泡菜在我国已有3 000多年的历史，以清脆、开胃、爽口著称[1-2]。泡菜是以新鲜的蔬菜为主要原料，在酵母和乳酸菌等的作用下通过厌氧发酵而成的一种发酵食品[3]，具有解腻开胃、助消化、调节肠道微生态平衡、抗氧化、抑菌、控制体质量、抗动脉粥样化等功效[4-5]。乳酸菌主导着泡菜的发酵过程，在泡菜发酵的过程中起着重要作用，乳酸菌在发酵的各个阶段种类和数量的多少直接关系到泡菜的品质和风味[1，3]。
便秘是一个最为普遍的肠道疾病，全球约有16%的人群被功能性便秘困扰[6]，研究表明便秘是结肠癌、肠应激综合症和其他胃肠道疾病发生的危险信号[7]。有效地药物疗法包括膨胀剂、渗透性泻药、刺激性泻药、粪便软化剂等[8]，但据报道这种疗法有几个严重的副作用，如腹泻、结肠黑变病、心律失常、腹部绞痛、冠心病动脉收缩、甚至心肌梗塞[7]。因此，需要找到一个更加安全、有效的治疗便秘方法。在肠道中乳酸菌通过代谢产酸，能够抑制有害菌在肠内的繁殖，维持肠道生态平衡，提高肠道机能，促进肠道运动，增加粪便含水量，起到润肠通便的作用[9]。LI C等[7]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）NCU116能够显著提高小鼠粪便含水率，加快肠道蠕动，提高短链脂肪酸的含量，改善小鼠便秘，具有润肠通便功能。WANG L L等[10]研究发现，青春双岐杆菌（Bifidobacterium adolescentis）通过在肠道内定植影响肠道微生物群体结构进而改善小鼠便秘，具有润肠通便的效果。QIAN Y等[11]研究报道一株发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）Lee能够预防和改善小鼠便秘。彭芝榕等[12]研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）F1208给药7 d后显著提高便秘大鼠采食量、饮水量，促进大鼠生长发育，增加排便粒数和粪便含水量，显著提高便秘大鼠小肠碳墨汁推进率，能够改善便秘大鼠胃肠道功能。周晓丹等[13]研究发现，副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）LC-01能够缩短便秘小鼠首次排便时间，显著增加小鼠排便粒数和质量，提高粪便水分含量，显著增加便秘小鼠小肠墨汁推进率，具有良好的润肠通便功能，同时研究发现菌株LC01在肠道内具有较好的生存能力[14]。此外，乳酸菌还具有促进营养物质消化和吸收、调节肠道菌群、提高免疫力等功效[15]，因此，乳酸菌随泡菜一起进入人体，能够在人体内发挥重要的益生作用。
该研究将乳酸菌的产酸能力作为初筛指标，采用稀释涂布平板法从贵州泡菜中分离鉴定乳酸菌，并使用复方地芬诺酯建立小鼠便秘模型，以麻仁丸作为阳性药物，以干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）LC-01作为阳性对照菌，筛选出具有润肠通便功能的乳酸菌，同时比较了优选菌株与菌株LC-01的耐受性和黏附性，为开发安全、有效的便秘预防和治疗菌株提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
贵州泡菜样品：采自贵州黔东南苗族侗族自治州（编号为20GZ1～20GZ11）和黔南布依族苗族自治州（编号为20GZ12～20GZ23）地区少数民族农户采用传统方法制作的自然发酵泡菜样品，详情见表1。远交系美国癌症研究所（Institute of Cancer Research，ICR）雄性无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级小鼠（体质量18～22 g，6～8周龄）：浙江省中医药大学动物实验中心；人结直肠腺癌细胞HT-29：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）LC-01：杭州娃哈哈集团有限公司菌种资源库。
表1 贵州泡菜样品信息
Table 1 Information of samples from Guizhou Paocai
续表
复方地芬诺酯（批号1405021）：常州康普药业有限公司；麻仁丸（批号1402812）：杭州胡庆余堂药业有限公司；细菌/细胞总脱氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid，DNA）提取试剂盒：北京天根生化科技有限公司；MRS培养基：英国Oxoid公司；活性炭、阿拉伯树胶：广州市金华大化学试剂有限公司；牛胆盐（生化试剂）：Sigma-Aldrich（中国）有限公司。
1.2 仪器与设备
Baker Type B2 SterilGARD III生物安全柜、DU800紫外分光光度计：美国贝克曼公司
GX2聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪、5810 R离心机：德国Eppendorf公司；Delta 320 pH计、JA2003N电子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；DNP-111电热恒温培养箱：上海海向仪器设备厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩水市英谷硲予华仪器厂；MX-S漩涡振荡器：大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；MLS-3780高压蒸汽灭菌锅：日本三洋株式会社；OLYMPUS BX61光学显微镜：日本奥林巴斯株式会社。
1.3 方法
1.3.1 菌株分离纯化与鉴定
取泡菜样品，筛网过滤后，取1 mL加入9 mL无菌生理盐水中，然后10倍梯度稀释，各取10-1、10-3、10-5稀释度100 μL分别涂布于固体MRS培养基平板上，于37 ℃厌氧培养48 h。根据形态特征挑选典型菌落，挑取单个菌落划线分离2～3次，反复划线获得纯菌株，编号，进行革兰氏染色，镜检。菌株以1%的接种量接种到含有MRS液体培养基的试管中，在37 ℃条件下培养24 h取样测定pH值，判断该试验菌株的产酸能力。
取适量对数生长期的菌株纯培养物，利用天根细菌基因组脱氧核糖核酸（DNA）提取试剂盒（离心柱型）提取菌体DNA，采用细菌16S片段通用引物27F（5'-AGTCTCTGATCATGC-3'）和1492R（5'-AAGGAGGTGCTCCAGCC-3'）进行16S rDNA片段的扩增。PCR扩增反应体系：模板DNA 0.5 μL，引物（10 mmol/L）各0.5 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，用双蒸水（ddH2O）补至20 μL。PCR扩增程序：94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、1 min，30个循环；72 ℃、10 min。PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序结果采用DNAMAN软件双向拼接后，结果通过美国国家生物技术信息中心（nationalcenter for biotechnology information，NCBI）网站（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中的基本局部比对搜索工具（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）进行序列相似性比对分析[16]。根据菌株16S rRNA序列，通过MEGA5软件，采用最大似然法构建系统发育进化树。
1.3.2 菌株润肠通便功能筛选动物实验
ICR小鼠自购入起适应1周后，按体质量随机分组，共分为9组，每组12只。分组如下：阳性药物对照组灌胃麻仁丸，灌胃剂量为2 g/kg小鼠体质量；乳酸菌组灌胃受试菌株，剂量为1×109 CFU/kg小鼠体质量，以菌株LC-01为阳性对照菌。对照组和模型组每天灌胃0.2 mL 0.85%生理盐水，其他处理组每天灌胃等体积的受试物溶液，各组受试物连续灌胃7 d。动物饲养保持环境温度为（21±2）℃，相对湿度为30%～70%，12 h光照交替，自由摄入小鼠维持饲料和饮水。小鼠在实验0和7 d各称质量1次。
小鼠排便实验[17]：受试样品给喂7 d后，各组小鼠禁食不禁水16 h。对照组给喂0.85%生理盐水，模型组、给药组给予0.05%复方地芬诺酯悬液0.3 mL（10 mg/kg小鼠体质量），给药0.5 h后，对照组和模型组小鼠灌胃墨汁0.2 mL，给药组给喂含受试样品的墨汁0.2 mL（墨汁含5%活性炭和10%阿拉伯胶）。灌胃墨汁后，每只小鼠单笼饲养，观察并记录每只小鼠首粒排黑便时间，以及6 h内排黑便的粒数及质量。
小肠推进实验[17]：受试样品给喂7 d后，各组小鼠禁食不禁水16 h。对照组给喂0.85%生理盐水，模型组灌胃给予0.025%复方地芬诺酯悬液0.3 mL（5 mg/kg小鼠体质量），给药0.5 h后，对照和模型组给予墨汁灌胃0.2 mL，给药组给予含受试样品的墨汁0.2 mL。25 min后立即脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲肠部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”，墨汁推进率计算公式如下：
1.3.3 筛选菌株生物学特性研究
（1）生长曲线及产酸曲线
筛选菌株以1%的接种量接种到含有MRS液体培养基的试管中，传至2代后，筛选菌株按1%接种量接种到MRS培养基中，在37 ℃条件下培养4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、16 h、24 h，取样测定pH值，在波长600 nm处测定样品的光密度（optical density，OD600nm）值，判断筛选菌株的生长速度和产酸能力。
（2）耐酸性实验
筛选菌株以1%的接种量接种到含有MRS液体培养基的试管中，传至2代后，取适量菌液，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入等体积pH值为2.5的MRS液体培养基中，重悬，37 ℃培养，分别取0、1 h、2 h、4 h的菌液用平板计数法测定活菌数，以此判断筛选菌株的耐酸能力[18]。
（3）耐胆盐性实验
筛选菌株以1%的接种量接种到含有MRS液体培养基的试管中，传至2代后，取适量菌液，4 ℃、1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入等体积含有0.3%胆盐的MRS液体培养基中，重悬，37 ℃培养，分别取0 h、4 h和8 h的菌液用平板计数法测定活菌数，以此判断筛选菌株的胆盐耐受能力[18]。菌株存活率计算公式如下：
（4）黏附性实验
人结直肠腺癌细胞HT-29复苏后传至第三代，以细胞悬液浓度为1×106 CFU/mL接种于已放置细胞爬片的6孔细胞培养板中，于37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养。菌株以1%的接种量接种于液体MRS培养基中，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，菌浓度调到2×108 CFU/mL。取1 mL菌液接种于含有HT-29细胞和细胞爬片的6孔细胞培养板中，37 ℃、CO2培养箱中孵育2 h。孵育结束后，缓慢吸去培养液，无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤，无水甲醇固定8 min。取出细胞爬片，经革兰氏染色后，用中性树脂封片。于光学显微镜下进行观察，每个片子随机选取10个视野计数，每株菌3个重复[19]。
1.3.4 统计分析
测定指标均表示为3次平行实验的平均值±标准偏差。显著性分析采用SPSS17.0软件中的Duncan's多重比较检验法进行分析，显著水平设置为0.05。
2 结果与分析
2.1 菌株分离纯化与鉴定
采用稀释涂布平板法从23个贵州泡菜样品中分离得到77株乳白色圆形菌落的乳酸菌疑似菌株，对其编号为GZ1～GZ77，经革兰氏染色后，共计得到革兰氏阴性菌31株，革兰氏阳性菌46株。根据菌株在MRS培养基中的产酸特性，最终挑选出5株产酸强的菌株（编号为GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54），且都在卫生部2010年颁布的《可用于食品的菌种名单》中。
菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54的革兰氏染色结果见图1。由图1可知，菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54均为革兰氏阳性菌。
图1 5株菌的革兰氏染色结果
Fig.1 Gram staining results of 5 lactic acid bacteria
菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54的系统发育树见图2。
图2 基于16S rRNA序列的5株乳酸菌系统发育树
Fig.2 Phylogenetic tree of 5 lactic acid bacteria based on 16S rRNA gene sequences
由图2可知，菌株GZ9和GZ47被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株GZ15和GZ54被鉴定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），菌株GZ20被鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermenti）。菌株GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54的信息见表2。
表2 受试菌株的信息
Table 2 Information of tested strains
2.2 润肠通便功能动物实验
为了筛选具有润肠通便功能的乳酸菌，选取远交系ICR小鼠，利用复方地芬诺酯建立便秘模型，并选取麻仁丸为阳性药物对照，以菌株LC-01作为阳性菌株对照，比较5株乳酸菌（GZ9、GZ15、GZ20、GZ47、GZ54）的润肠通便效果。
2.2.1 小鼠排便实验
实验期间小鼠灌胃受试药物与受试菌株菌悬液均未发现明显不适症状，无意外死亡情况。对小鼠体质量进行监控，结果见表3。由表3可知，在7 d内，与模型组相比，不同处理组小鼠体质量均无显著性差异（P＞0.05），表明灌胃受试剂量的试验药物与试验菌株菌悬液对小鼠体质量均无显著影响（P＞0.05）。
表3 小鼠灌胃受试药物及菌悬液前后体质量的变化
Table 3 Change of mice body weight before and after intragastric administration with tested drug and bacterial suspension
受试样品给喂7 d后，进行小鼠排便情况测定，结果见表4。由表4可知，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的首次排黑便时间显著增加，6 h排黑便粒数和排黑便质量均显著降低，表明采用复方地芬诺酯悬液灌胃制造便秘模型造模成功。
表4 灌胃受试药物及菌悬液对便秘小鼠排便指标的影响
Table 4 Effect of intragastric administration with tested drug and bacterial suspension on defecation indexes of constipation mice
注：“*”表示与模型组相比具有显著性差异（P＜0.05）；“**”表示与模型组相比具有极显著性差异（P＜0.01）。下同。
由表4可知，药物组小鼠连续灌胃7 d麻仁丸溶液，与模型组小鼠相比，6 h排黑便质量显著增加，但首次排黑便时间和6 h排黑便粒数与模型组相比无显著性差异（P＞0.05），但优于模型组。与模型组小鼠相比，灌胃1×109 CFU/kg小鼠体质量的菌株GZ9和GZ15菌悬液均可以显著减少小鼠的首次排黑便时间（P＜0.01），与菌株LC-01相当。灌胃菌株GZ9和GZ15菌悬液的小鼠，其6 h排黑便粒数和排黑便质量与模型组小鼠相比显著提高（P＜0.05），且高于菌株LC-01。其中，经菌株GZ15菌悬液灌胃处理的小鼠，其首次排黑便时间、6 h排黑便粒数和排黑便质量3项指标均优于其他4株菌和菌株LC-01，说明菌株GZ15菌悬液能够降低便秘小鼠首次排黑便时间，增加便秘小鼠6 h排黑便粒数和排黑便质量，润肠通便的效果显著。
2.2.2 小肠墨汁推进实验
实验期间小鼠灌胃受试药物与受试菌株菌悬液均未发现明显不适症状，无意外死亡情况。对小鼠体质量进行监控，结果见表5。由表5可知，在7 d内，与模型组相比不同处理组小鼠体质量均无显著性差异（P＞0.05），表明灌胃受试剂量的试验药物与试验菌株菌悬液对小鼠体质量均无显著影响（P＞0.05）。
表5 小鼠灌胃受试药物及菌悬液前后体质量的变化
Table 5 Change of mice body weight before and after intragastric administration with tested drug and bacterial suspension
受试样品给喂7 d后，进行小鼠小肠墨汁推进实验，结果见表6。由表6可知，各处理组小鼠的小肠总长度无显著性差异（P＞0.05）。与对照组小鼠相比，模型组小鼠的墨汁推进率显著降低（P＞0.01），表明采用复方地芬诺酯悬液灌胃制造便秘模型造模成功。由表6亦可知，与模型组小鼠相比，药物组小鼠的墨汁推进率显著高于模型组（P＜0.05）；灌胃1×109CFU/kg小鼠体质量的菌株GZ15菌悬液小鼠，其墨汁推进率显著高于造模组小鼠（P＜0.05），且优于其他4株菌，与菌株LC-01相当，说明菌株GZ15菌悬液能够提高便秘小鼠墨汁推进率，与小鼠排便实验结果一致，润肠通便的功能显著。
表6 灌胃受试药物及菌悬液对便秘小鼠墨汁推进率的影响
Table 6 Effect of intragastric administration with tested drug and bacterial suspension on the ink propulsion rate of constipation mice
2.3 菌株GZ15生物学特性研究
2.3.1 菌株GZ15生长和产酸特性
生长曲线和产酸速率是乳酸菌活力良好的重要特征之一，同时产酸速率也是筛选优良菌株的重要指标[15]。由图3A可知，菌株GZ15生长迅速，在接种后4 h进入对数生长期，14 h进入稳定期。由图3B可知，在接种菌株GZ15后产酸趋于平稳，培养16 h时pH达3.85±0.07，显示出较好的产酸能力。
图3 菌株GZ15的生长（A）和产酸（B）曲线
Fig.3 Growth (A) and acid production (B) curves of strain GZ15
2.3.2 菌株GZ15的酸和胆盐耐受性
胃液pH根据饮食的不同，通常在3.0附近波动，但饮食酸性食物后pH降至1.5左右，饮食碱性食物pH在4.0～4.5之间[20]，食物在胃中通过的时间一般是0～4 h[21]。由表7可知，在pH 2.5的酸性环境下孵育4 h后，存活率高达99.40%，活菌数达到5.91×108 CFU/mL，与对照菌LC-01相当，其存活率为99.05%。在0.3%胆盐环境下孵育8 h后，活菌数存活率高达98.37%，达到4.71×107 CFU/mL，优于对照菌LC-01，表现出较好的胆盐耐受性。说明菌株GZ15具有较好的酸和胆盐耐受性，能够在胃肠道严苛的环境下长时间保持较高活性。
表7 菌株GZ15的酸及胆盐耐受性
Table 7 Acid and bile salt tolerance of strain GZ15
2.3.3 菌株GZ15的黏附性
乳酸菌对肠道上皮细胞的黏附作用有助于其在肠道定植、抑制病原菌定植、增强其与肠道细胞之间的信号转导和提高机体的免疫力[22]。而目前普遍认为乳酸菌黏附性是评价其是否具有优良特性重要标准，菌株GZ15在人结直肠腺癌细胞HT-29表面的黏附性见图4。由图4可知，菌株GZ15表现出高黏附能力，每个细胞表面可黏附（4.68±0.59）个，显著高于菌株LC-01[（3.72±0.14）个，P＜0.05）]，是菌株LC-01的1.26倍，说明菌株GZ15能够黏附于肠道黏膜细胞表面，显示出较高的肠道定植活性。
图4 菌株LC-01（a）及菌株GZ15（b）对人结直肠腺癌细胞HT-29黏附性
Fig.4 Adhesion of strain LC-01 (a) and strain GZ15 (b) to human colorectal adenocarcinoma cell HT-29
3 讨论
便秘是由于肠道功能紊乱引起的慢性疾病，主要临床症状有排便困难、排便频率低、粪便干硬和延长肠道排空时间[10]。乳酸菌在胃肠道中扮演着重要角色，影响着宿主健康，补充乳酸菌能够调节肠道菌群平衡、缓解便秘[7，11-13]。复方地芬诺酯是一种小鼠便秘模型造模常用药物，其主要是直接作用于肠道平滑肌，通过抑制肠黏膜感受器，消除局部肠黏膜蠕动反射而使肠道蠕动减慢，使肠内容物通过延迟，致使小鼠排便困难，与便秘临床症状相近[13]。麻仁丸作为临床用于治疗便秘的常用药，其疗效确切。口服益生菌，能够调节肠道菌群平衡，保护肠道健康，可带来显著的通便效果，近年来多项研究表明益生菌能够治疗功能性便秘[7，11-13]。副干酪乳杆菌LC-01具有良好的润肠通便功能[13]，并在肠道内具有较好的生存能力[14]。本研究采用止泻剂复方地芬诺酯建立便秘模型，以麻仁丸作为阳性药物对照，以副干酪乳杆菌LC-01作为阳性对照菌，发现在5株菌中干酪乳杆菌GZ15降低复方地芬诺酯引发的便秘小鼠首次排黑便时间最显著，小鼠6 h排黑便粒数、排黑便质量和小鼠墨汁推进率最高，效果与麻仁丸相当，优于副干酪乳杆菌LC-01。说明干酪乳杆菌GZ15具有良好的润肠通便功能。
目前，普遍认为优良的乳酸菌应具备如下条件：对胃肠道环境具有高的耐受性；能够在肠道中定植；具有高的安全性；临床效果明显[23]。乳酸菌的黏附性被认为是其定植肠道，发挥益生功能的前提和基础，而优良的乳酸菌还应具有良好的生长特性和产酸特性，必须能够在胃中酸性条件和消化酶条件下存活，其次能够通过小肠高浓度胆盐条件，黏附于肠道细胞表面，定植在肠道中，竞争性排斥病原菌在肠道中的黏附，长期释放一些功能性物质，如乳酸、短链脂肪酸、抗菌肽、维生素和一些功能酶，帮助宿主抵御病原菌、分解食物和提供营养[10]。该研究发现菌株GZ15具有良好的生长特性和产酸特性，能够在pH 2.5和0.3%胆盐浓度下保持较高活性，并且对HT-29细胞具有高的黏附性，每个细胞平均可以黏附（4.68±0.59）个菌，且显著高于副干酪乳杆菌LC-01[黏附（3.72±0.14）个菌]，说明GZ15菌株具有良好的生长特性、产酸特性、耐受性和黏附性。
乳酸菌在肉制品、乳制品、植物蛋白饮料和果蔬饮料加工中都扮演着重要角色，能够提高食品的营养价值、改善食品风味、增强食品的保健作用和延长食品的保存期[24-25]。干酪乳杆菌GZ15不仅具有良好的生长特性，并且可以在pH 2.0条件下存保持高的活力，同时具有润肠通便功能，能够应用在多种发酵食品中。由于干酪乳杆菌GZ15良好的耐酸特性，因此可以在植物基且具有一定润肠通便功能的酸性果蔬汁中发酵，如苹果汁、胡萝卜汁、猕猴桃汁等，结合乳酸菌和植物果蔬汁的特性，可以开发一款富含果蔬汁，且能够预防便秘的功能性发酵食品。
4 结论
该研究从贵州泡菜样品中分离、筛选、鉴定乳酸菌，并采用止泻剂复方地芬诺酯建立便秘模型，通过小鼠首次排黑便时间、6 h排黑便粒数和排黑便质量、小鼠墨汁推进率等指标筛选具有润肠通便功能的乳酸菌，并对优选菌株的耐受性和黏附性进行研究。研究发现，从贵州泡菜中分离鉴定出产酸能力强的革兰氏阳性乳酸菌5株，其中菌株GZ9和GZ47被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），菌株GZ15和GZ54被鉴定为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei），菌株GZ20被鉴定为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermenti）。通过对5株菌润肠通便功能筛选，发现菌株GZ15给药7 d后，便秘小鼠首次排便时间最短，6 h排便粒数、质量和小肠墨汁推进率最高。对菌株GZ15进一步研究发现，其具有优良的生长特性和产酸特性，能在高pH和胆盐浓度下保持较高活性，且黏附性高。可应用于发酵功能食品中，预防和治疗便秘。
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