测方法
向微孔中加入100 mL待测样本，孵育3 min，吸取70 mL滴至试纸条上，反应10 min，判读检测结果，见图1。
图1 多氯联苯胶体金试纸条结果判定示意图
Fig.1 Schematic diagram of polychlorinated biphenyl test strip result determination
1.3.7 试纸条检测限的测定
在空白饲料样本（豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼）中分别添加多氯联苯标准品，质量浓度为0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L，按照1.3.6检测三批试纸条，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限[25-26]。
1.3.8 试纸条特异性的测定
分别配制100 μg/L的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等药物，用试纸条重复检测3次，检测试纸条的特异性。
1.3.9 试纸条准确性的测定
试纸条的准确性通常以假阳性率和假阴性率表示，假阳性率应小于5%，假阴性率应为0。用试纸条检测样品中是否残留多氯联苯，通过仪器确证的50份阴性饲料样品（质量浓度＜10 μg/kg）和50份阳性饲料样品（质量浓度＞10 μg/kg），计算假阳性率和假阴性率。
1.3.10 试纸条稳定性的测定
用试纸条检测20份阴性饲料样品（质量浓度＜10μg/kg）和20份阳性饲料样品（质量浓度＞10 μg/kg），上述样品均经过仪器确证，试纸条于2～8 ℃冷藏保存，保存时间分别为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月，每个样品重复测定2次，判定试纸条的稳定性。
2 结果与分析
2.1 样本检测限
分别配制多氯联苯质量浓度为0、6μg/L、8μg/L、10μg/L、12 μg/L、14 μg/L的豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼等饲料样品，按照
1.3.6 步骤进行检测，确定检测限[25-26]，试验结果见表1。结果表明，当饲料样品中多氯联苯质量浓度为0、6 μg/L、8 μg/L时，试纸条显示阴性，即未能检测到样品中含有多氯联苯；当饲料样品中多氯联苯质量浓度≥10 μg/L时，试纸条显示阳性，即能够检测到样品中含有多氯联苯，则该试纸条的检测限定为10 μg/kg。
表1 多氯联苯快速检测试纸条的检测限
Table 1 Detection limit of the polychlorinated biphenyl test strip for rapid detection
注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。下同。
2.2 特异性测定结果
该试纸条检测100 μg/L 的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等药物的特异性测定结果见表2。结果表明，检测结果均呈阴性，即该试纸条与上述药物无交叉反应，特异性较好。
表2 特异性测定结果
Table 2 Result of specificity tests
2.3 准确性测定结果
用试纸条检测50份阴性和50份阳性豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼等饲料样品，检测结果见表3。结果表明，未出现假阳性和假阴性，即试纸条准确性较高。
表3 准确性测定结果
Table 3 Result of accuracy tests
续表
2.4 稳定性测定结果
针对豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼等饲料样本，试纸条进行了假阳性率和假阴性率的测试，结果见表4。
表4 稳定性测定结果
Table 4 Result of stability tests
结果表明，12个月内，稳定性指标均符合要求，说明稳定性能够维持12个月。从第13个月起，试纸条会出现少量失效、假阳性等现象，即超过12个月，试纸条质量已不稳定。
3 结论
本研究制备出多氯联苯半抗原，使之与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联，分别得到多氯联苯免疫原和多氯联苯包被原，从而制备出多氯联苯胶体金免疫层析试纸条。测定了多氯联苯胶体金试纸条的产品检测限，并对其特异性、准确性和稳定性等指标进行了测试，均符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。另外，多氯联苯胶体金试纸条的检测限为10 μg/kg，检测时间仅为15 min，灵敏度高且用时短，即具有免疫快速检测产品的特点。
[1]边连全.农药残留对饲料的污染及其对畜产品安全的危害[J].饲料工业，2005（9）：1-5.
[2]史智勇，董菊子，马慧，等.多氯联苯对大鼠肝脏结构及功能的影响[J].癌变.畸变.突变，2008（3）：224-226.
[3]周琳，沈燕华，陈大舟，等.贻贝中多氯联苯分析的前处理方法研究[J].分析测试学报，2005（5）：43-46.
[4]马腾达，王慧玲，周凤霞.多氯联苯在食品检测中的研究新进展[J].吉林农业，2018（12）：51.
[5]蓝梦哲.气相色谱法测定鱼粉饲料中多氯联苯（PCBs）残留量[J].饲料广角，2008（18）：34-35.
[6]陈丽金.气相色谱法测定饲料中18 种多氯联苯（PCBs）残留量[J].粮食与饲料工业，2019（7）：60-61，64.
[7]张桃英，饶竹.快速溶剂萃取/气相色谱测定果蔬中有机氯农药残留的研究[J].农药科学与管理，2005（10）：10-13.
[8]王文兰，郭军，赵全东，等.气相色谱内标法测定鱼肉中多氯联苯不确定度评定[J].食品安全质量检测学报，2019，10（17）：5597-5603.
[9]时磊，陈海英，蔡小虎，等.超声提取-气相色谱法同时测定稻谷中18 种有机氯农药和7 种多氯联苯[J].理化检验（化学分册），2016，52（9）：1090-1094.
[10]侯圣军，郝向洪，申丽，等.基质固相萃取-气相色谱电子捕获检测器同时测定大米中12 种有机氯农药残留量[J].分析试验室，2007（5）：115-118.
[11]杜静，黄会，张华威，等.气相色谱法同时测定贝类中15 种持久性有机污染物残留量[J].中国渔业质量与标准，2019，9（3）：53-62.
[12]吉仙枝.超声波提取-气相色谱法测定鱼类食品中的多氯联苯[J].中国酿造，2012，31（8）：116-119.
[13]薛海全，崔兆杰，杜世勇.ASE 萃取-GPC 净化-GC/ECD 测定小麦中有机氯农残和多氯联苯[J].山东大学学报（理学版），2011，46（1）：11-15.
[14]杨乾展，何岸檐.气质联用法检测土壤样品中多氯联苯[J].环境与发展，2020，32（10）：132-133，136.
[15]何芳，原东林.气相色谱-质谱法快速测定小麦中7 种指示性多氯联苯[J].食品科技，2020，45（12）：313-318.
[16]王定森，林国宝.气相色谱-质谱法测试水质7 种Aroclor 系列多氯联苯的方法验证[J].广东化工，2019，46（15）：175-176.
[17]杨代凤，刘腾飞，陆皓茜，等.气相色谱-质谱法测定小麦中二噁英类多氯联苯[J].食品安全质量检测学报，2020，11（17）：6209-6215.
[18]朱芸，李世刚，周圆，等.加速溶剂萃取-气相色谱质谱法同时测定土壤及沉积物中34 种有机氯农药及18 种多氯联苯类化合物[J].环境监控与预警，2019，11（3）：30-35.
[19]杨梅.固相萃取-气相色谱串级质谱联用测定水产品中的多氯联苯[J].现代食品，2020（18）：184-189.
[20]宋梓亮，李福儿，汪勇，等.气相色谱-质谱联用法测定饲料中的多氯联苯Aroclor1242 系列[J].广东农业科学，2012，39（21）：122-125.
[21]潘娟，华贤辉，商军.饲料中36 种残留农药的气相色谱-质谱法检测方法[J].饲料工业，2009，30（11）：37-41.
[22]于胜良，杨桂朋，付萌.凝胶渗透色谱净化-气相色谱/串联质谱分析蘑菇中的36 种农药残留[J].色谱，2007（4）：581-585.
[23]李鹏，沈轶，刘俊辉，等.气相色谱-质谱法测定烟草中多氯联苯[J].烟草科技，2017，50（9）：49-54.
[24]王贵珍.基于核酸适配体的电及光电化学传感器在多氯联苯检测中的应用研究[D].太原：山西大学，2020.
[25]吴小胜，贾芳芳，崔海峰，等.一种苯醚氰菊酯胶体金免疫快速检测试纸条的研制[J].湖北农业科学，2020，59（7）：196-198，203.
[26]朱亮亮，王琳琛，王兆芹，等.检测4 种有机磷农药胶体金免疫层析试纸条的研制[J].山东畜牧兽医，2019，40（8）：10-12.