馒头是以小麦粉和水为原料，以酵母菌为主要发酵剂揉成面团，经发酵、定型、醒发后蒸制而成的食品[1]。馒头作为我国的传统主食，在人们的饮食结构中占据重要地位，随着人民生活节奏的加快，主食工业化必将成为未来的发展趋势，馒头的工业化生产将是其中重要的组成部分[2-4]。但因馒头营养丰富，含水量较高，储存期间很容易受到细菌和霉菌的作用而腐败，货架期极短等因素都制约着馒头工业化生产的发展步伐[5-6]。化学防腐剂作为一种能够抑制食品中微生物生长而延长食品保质期的物质，在食品行业已被广泛使用，但其滥用和过量使用对人类健康造成的危害问题也逐渐受到消费者的关注[7]。随着人们对食品安全和品质要求的提高，绿色安全无毒副作用的生物防腐剂逐渐成为研究热点，生物防腐剂凭借其抗菌活性强、安全无毒、热稳定性好、抑菌谱广等特点正逐步展现出替代化学防腐剂的趋势[8]。
乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一种能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称[9]。乳酸菌安全无毒，无致病性和致癌性，在世界范围内被公认为安全等级“一般认为安全（generally recognized as safe，GRAS）”的食品微生物[10]。乳酸菌作为益生菌，在食品工业的生物防腐领域也有一定的应用价值，PLESSAS S等[11]采用嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、清酒乳杆菌（Lactobacillus sake）以及两者的混合菌分别发酵酸面团制作面包，发现混合菌发酵的酸度更高且制作出的面包比其他面包的保质期更长；钱洋[12]测试了3株乳酸菌发酵液对面包储藏期限的影响，结果发现与对照组相比，喷洒了发酵液的面包的储藏期限均得到相应的延长。
本研究从发霉馒头中分离主要腐败霉菌，并通过形态观察及分子生物学技术对其进行鉴定。以分离得到的腐败霉菌为指示菌，从实验室保藏的食品级乳酸菌中筛选对腐败霉菌具有较强抑制活性的菌株，通过对其发酵液进行过氧化氢酶、蛋白酶、不同温度及pH处理，初步分析上清液中抑菌物质的特性。最后将该菌株发酵制备的酸面团用于馒头的防霉应用中，并与添加量为0.5 g/kg（以脱氢乙酸计）的脱氢乙酸钠的防霉效果作对比，为馒头工业化生产开发绿色安全的生物防腐剂奠定研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
馒头：储存6 d后发霉的馒头；活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）LP-1、LP-2、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LR-1、LR-2、LR-3、副干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）LC-1、LC-2、LC-3：由安琪酵母菌种保藏中心提供。
1.1.2 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基、马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth，PDB）培养基、MRS固体和MRS肉汤培养基：北京陆桥技术股份有限公司。
1.1.3 试剂
过氧化氢酶（5 000 U/mg）、蛋白酶K（40 U/mg）：北京索莱宝科技有限公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；乳酸、氢氧化钠（均为分析纯）：西陇科学股份有限公司；脱氢乙酸钠（纯度99%）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.2 仪器与设备
Bioscreen C全自动生长曲线分析仪：芬兰Bioscreen公司；BHC-1300IIA型生物洁净安全柜：苏州净化设备有限公司；FE22 pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SPX-250BSH-II生化培养箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；XCS-HJSG-3恒温搅拌三联水浴锅：陕西鑫昌实验仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 馒头中腐败霉菌的分离与鉴定
无菌操作下称取5 g发霉馒头碎屑于装有45 mL无菌水的试管中，振荡混匀，再吸取1 mL混匀液体加入9 mL无菌水中，依次进行10倍梯度稀释，吸取100 μL稀释液均匀涂布于PDA培养基上，30 ℃条件下培养3 d，观察各菌落的形态，选取两株形态数量最多的菌落做进一步分离纯化，纯化后的菌落参考《真菌鉴定手册》[13]进行形态学观察，并委托北京六合华大基因科技有限公司进行真菌18S rDNA测序。将测得的序列结果提交至美国国立生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank数据库中采用基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）进行同源性比对搜索，选取同源性较高的模式菌株的18S rDNA基因序列，使用MEGA7.0软件中的邻接（neighbor joining，NJ）法构建系统发育树[14-15]。
1.3.2 霉菌孢子悬液的制备
将纯化后的霉菌接种在PDA斜面上，30 ℃条件下培养7 d至霉菌产生大量孢子，加入30 mL无菌生理盐水于斜面培养瓶中，充分振荡后的清洗液经无菌纱布过滤除去菌丝，获得孢子悬液，采用血球计数板计数[16]。
1.3.3 乳酸菌发酵上清液的制备
将甘油管冷冻保藏的乳酸菌解冻后，吸取100 μL接种于10 mL MRS肉汤培养基进行复壮，37 ℃条件下培养48 h。复壮后再以5%（V/V）的接种量接种于MRS肉汤培养基进行活化，37 ℃条件下培养24 h。活化后的乳酸菌以5%（V/V）的接种量接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃条件下培养48 h，培养液经5 000 r/min离心15 min后，上清液经0.22 μm滤膜过滤除菌即得到乳酸菌发酵上清液[17]。
1.3.4 乳酸菌抑菌活性的测定
（1）乳酸菌菌株抑菌活性的测定
将活化后的乳酸菌菌株在MRS固体培养基中于37 ℃条件下培养48 h。将孢子悬液（孢子浓度为3.6×107～5.2×107 CFU/mL）以1%（V/V）的接种量接入冷却至50 ℃左右的PDA培养基中，取5 mL含有霉菌孢子悬液的PDA培养基倾倒在上层，待其凝固后，30 ℃条件下培养48 h，根据乳酸菌周围抑菌圈直径的大小评价抑菌效果[18]。
（2）乳酸菌发酵液抑菌活性的测定
发酵上清液抑菌活性的测定参考胡诚等[19]的微量孔板法并稍作修改：在每个孔中依次加入100 μL乳酸菌发酵上清液、200 μLPDB培养基和50 μL霉菌孢子悬液，以100 μL的MRS肉汤培养基替代乳酸菌发酵上清液作为对照组。将孔板置于30 ℃条件下培养48 h后，使用Bioscreen C全自动生长曲线分析仪在波长580 nm处测定吸光度值（OD580nm值），并计算抑菌率，其计算公式如下：
1.3.5 乳酸菌生长特性的分析
活化后的乳酸菌，按5%（V/V）的接种量接种于MRS肉汤培养基中，混合均匀后取300 μL加入到微孔板的孔中，37 ℃条件下培养，每30 min取样测定吸光度值（OD600nm值），另外每隔4 h取样测定乳酸菌发酵液的pH值，测得数据用于乳酸菌生长曲线及发酵液pH变化曲线的绘制。
1.3.6 不同培养条件对菌株LP-1发酵上清液抑菌活性的影响
温度、酶及pH值对菌株LP-1发酵上清液抑菌活性的影响：取5 mL菌株LP-1发酵上清液分别在-20 ℃、4 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃和121 ℃条件下保持30 min[20]；取10 mL菌株LP-1发酵上清液分别加入1 mg/mL过氧化氢酶（pH 7.3）、胰蛋白酶（pH 8.1）和蛋白酶K（pH 7.0），37 ℃水浴2 h后，100 ℃水浴灭酶3 min，将pH调回发酵上清液的初始值[21-22]；使用1 mol/L乳酸和1 mol/L NaOH溶液分别将菌株LP-1发酵上清液的pH值调节为3、4、5、6、7和8[23]；以未处理的乳酸菌发酵上清液作为对照组，采用微量孔板法测定各实验组的抑菌率。
1.3.7 乳酸菌在馒头防霉中的应用
将活化后的乳酸菌按5%（V/V）的接种量接种于MRS肉汤培养基，37 ℃条件下培养24 h，离心弃上清液，获得的菌体经无菌水清洗两次后备用。按菌体、面粉、水质量比为0.01∶1.00∶1.00的配比混合均匀，密封置于37 ℃醒发箱发酵12 h即获得酸面团。按表1的4种配方分别制作馒头[24]，蒸制好的馒头用自封袋包装后储存于37 ℃醒发箱中，分别测定和记录面团的pH值、蒸制后馒头的pH值以及馒头储存过程出现明显可见霉斑的时间点。
表1 馒头的制作配方
Table 1 Formulations for making Mantou
注：“-”表示未添加。
2 结果与分析
2.1 馒头中腐败霉菌的分离与鉴定
从发霉的馒头中共分离纯化出2株主要的腐败霉菌，分别编号为A1、A2，其菌落及细胞形态见图1。
图1 腐败霉菌A1（a）及A2（b）的菌落及细胞形态
Fig.1 Morphology of colonies and cells of spoilage molds A1(a)and A2(b)
由图1可知，菌株A1的菌落呈绿色或青绿色，边缘有白色绒毛且菌落中心有突起，分生孢子梗顶生排列成帚状的间枝，分生孢子呈链状排列，球形至卵圆形。菌株A2的菌落初呈黄色后渐变为黄绿色，成熟后颜色变暗，分生孢子梗粗壮无分枝顶囊，分生孢子呈球形或近球形。
采用分子生物技术对2株腐败霉菌进行鉴定，系统发育树见图2。由图2可知，菌株A1与Penicillium expansum聚于一支，亲缘关系最近；菌株A2与Aspergillus flavus聚于一支，亲缘关系最近。结合形态观察，鉴定菌株A1、A2分别为扩展青霉（Penicillium expansum）、黄曲霉（Aspergillus flavus），此结果与文献[25]中报道的相一致。
图2 基于18S rDNA基因序列腐败霉菌A1、A2的系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of spoilage molds A1 and A2 based on 18S rDNA gene sequences
2.2 不同乳酸菌抑菌效果评价
由表2可知，供试乳酸菌对两株霉菌均表现出一定的抑菌作用，其中，植物乳杆菌LP-1对两种霉菌的抑制效果都较为突出，故确定该菌株为优良菌株。
表2 不同乳酸菌对霉菌的抑菌活性比较
Table 2 Comparison of antimicrobial activities of different lactic acid bacteria against molds
注：“+”表示抑菌圈直径为（25，35]mm，“++”表示抑菌圈直径为（35，40]mm，“+++”表示抑菌圈直径为（40，45]mm，“++++”表示抑菌圈直径为（45，50]mm，“+++++”表示抑菌圈直径为（50，55]mm。
2.3 植物乳杆菌LP-1生长曲线及发酵液pH变化曲线
为了解植物乳杆菌LP-1的生长以及产酸情况，测定该菌株的生长曲线以及生长过程中发酵液的pH变化，结果见图3。
由图3可知，在发酵0～4 h内，植物乳杆菌LP-1的生物量变化缓慢为延滞期；发酵4～14 h内，其生物量迅速增长，为对数生长期；发酵14 h后生物量基本维持不变进入稳定生长期。植物乳杆菌LP-1发酵液的pH值在0～8 h内由6.16迅速降低至4.25，8～12 h由4.25缓慢降至3.98，12 h后基本维持不变并最终降至3.87。故后续实验使用该菌发酵制备酸面团时，以发酵12 h为发酵终点。
图3 植物乳杆菌LP-1的生长曲线及发酵液pH变化曲线
Fig.3 Growth curve of Lactobacillus plantarum LP-1 and pH change curve of fermentation broth
2.4 培养条件对植物乳杆菌LP-1发酵上清液抑菌活性的影响
温度、酶、pH值对植物乳杆菌LP-1发酵上清液抑菌率的影响见图4。
由图4a可知，植物乳杆菌LP-1发酵上清液经过不同温度处理后，对扩展青霉和黄曲霉的抑菌率与室温条件（约25 ℃）下未处理的发酵上清液相比均无明显差异，说明发酵上清液中的抑菌物质对温度处理不敏感，在温度-20～121 ℃的范围内具有良好的稳定性。
由图4b可知，发酵上清液经过过氧化氢酶、蛋白酶K以及胰蛋白酶处理后对扩展青霉的抑菌率分别为75.46%、77.99%和76.04%，与未处理的原液抑菌率（81.67%）相比略有下降；对黄曲霉的抑菌率分别为72.52%、73.85%和74.23%，与未处理的原液抑菌率（73.75%）相比无明显差异，表明植物乳杆菌LP-1发酵上清液中的抑菌物质并不是过氧化氢或蛋白类细菌素起主要的抑菌活性，可能是乳酸菌产生的其他代谢产物发挥主要抑菌活性作用。
图4 温度（a）、酶（b）及pH（c）对植物乳杆菌LP-1发酵上清液抑菌率的影响
Fig.4 Effects of temperature (a),enzyme (b) and pH (c) on the inhibition rate of Lactobacillus plantarum LP-1 fermentation supernatant
由图4c可知，不同pH对植物乳杆菌LP-1发酵上清液的抑菌率影响较大，当pH为3和4时，发酵上清液对扩展青霉和黄曲霉的抑制作用与原液相比未见明显改变；当pH值≥5时，植物乳杆菌LP-1发酵上清液对扩展青霉和黄曲霉的抑制作用均明显降低；pH值为6时发酵上清液对扩展青霉和黄曲霉的抑制作用最低，分析推测发酵上清液中起主要抑菌作用的物质为乳酸菌产生的有机酸类代谢产物。
2.5 植物乳杆菌LP-1在馒头防腐中的应用
采用4种配方制作馒头时，面团的pH值、馒头的pH值以及馒头在储存过程中出现明显可见霉斑的时间点见表3，各实验组馒头储存6 d后的霉变情况见图5。
表3 4种配方制作馒头时面团的pH、馒头的pH及霉斑出现时间
Table 3 pH of dough and Mantou and the appearance time of mildew spots in the Mantou-making with 4 formulas
图5 4种配方制作的馒头储存6 d后的霉变情况
Fig.5 Mildew of Mantou made with 4 kinds of formula after storage for 6 d
由表3可知，1#、2#配方制作馒头时，面团的pH值（4.09、4.31）和馒头的pH值（4.03、4.39）均明显低于3#、4#配方，2#、3#配方制作出的馒头在第2天表面出现了可见霉斑，1#、4#配方制作出的馒头在第4天表面出现了可见霉斑，表明40%酸面团添加量制作出的馒头的防霉效期与0.5 g/kg脱氢乙酸钠添加量（以脱氢乙酸计）的一致，较空白对照组（3#配方）相比延长了2 d。2#、3#配方制作的馒头储存6 d后表面发粘，由图5可知，2#、3#配方制作的馒头储存6 d后馒头的腐败程度及表面霉菌的菌落大小均明显高于1#、4#配方制作的馒头。
3 结论
本研究采用稀释涂布平板法从发霉馒头中分离得到2株主要腐败霉菌，经形态观察及分子生物学鉴定分别为扩展青霉（Penicillium expansum）和黄曲霉（Aspergillus flavus），以其作为指示菌，从实验室保藏的乳酸菌中筛选得到一株抑霉菌活性优良的植物乳杆菌LP-1。植物乳杆菌LP-1发酵上清液在温度-20～121 ℃范围内具有很好的稳定性，且对蛋白酶和过氧化氢酶处理均不敏感，在pH为3～4的酸性条件下抑菌物质能展现出较好的抑菌性能，pH≥5时抑菌活性显著降低，分析推测发酵上清液中的抑菌物质为乳酸菌产生的有机酸类代谢产物。植物乳杆菌LP-1发酵制得的酸面团用于馒头的制作，37 ℃密封储存，40%酸面团添加量配方制作的馒头在第4天表面出现可见霉斑，较空白对照组延长2 d，其防霉效果与0.5 g/kg脱氢乙酸钠添加量相当，表现出较好的生物防腐性能，为馒头工业化生产开发绿色安全生物防腐剂奠定研究基础。
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