木枣（Zizyphus jujuba Mill.），别名吕梁木枣，为大枣的一种，主要分布于山西、陕西交界的黄河沿岸地区，年产2.5亿kg以上[1]。木枣缺乏单宁等多酚类物质，不如葡萄、苹果等拥有浓郁的果香，所以酿造的酒无特色，酒体滞重，缺乏酒香。目前的枣酒企业通常利用商业酵母，生产的枣酒普遍存在残糖较高，特征香味不明显、缺少风味等共性问题，问题的出现与发酵菌种有重要关系。酵母是果酒发酵的原动力，酵母菌种的发酵性能直接影响所酿果酒的口感和风味[2]，特色果酒专用酵母的筛选、鉴定与培育是果酒产业发展中的核心问题[3]。香气是酒类品质的重要的评价指标之一，由于产香酵母在果酒发酵中，对枣酒的风味及成分有着重要影响，其代谢及发酵作用在很大程度上影响果酒的复杂性[4-6]。
低醇果酒乙醇体积分数为1%～7%，且口感柔和，风味优于普通果酒，可减少高酒精度对身体健康的危害，逐渐成为果酒研究的重要趋势。产香酵母的代谢特征是产乙醇低，正适于发酵低醇果酒，所以筛选产香酵母，对开发低醇枣酒产品有实际意义[7-9]。近年已有产香酵母发酵低醇果酒的研究[10-13]。目前野生红枣酵母分离筛选的研究较少，权英等[14-17]分离筛选过野生红枣酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），鲜见野生红枣产香酵母分离筛选的研究报道。
本研究首先从自然发酵木枣中分离、筛选产香特性好的酵母，然后根据枣酒酿造要求，筛选出适宜的产香酵母并应用于枣酒发酵，测定枣酒的理化和感官指标进行评价，最后采取分子生物学方法对酵母进行鉴定。有益于解决枣酒生产存在的共性问题，为酿造出香气丰满纯正、特征香气明显，独具特色的地域性酒种提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与试剂
酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、乙醇（均为分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母浸粉（均为生化试剂）：北京奥博星生物技术有限公司；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）引物：上海派森诺生物科技有限公司；D4030A型脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTP）、DRR20AM型Taq聚合酶：日本TaKaRa Bio株式会社；琼脂糖：上海生工生物工程股份有限公司。
1.1.2 培养基
酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）液体培养基：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，自然pH值，115 ℃高压蒸汽灭菌30 min；YEPD固体培养基：在YEPD液体培养基中添加2%琼脂粉。
1.2 仪器与设备
YXQ-SG46-280S型压力蒸汽灭菌锅、SPX-100B-Z型生物培养箱、THZ-82型气浴恒温振荡器：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Nikon Eclipess E100型生物显微镜：日本尼康株式会社；Neofuge 13R型台式高速冷冻离心机：上海力申科学仪器有限公司；ABI-2720型PCR仪：美国AppliedBiosystems公司；Nano Drop 2000型ND2000：美国Thermo公司；Mini Pro 300V Power Supply型电泳仪：major science公司；Labnet Sub System 70型电泳槽：美国Labnet Inc公司；ABI 3730XL型测序仪：美国Applied Biosystems公司；6890N-5975B型气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent公司；100 μL PDMS 萃取纤维头的固相微萃取针：美国Supelco公司。
1.3 实验方法
1.3.1 产香酵母菌的分离
于山西木枣种植园采集新鲜木枣样品，整枣用纯净水清洗后，加纯净水自然发酵，分别于发酵前期、中期、后期取发酵液用于酵母菌分离[18]。发酵液经梯度稀释后，取0.2 mL涂布于YEPD培养基平板，于28 ℃培养48 h，对具有典型酵母菌落特征的单菌落进一步划线分离，经镜检为纯种后分别移种单菌落于YEPD斜面上，冷藏备用。
1.3.2 产香酵母的筛选
一级筛选：产香酵母筛选方法参考刘文丽等[19]采用嗅闻法，即将产香酵母菌种转接斜面培养24 h后，将斜面置于鼻孔下方，嗅闻挥发香气，评价指标为香气的有无和浓淡等产香效果。
二级筛选：采用枣汁发酵法，评价指标为酒精度和香气特征。菌株活化：28 ℃条件下于YEPD培养基中振荡培养16 h；发酵：28 ℃在200 mL 20°Bx枣汁中发酵5～35 d；菌液浓度为107～108 CFU/mL，接种量体积分数为4%。试验平行重复3次。
1.3.3 产香酵母发酵枣酒试验
菌株活化：菌株先在含有20°Bx枣汁的试管中28 ℃振荡培养16 h，然后转入含有20°Bx枣汁的三角瓶中继续扩大培养16 h。发酵：28 ℃在350 mL 20°Bx枣汁中发酵5～35 d；菌液浓度为107～108CFU/mL，接种量总体积分数为4%。试验平行重复3次。分别采用纯种发酵与混菌发酵的方式：（1）将筛选的产香酵母单独发酵枣汁。（2）将筛选的产香酵母与商业酿酒酵母按1∶1，进行顺序接菌，即先接入产香酵母，发酵2 d后再接入酿酒酵母发酵枣汁。发酵完成后，对酒样进行理化分析和感官品评。对照为商业酿酒酵母发酵的枣汁。
1.3.4 枣酒理化指标测定及感官评定
酒精度、总糖、总酸等理化指标的检测参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[20]。感官品评：参照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中葡萄酒感官评定要求，制定枣酒感官评定标准，见表1。
表1 枣酒感官评定标准
Table 1 Sensory evaluation standards of jujube wine
1.3.5 酵母香气成分的测定[21]
酵母香气成分的测定采用顶空固相微萃取（headspacesolid phase microextraction，HS-SPME）-气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。前处理方法：称取适量样品置于顶空瓶中，加3 mL饱和NaCl溶液密封，于80 ℃条件下平衡30 min，用固相微萃取针萃取30 min，待萃取结束后，萃取针在进样口解吸5 min。
GC-MS分析条件：HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；分流比：不分流；载气流速：1.0mL/min；进样口温度：240 ℃；扫描方式：全扫描；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：180 ℃。升温程序：起始温度：45 ℃，保持4 min，以6 ℃/min的速率升至130℃，再以10℃/min的速率升至240℃，保持8min。
定性、定量方法：采集到的质谱图利用美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）谱库进行检索，定性鉴定样品中的挥发性成分，并利用峰面积归一化法分析各成分的相对含量。
1.3.6 真菌ITS测序鉴定产香酵母
根据真菌基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提试剂盒说明书提取酵母菌的DNA，以其为模板，采用引物26sF（5'-GCATATCGGTAAGCGGAGGAAAAG-3'）和26sR（5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）进行PCR扩增。PCR扩增体系：1.0 μL基因组DNA，5.0 μL 10×Buffer，1.0 μLTaq聚合酶，1.0 μL dNTP，1.5 μL 26sF引物，1.5 μL 26sR引物，39.0 μL双蒸水（ddH2O），总体积50.0 μL[22]。PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循环35次；72 ℃终延伸7 min。反应完成后，取3 μL PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。取各个菌种纯化后的PCR产物，使用测序仪ABI3730-XL进行DNA测序。用美国国家生物技术信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）将拼接后的序列文件进行同源性比对，得到与待测物种序列相似性最大的物种信息，采用MEGA6.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 木枣野生产香酵母菌株的分离
酵母群的种类与地理气候条件有关，每年都有微小的变化[23]。本试验从木枣发酵液中共分离出232株产香酵母菌株，编号为Z1～Z232，依据菌株菌落和细胞形态学特征，将菌株分为3类。产香酵母菌株的分离结果见表2，菌落形态和细胞形态见图1。
表2 产香酵母菌株的分离结果
Table 2 Isolation results of aroma-producing yeast strains
图1 三类产香酵母菌菌株的菌落（a）和细胞形态（b）
Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of three aroma-producing yeast strains
由表2及图1可知，分离的232个菌株属于三类不同的产香酵母，它们在菌落、细胞形态学特征及出芽方式上不同。
2.2 产香酵母一级筛选
对保存的232株产香酵母菌株通过嗅闻斜面香气，鉴别菌株有无产香现象并比较香气的浓淡，结果如表3所示。
表3 产香酵母菌株产香试验结果
Table 3 Results of aroma-producing tests of aroma-producing yeast strains
由表3可知，产香效果较好的菌株有18株，菌株产香，香气较浓的菌株有11株，香气较淡的有7株，将这18株菌株进行二级筛选试验。
2.3 产香酵母二级筛选
对18株产香酵母菌株进行枣汁发酵试验，结果如表4所示。
表4 产香酵母菌株发酵枣汁结果
Table 4 Results of jujube juice fermentation by aroma-producing yeast strains
注：“-”表示未发酵。
产香酵母通过对枣汁发酵，产香特征较好的酵母菌株有Z1、Z2、Z5、Z12、Z29、Z228，其中产香特性最好的是菌株Z228。菌株Z188和Z191因在发酵枣汁时不产气，没有香味仅有酸味，未能完成发酵。发酵样品的酒精度均在4%vol～7%vol之间，不同样品酒精度相差不大，但是菌株Z228发酵枣酒香气较浓，所以筛选菌株Z228进行枣酒发酵试验。
2.4 产香酵母发酵枣酒试验
将产香酵母Z228单独或与酿酒酵母（1∶1）协同发酵枣汁，对照为商业酿酒酵母发酵的枣汁。发酵完成后测定枣汁发酵液理化指标同时进行感官品评，结果如表5、表6所示。
表5 不同菌种发酵枣汁理化指标测定结果
Table 5 Determination results of physical and chemical indexes of fermented jujube juice by different strains
表6 不同菌种发酵枣汁感官评定结果
Table 6 Sensory evaluation results of fermented jujube juice by different strains
酿酒酵母起酵快，但发酵稳定性差，持续时间短，5 d后即中止发酵，会导致枣酒残糖较高。产香酵母起酵慢，但发酵稳定，持续时间长，至少30 d后中止发酵，能充分发酵枣汁，并且能为枣酒提供丰富的香味成分。由表5及表6可知，酿酒酵母单独发酵枣汁，酒精度较高，为10.2%vol，残糖偏高，为9.7 g/L，香气较淡，口感、风格一般；产香酵母单独发酵枣汁，酒精度低，为6.2%vol，残糖高达75.3 g/L，营养成分多，酸度低，为1.6 g/L，香气浓，花香，口感略甜，柔和，酸苦味淡，风格明显，符合低醇果酒要求；产香酵母与酿酒酵母协同发酵枣汁，酒精度提高到13.3%vol，残糖降到5.6%vol，花香清香明显、协调，酒体丰满，苦味得以淡化。结果表明，协同发酵既能提高枣酒酒精度，降低残糖，又使枣酒拥有更加复杂的花香与果香气，原有苦味减弱，产品特色风格明显。产香酵母发酵时产酒精能力弱，但可消耗一部分糖，混菌发酵能明显提高酒样中花香和果香[24-26]。产香酵母产总酸比酿酒酵母和混菌发酵低，具备一定的降酸能力，这与刘小雨等[27]的实验结果一致。
2.5 产香酵母香气成分的测定
菌株Z228和对照酿酒酵母发酵枣汁的挥发性成分GC-MS分析总离子流色谱图见图2，香气成分及含量分别见表7、表8。
图2 菌株Z228（A）及酿酒酵母（B）发酵枣汁中香气成分GC-MS分析总离子流色谱图
Fig.2 Total ions chromatogram of aroma components in fermented jujube juice by strain Z228 (A) and Saccharomyces cerevisiae(B) analysis by GC-MS
表7 菌株Z228发酵枣汁中香气成分测定结果
Table 7 Determination results aroma components in fermented jujube juice by strain Z228
续表
表8 酿酒酵母发酵枣汁中香气成分测定结果
Table 8 Determination results of aroma components in fermented jujube juice by Saccharomyces cerevisiae
续表
由表7、表8可见，菌株Z228发酵枣汁中共测得46种主要香气成分：香气成分主要为醇类、酸类和酚类，主要为异戊醇（15.64%）、6-羟基烟酸（6.75%）、苯乙醇（2.47%），异戊醇（2.26%），4-乙基苯酚（1.10%）、4-乙基-2-甲氧基-苯酚（1.10%）等。其中乙醇含量极高，酯类含量很低，这和一般产酯较高的产香酵母不同。乙醇具有特殊香味，是合成乙酯的前体；6-羟基烟酸具有协调香气作用；苯乙醇具有柔和、愉快和持久的玫瑰香气，异戊醇具有苹果白兰地香气，苯乙醇、异戊醇等高级醇还能衬托酯香，使酒香更完美；4-乙基苯酚呈强烈木-酚气息，有轻微香甜气息；4-乙基-2-甲氧基-苯酚呈强烈香辛料、丁香和发酵似香气，有炒花生气息。
对照酿酒酵母发酵枣汁中共测得33种主要香气成分：辛酸乙酯（20.45%）、异戊醇（15.64%）、癸酸乙酯（15.41%）、乙酸-3-甲基丁酯（9.38%）、乙醇（9.11%）、己酸乙酯（7.95%）、乙酸乙酯（2.72%）、月桂酸乙酯（2.34%）、乙醛缩二乙醇（2.17%）、2-（氨基氧基）乙酸（1.82%）、苯乙醇（1.11%）、2,3-丁二醇（1.04%）等。香气成分主要为高级醇类、酸类和酯类，其中酯类含量较高。菌株Z228和酿酒酵母发酵枣汁香气成分区别较大，二者协同发酵，达到优势互补，并且能有效利用酸类和醇类合成更多酯类，使酒体丰满，香气复杂而有层次感。
2.6 产香酵母菌株的鉴定
依据菌落和细胞形态学特征，产香酵母菌株Z228初步鉴定为第二类（见表2），采用真菌ITS测序方法将产香酵母进一步鉴定，结果见图3。由图3可知，通过比对和构建系统发育树结果表明，产香酵母菌株Z228与季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）的序列同源性最高，相似度达到99.65%。与季也蒙毕赤酵母的亲缘关系最近，所以鉴定菌株Z228为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）。
图3 基于ITS基因序列酵母菌株Z228的系统发育树
Fig.3 Phylogenetic tree of yeast strain Z228 based on ITS gene sequences
3 结论
山西木枣种植园采集的木枣经自然发酵，从不同时期共分离出三类共232株产香酵母菌株，一级筛选采用嗅闻法筛选出产香效果较好的菌株有18株，二级筛选采用枣汁发酵法筛选出产香特性最好的菌株Z228，测定了菌株香气成分。将产香酵母Z228单独或与酿酒酵母协同发酵枣汁，结果表明产香酵母单独发酵枣汁，酒精度低，残糖高，酸度低，香气浓；协同发酵既能提高酒精度，降低残糖，又能使产品拥有更加复杂的花香与果香气味，原有苦味减弱，产品极具风味特色。最后通过分子生物学鉴定菌株Z228为季也蒙毕赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）。
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