威士忌是一种由大麦等谷物酿制，在橡木桶中陈酿多年后，调配成43度左右的烈性蒸馏酒[1-2]。威士忌作为英国的国酒，是与中国白酒、白兰地、伏特加、朗姆酒和金酒齐名的世界最著名的六大优质蒸馏酒[3]。威士忌在国际酒类贸易中占重要地位[4]，从进口的贸易金额来看，1997年～2017年英国是第一大进口市场，其贸易金额市场占比约为66.5%～93.7%；从出口贸易金额可以看出，近年来我国威士忌出口贸易金额呈增长趋势[5]。
发展特色的中国威士忌离不开特色的威士忌酵母，优良的威士忌酵母除了具有降糖速度快[6]、发酵周期短[7-8]、酒精产量高[9]和产出优质风味物质[10]等特点之外，还要在风味特征方面具有特色。2020年，WANIKAWA A[11]对使用啤酒酵母发酵威士忌的研究进展进行了综述，其中提到啤酒酵母产生的风味化合物会直接影响到威士忌酒的品质。REID S J等[12]研究了在发酵初期进行细菌发酵的效果，结果表明利用乳杆菌进行预处理可以改变酒的品质。2016年，孟金明[13]通混菌发酵提高了大麦酒的品质，采用顺序接种酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和汉逊酵母（Hansenula polymorpha），所得酒样醇酯比达到1∶1，酒的品质有明显的提高。在风味物质检测方面，2019年，JELEN′ H H等[14]采用气相色谱-嗅觉仪对单一麦芽威士忌的主要风味物质进行了鉴定，其研究结果可用于通过挥发性成分区分单一麦芽威士忌、单一麦芽泥煤威士忌、谷物威士忌和美国威士忌。2014年，BENDIG P等[15]用气相色谱-电子捕获负离子质谱测定了两种苏格兰单一麦芽威士忌中的溴酚，开发了一种适用于测定威士忌中二溴和三溴苯酚的方法。
本研究以大麦芽为原料，选用3种不同酵母（酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3）制备威士忌，对比酵母发酵性能、理化指标及出酒率，气相色谱（gas chromatography，GC）法测定酒样的风味物质，通过气味活度值（odor activity value，OAV）确定关键香气化合物及主成分分析（principal component analysis，PCA），并对其进行感官评价，考察不同酵母对威士忌品质的影响，通过初步研究为优良、特色威士忌酵母菌株的选育及应用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与菌株
大麦芽：克里斯普英国进口麦芽。
威士忌专用酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3：中国食品发酵工业研究院应用微生物菌种中心。
1.1.2 试剂
氢氧化钠（分析纯）：北京化工厂有限责任公司；甲醇、正丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇、异戊醇、活性戊醇、正己醇、乙醛、异丁醛、乙缩醛、丙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、β-苯乙醇、乙酸苯乙酯、糠醛、丙酮、3-羟基-2-丁酮（均为分析纯）：比利时ACROS 公司。
1.2 仪器与设备
50 L啤酒酿造设备：青岛优易酿自动化设备技术有限公司；6394麦芽粉碎机：德国KÜNZEL公司；20 L多功能蒸馏器、2.5 L多功能蒸馏器：烟台吉讯酿酒设备厂；CLARUS 600气相色谱仪：珀金埃尔默仪器有限公司；PHS-2F型pH计：上海雷磁仪器有限公司；0-40度、40-70度、70-100度酒精计：武强县新林仪器仪表有限公司；0-10度、10-20度糖度计：衡水华普仪器仪表有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 威士忌的加工工艺流程及操作要点
原料→粉碎→糖化→发酵→蒸馏→橡木桶存放→调配→威士忌
操作要点：
麦汁的糖化：以制作15°P麦汁50 L为目标，根据麦芽的出糖率以及设备的转化率，计算得麦芽的使用量为11.5 kg，麦芽的粉碎度为1.5 mm，加水的体积为35 L，在糖化过程中于45 ℃保温30 min，64 ℃保温60 min，70 ℃保温20 min[16]，通过碘检验作为观察糖化结束的方法，若滴加碘液后不变色则糖化完全，变蓝则糖化不完全。
发酵：将麦汁升温到80 ℃后移入发酵罐，入罐温度控制在（30±2）℃，40 g酵母粉先用400 mL水活化30 min后倒入麦汁中，发酵温度设置为28～32 ℃，发酵72 h，每8 h测定一次糖度，若连续两次糖度不变即得发酵液。每种酵母做3次平行实验。
发酵液的蒸馏：使用20 L多功能蒸馏器对发酵液过蒸馏塔蒸馏，蒸馏温度控制在（92±2）℃，收集蒸馏出的酒液，每隔10 min用酒精计测定一次蒸馏出酒液的酒精度，酒液酒精度降至5%vol停止收集。然后使用2.5 L多功能蒸馏器对过塔蒸馏出的酒液进行二次蒸馏，蒸馏温度控制在（82±2）℃，蒸馏时每收集50 mL酒液用酒精计测定一次酒液的酒精度，酒精度为76%vol及以上的酒液为酒头，60%vol～76%vol的酒液为酒身，40%vol～60%vol的酒液为酒尾，40%vol以下的酒液为废液。
存放：由于橡木桶存放时间较长，存放前风味的差异主要来源于酵母，存放后会减小这种差异[17]，不利于对比酵母对威士忌酒液的影响，因此本研究中仅对比橡木桶存放前的酒液。
调配：取上述蒸馏后的酒身用蒸馏水稀释至40%vol，得到威士忌。
1.3.2 分析检测
pH值的测定：采用pH计；糖度的测定：采用糖度计；总酸含量的测定：参照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[18]中第一法电位滴定法；酒精度的测定：参照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》[18]中第一法密度瓶法。
1.3.3 出酒率的计算
麦芽出酒率计算公式如下：
1.3.4 威士忌挥发性香气物质的检测
采用气相色谱法测定二次蒸馏后酒身的挥发性香气物质含量。准确吸取5 mL酒液样品于气相样品瓶中，上机测定。气相色谱条件：进样口温度250 ℃；检测器温度250 ℃；色谱柱：CP-WAX 57 CB（50 m×0.25 mm×0.2 μm）；载气为高纯氮气（N2）（纯度≥99.999%），流速1 mL/min；分流比20∶1；升温程序：40 ℃保温4 min，4 ℃/min升温到130 ℃，15 ℃/min升温到210 ℃，保持15 min。
定性定量的方法：根据色谱峰出峰时间与标准品出峰时间对照定性组分，并根据峰面积大小确定物质含量。
气味活度值（OAV）是酒样中挥发性香气物质的含量与其感官阈值的比值，可以客观的表现出该香气成分对于酒样整体风味物质的贡献程度，OAV＞1的香气成分对酒样的香气有显著影响，OAV越大说明该香气物质对酒样香气的影响越大[19]，其计算公式如下：
1.3.5 主成分分析
主成分分析是一种通过降维将多个变量变为少数综合变量，用简化的数据反应原始变量的大部分信息的统计方法[20]。利用主成分分析法对酒样的香气物质的气味活度值进行分析，可以得出香气综合得分较高的酒样，从而选出可以促进威士忌蒸馏酒产生优质风味的酵母。
1.3.6 感官评价
组成6人感官评价小组（其中男3人、女3人，6人均为国家评委）。感官评价的酒样为二次蒸馏后的酒身，酒精度为40%vol，每人对酒样的色泽（20分），香味（30分），滋味（40分）和典型性（10分）进行打分，满分100分，具体评价标准[21]见表1。
表1 威士忌的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of whisky
1.3.7 数据处理
采用SPSS 26.0对酒样的理化指标进行单因素方差分析（P＜0.05），对酒样的挥发性香气物质进行主成分分析；用Origin 9.0作图；用Excel 2016对数据进行处理。实验中理化指标的测定均重复测定3次，结果以“平均值±标准差”
表示。
2 结果与分析
2.1 不同酵母的发酵性能
降糖情况可以反映出酵母的发酵性能，降糖速度快说明酵母的发酵速度快[22]。
由图1可知，发酵时间在0～24 h时，酵母ACBC-1与酵母ACBC-2的降糖速度较快，酵母ACBC-3的降糖速度较慢；发酵时间在24～48 h时，酵母ACBC-1和酵母ACBC-2的降糖速度明显下降，酵母ACBC-3的降糖速度较快；发酵时间在48～72 h时，3种酵母的降糖速度趋于稳定。结果表明，发酵结束时（72 h），酵母ACBC-1残糖量为3.0 g/100 g，酵母ACBC-2残糖量为4.1 g/100 g，酵母ACBC-3的残糖量为3.8 g/100 g。在发酵结束时，剩余发酵液的糖度值越低说明酵母发酵能力就越强[23]。因此，酵母ACBC-1发酵性能最强。
图1 不同酵母的发酵性能曲线
Fig.1 Fermentation performance curves of different yeasts
2.2 不同酵母发酵液理化指标测定
pH值是影响酶活和酵母新陈代谢的重要因素，总酸含量对风味有不同的影响。由表2可知，以麦汁作为对照样，对比3种酵母发酵液的糖度可知，经过发酵后的麦汁糖度明显下降，其中酵母ACBC-1发酵液糖度为3.00 g/100 g，其发酵能力显著高于其他两种酵母（P＜0.05），酵母ACBC-2和酵母ACBC-3的发酵能力无显著性差异（P＞0.05）。3种酵母发酵液的酒精度在5.24%vol～6.42%vol之间，酵母ACBC-2和酵母ACBC-3的产酒精能力无显著性差异（P＞0.05）。3种酵母发酵液的pH值在3.66～4.10之间，总酸含量在3.73～4.17 g/L之间，与发酵前的麦汁相比，3种酵母发酵液中总酸含量上升，pH值下降，酵母ACBC-2的发酵液总酸含量（4.17 g/L）显著高于其他两种酵母发酵液（P＜0.05），说明酵母ACBC-2的产酸能力较强。因此，从不同酵母发酵液的理化指标来看，酵母ACBC-1最佳。
表2 麦汁及不同酵母发酵液的理化指标测定结果
Table 2 Determination results of physical and chemical indexes of wort and fermentation liquid with different yeasts
注：同一列数值后面的不同字母表示差异显著（P＜0.05）；“-”表示未检出。下同。
2.3 不同酵母发酵麦芽对出酒率的影响
由表3可知，酵母ACBC-1的单位麦芽出酒率（70.78 mL/kg）高于其他两种酵母，表明在使用相同质量原料的情况下，酵母ACBC-1可以生产出更多的酒精。
表3 不同酵母发酵麦芽出酒率
Table 3 Liquor yield of malt fermented by different yeasts
2.4 不同酵母发酵对威士忌酒样挥发性香气物质的影响
2.4.1 3种酵母制备威士忌酒样香气成分分析
由表4可知，3个酒样中共检出挥发性香气物质24种，包括醇类8种，醛类4种，酯类7种，芳香族2种，呋喃类1种，其他类2种。其中醇类化合物含量较高，酵母ACBC-1、ACBC-2、ACBC-3发酵制备威士忌蒸馏酒中的醇类化合物含量分别为4 026.57 mg/L、3 124.88 mg/L、4 458.67 mg/L。酒样ACBC-3的异戊醇含量最高（2 426.67 mg/L），可以为酒体提供水果香和花香，酒样ACBC-1的正丙醇含量最高（533.05 mg/L），可以为酒体提供花香和青草香。酒样ACBC-1酯类化合物的含量（148.60 mg/L）和芳香族化合物的含量（164.45 mg/L）明显高于其他两个酒样。
表4 3种酵母制备威士忌中挥发性香气物质含量测定结果
Table 4 Determination results of volatile aroma compounds contents in whisky produced by 3 kinds of yeasts
续表
2.4.2 挥发性香气物质气味活度值分析
酒液中的挥发性香气成分含量和对酒体香气的贡献不一定成正比，还要综合香气物质的香气特征和感官阈值来判断。
由表5可知，3个酒样共检出了9种OAV＞1的香气物质，醇类物质的OAV＞1的香气物质有4种，酯类物质的OAV＞1的香气物质种类最多（5种），说明酯类物质对酒样香气作用显著。酒样ACBC-1乙酸苯乙酯的OAV最高（103.92），给酒液带来玫瑰香和草莓香，酒样ACBC-2中OAV较大的物质是乙酸异戊酯（OAV为44.98），酒液具有香蕉香，酒样ACBC-3中OAV较高的物质是乙酸苯乙酯（OAV为23.48），赋予酒样玫瑰香和草莓香。结果表明，乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯及乙酸苯乙酯是威士忌的关键香气物质，对酒样的香气贡献最大。
表5 不同酵母制备威士忌酒样中挥发性香气物质的气味活度值
Table 5 Odor activity value of volatile aroma substances in whisky samples produced by different yeasts
注：“a”表示OVA由含量与对应感官阈值计算得来；“b”表示感官阈值来自参考文献[24]。
2.5 主成分分析
不同酵母制备威士忌酒样风味物质主成分分析结果见表6，主成分的特征向量和载荷矩阵见表7，不同酒样风味物质主成分分析PCA得分图及载荷图见图2。
图2 不同酵母制备威士忌酒样风味物质主成分分析得分图（a）及载荷图（b）
Fig.2 Principal components analysis scores (a) and loading plots (b) of flavor substances in whisky samples produced by different yeasts
表6 不同酵母制备威士忌酒样风味物质主成分的方差贡献率
Table 6 Variance contribution rate of principal components of flavor compounds in different whisky samples produced by different yeasts
表7 主成分的特征向量和载荷矩阵
Table 7 Characteristic vectors and loading matrix of principal components
由表6可知，不同酒样风味物质共提取出两个特征值＞1的主成分，两个主成分的特征值分别是7.697和3.303，方差贡献率分别为69.973%和30.027%，累计方差贡献率为100%，说明2个主成分可以完整反应风味物质的信息。
由表7可知，第一主成分中载荷较高的风味物质有异戊醇、正丙醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯，载荷值的绝对值均大于0.8，其中正丙醇、β-苯乙醇、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯和乙酸苯乙酯为正相关，异戊醇为负相关，第一主成分的方差贡献率为69.973%，说明第一主成分对酒样风味影响最大。第二主成分中载荷值较大的风味物质有正丁醇、己酸乙酯、乙醛，载荷值的绝对值均＞0.78，其中正丁醇和乙醛为正相关，己酸乙酯为负相关，第二主成分的方差贡献率为30.027%。
由图2（a）可知，3种酒样间区分较好，且不同酒样分别位于图的不同区域。由图2（b）可知，酒样ACBC-3位于第一主成分和第二主成分的负半轴，得分均小于0；酒样ACBC-2位于第一主成分的负半轴和第二主成分的正半轴；酒样ACBC-1位于第一主成分的正半轴和第二主成分的负半轴。
酒样ACBC-3中异戊醇含量较高，因此主要分布在第一主成分和第二主成分的负半轴；酒样ACBC-2中的正丁醇含量较高，因此主要分布在第一主成分的负半轴和第二主成分的正半轴；酒样ACBC-1中乙酸乙酯、正丙醇、丁酸乙酯、己酸乙酯和乙酸苯乙酯含量较高，因此分布在第一主成分的正半轴和第二主成分的负半轴[25]。
2.6 不同酵母对威士忌酒样风味物质影响的综合评价
由表6可知，当提取2个主成分时累计方差贡献率已经达到100%，因此两个主成分就足够描述不同酒样的总体风味物质水平。采用PCA分析，得出F1和F2两个综合指标代替原来的11个指标对威士忌酒样的风味物质进行分析，最终得到的2个主成分因子的方程如下：
式中：F1为各个酒样中第一主成分的综合指标，F2为各个酒样中第二主成分的综合指标，下同，X1～X11分别表示酒样中各风味物质经过标准化处理的值。
根据PCA分析的结果，用各主成分的方差贡献率作为权重，对两个主成分得分进行加权求和，建立评价函数F=0.699 73F1+0.300 27F2，式中F表示各个酒样的综合评价分值，计算各酒样的综合评分，得出酒样风味物质水平高低。不同酒样的主成分得分及综合得分见表8。
表8 不同酵母制备威士忌酒样的主成分得分及综合得分
Table 8 Principal components scores and comprehensive scores of whisky samples produced by different yeasts
由表8可知，在3个酒样中，酒样ACBC-1综合得分最高为1.87分，明显高于其他酒样，说明其风味较好，酒样ACBC-2综合得分为0.26，酒样ACBC-3的综合得分为负值（-2.13分），说明这两个酒样风味较差。
2.7 不同酵母制备威士忌的感官评价
不同酵母制备威士忌蒸馏酒酒样的感官评分雷达图见图3。
图3 不同酒样感官评分雷达图
Fig.3 Radar chart of sensory evaluation of whisky samples produced by different yeasts
由图3可知，在色泽方面，3个酒样感官评分均为20分，酒液澄清透亮；在香气方面，酒样ACBC-1平均得分最高为27.8分，酒香愉悦；在滋味方面，酒样ACBC-1平均得分最高为33.8分，酒体丰满醇厚，果香纯正；在典型性方面，酒样ACBC-1平均得分为8.4分，典型明确，酒体组分较协调。酒样ACBC-1感官评价综合得分最高，总分为90分。
3 结论
该研究以大麦芽为原料，选用3种不同酵母发酵制备威士忌蒸馏酒。结果表明，酵母ACBC-1的发酵性能最好，其发酵液的理化指标良好（总酸3.73 g/L，残糖3.00 g/100 g，酒精度6.42%vol，pH 4.1），出酒率最高（70.78 mL/kg）。3个酒样共检出24种风味物质，其中醇类化合物含量最多，占总含量的77%～98%；OAV＞1的酯类化合物种类最多（5种），其中乙酸苯乙酯、乙酸异戊酯及乙酸苯乙酯是关键香气物质，对酒样的香气贡献最大。酵母ACBC-1制备威士忌感官评分为90分。因此，酵母ACBC-1是适合酿造威士忌的优良菌株。
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