我国酱类产品品种众多，如大（黄）豆酱、豆瓣酱、牛肉酱、甜面酱、芝麻酱、花生酱等，其市场需求逐年增多，行业发展趋势良好[1-2]。昭通酱为昭通本地特有的大豆酱，呈鲜红色，有浓烈的酱香味，因产于昭通而得名，其主要原料为大豆，富含多种活性物质，对人体有保健功能。相比市面上其它豆酱，昭通酱有两个比较明显的特色。昭通酱是经过两次发酵周期制成的，第一次发酵主要是黄豆在自然条件下进行发酵，以真菌发酵为主。第二次发酵是在一次发酵的基础上经过刷霉、粉碎、加料、搅拌等步骤进行发酵，以细菌发酵为主。也因此传统昭通酱加工至少半年才能制成。昭通酱属于大豆发酵类酱制品，在生产和运输过程中，易造成微生物污染，影响酱本身的口感[3]。传统大豆酱通常采用低温密封包装、干燥、气调等技术进行储藏，但存在操作麻烦、成本稍高、杀虫灭菌效果不彻底等缺点。陈书蓓[4]利用热耦合超声对黄豆酱进行灭菌处理，发现豆酱中大肠杆菌和膜醭毕赤酵母菌的致死率与灭菌的时间和温度符合动力学模型；周民生[5]研究表明，豆酱能够更好的保护真菌免受高温高压的影响，90 ℃条件下处理20 min，只能降低酱体中霉菌和膜醭毕赤酵母菌2～3个数量级，而豆酱超高压灭菌方式基本可行，且符合一定的动力学原理。加热处理能有效杀灭豆酱中部分微生物，但绝大多数分微生物甚至致病菌在加热处理后仍然处于“亚致死”或者“存活但不可培养”的状态，残留的微生物又会进一步污染样品，因此大多数加热灭菌需进行二次热处理[6]。电子束辐照灭菌其原理是将电子加速成高能电子产生电子射线，将电子射线能量转移给被辐射物，使得被辐射物中微生物体内发生电离，激发自由基等分子方面发生变化，从而达到杀菌的目的。因其杀菌效果明显，不带入新的杂质，以及“冷杀菌”的特点备受关注[7]。BHAT R等[8]探究了不同剂量电子束辐照对莲子的成分以及蛋白质功能特性的影响，研究证明电子束辐照能够延长产品的货架期；KIM H J等[9]采用10 kGy及以下电子束剂量处理牛肉干，其杀菌有明显的效果，而且并不影响其感官品质；目前我国电子束辅助主要用于粮食、果蔬、畜禽肉类以及一些水产品类，而在酱类调味品中应用却少见。昭通酱在当地的生产加工主要按照传统的工艺进行作坊式生产，并没有统一的标准可参考，且由于发酵过程全在露天自然环境下进行且周期长，无论在发酵还是储藏过程中容易生霉，热杀菌又易导致风味和色泽发生改变，因此很难实现工业化、产业化的发展。因此昭通酱长远的发展对策就是先实现包装-灭菌等工序。考虑到昭通酱自身含有丰富的营养和独特的风味成分，如果对其进行传统的加热杀菌，势必会使得产品营养流失，甚至会产生其他不好的风味。因此，本实验以昭通酱的感官评价、部分营养及理化成分为评价指标，研究电子束辐照剂量对其品质的影响，旨在为昭通酱在产业化发展提供相关的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
昭通酱：本实验室自制（原料产地昭通，无任何添加剂）；平板计数琼脂培养基、孟加拉红琼脂培养基、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤、煌绿乳糖胆盐肉汤：北京路桥技术股份有限公司；二甲基亚砜、乙腈、甲醇（均为色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司；6种大豆异黄酮标准品（大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素）（纯度均＞99%）：天康生物科技有限公司；磷酸、氢氧化钠、五水硫酸铜、亚甲基蓝、邻苯二甲酸氢钾、甲基红、盐酸、溴甲酚绿、乙酸锌、冰乙酸、酒石酸钾钠、葡萄糖、亚铁氰化钾、乙醇、氢氧化钾、硼酸、酚酞、硫代硫酸钠、石油醚、三氯甲烷、碘化钾、无水硫酸钠、可溶性淀粉、重铬酸钾、硫酸钾、硫酸、碱性蓝6B（均为分析纯）：天津市津北精细化工有限公司。
1.2 仪器与设备
Agilent 1260高效液相色谱仪（含G1314 B-二极管阵列检测器（diode-array detector，DAD）、G1311 A 四元泵、G1316 A柱温箱、G1329 A自动进样器）：美国安捷伦公司；AUW-220 D 电子分析天平：日本岛津公司；GW1030型超声清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；BDW 1-202-1ASB/1A恒温干燥箱：北京中西华大科技有限公司；HH-1恒温水浴锅：北京同德创业科技有限公司；TY15/ZX 10003分析天平：北京海富达科技有限公司；NKB 3300自动凯氏定氮仪：上海祎鸿分析仪器有限公司。
1.3 实验方法
1.3.1 样品处理
实验室自制昭通酱用聚乙烯自封袋分装（每袋500 g，摊平尺寸12 cm×10 cm×3 cm左右），进行辐照。昭通酱的辐照处理在湖南湘华大生物科技有限公司进行，辐照剂量设置为0、2 kGy、4 kGy、6 kGy、8 kGy、10 kGy、12 kGy，实测剂量分别为0.00、2.10 kGy、3.68 kGy、5.80 kGy、8.15 kGy、9.80 kGy、12.48 kGy，以上每个剂量设6个平行，每包样品分别在上下两面的中心和对角处贴上剂量计（片），实测剂量为各处平均剂量，不均匀度为单个样品中最高剂量与最低剂量值得比值，本实验不均匀度控制在1.5以内，辐照后的样品均贮藏于4 ℃冰箱中待测。
辐照处理：依托湖南湘华华大生物科技有限公司，采用威视IS1020电子加速器，辐射源：反波型行波电子直流加速器，能量（10±0.5）MeV，额定工作束流功率（20±2）kW，扫描频率5～20 Hz，连续可调。
1.3.2 感官评价标准
表1 昭通酱的感官评价标准
Table 1 Sensory evaluation standards of Zhaotong soybean paste
注：“--”表示严重异常；“-”表示异常；“+”表示正常；综合评价：综合上述5个指标的结果进行评定，下同。
1.3.3 微生物指标测定
菌落总数：参照GB 4789.2—2016《食品微生物学检验菌落总数测定》执行[10]；霉菌：参照GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》执行[11]；大肠菌群：参照GB 4789.3—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》执行[12]。
1.3.4 部分理化指标测定
蛋白质测定：参照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》执行[13]；脂肪测定：参照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》执行[14]；还原糖测定：参照GB 5009.7—2016《食品中还原糖的测定》执行[15]；过氧化值测定：参照GB 5009.227—2016《食品中过氧化值的测定》执行[16]；酸价测定：参照GB 5009.229—2016《食品中酸价的测定》执行[17]；总酸的测定：参照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》执行[18]。
1.3.5 大豆异黄酮测定方法
参照GB/T 23788—2009《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》[19]进行测定并略作改进。
（1）分别取6种大豆异黄酮标准贮备溶液4 mg置于10mL容量瓶中，加入少量体积分数50%的二甲基亚砜，超声波处理30 min待其完全溶解，再用体积分数50%的二甲基亚砜定容。6种大豆异黄酮溶液的质量浓度均为400 mg/L。配制质量浓度8.0 mg/L、16.0 mg/L、24.0 mg/L、32.0 mg/L、40.0 mg/L的混合标准溶液。
（2）称取样品0.05～0.5 g（精确至0.1 mg），用体积分数80%的甲醇溶液溶解并转移至50 mL容量瓶中，加入体积分数80%的甲醇溶液至接近刻度。把样品溶液用超声波振荡器600 W振荡20 min，用体积分数80%的甲醇溶液定容，摇匀。取样品溶液置于离心管中，5 000 r/min离心15 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤，收集滤液备用。
（3）液相色谱条件
C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：乙腈，流动相B：磷酸水溶液（pH=3.0），流速1.0 mL/min，波长260 nm，柱温30 ℃。
洗脱梯度：0 min 12%乙腈，10 min 18%乙腈，23 min 24%乙腈，30～50 min 30%乙腈，55 min 80%乙腈，56～60 min 12%乙腈。
1.3.6 氨基酸测定方法
结合GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[20]和武俊瑞等[21]的方法略作改进，增加了半胱氨酸的检测，氨基酸的测定依托湖南省农科院湖南省食品测试中心。
1.3.7 数据处理
每个实验需连续做3次，实验数据处理分析时取3次实验平均值进行分析，采用Excel 2016软件、Origin 9.0、IBM SPSS statistics 26等软件进行数据处理。
2 结果与分析
2.1 电子束辐照剂量对昭通酱感官评价的影响
由表2可知，随着辐照剂量的增加，昭通酱口感、气味和滋味对辐照表现出一定的敏感性，当辐照剂量为5.80 kGy时，气味就开始发生一定的变化，但不影响滋味和口感，当辐照剂量增加至8.15 kGy时，滋味和口感也开始发生改变，明显能感受出一定的异味，当辐照剂量增加至12.48 kGy时，色泽开始出现异常，颜色开始变暗，说明较高剂量会影响昭通的品质。因此最佳辐照剂量不应超过3.68 kGy。
表2 电子束辐照剂量对昭通酱感官评价的影响
Table 2 Effect of electron beam irradiation dose on sensory evaluation of Zhaotong soybean paste
2.2 电子束辐照剂量对昭通酱微生物的影响
由表3可知，电子束辐照对昭通酱中微生物的数量影响显著（P＜0.05），随着辐照剂量的增加，昭通酱中菌落总数、真菌含量和大肠杆菌数量下降明显，当辐照剂量达到2.01kGy时，大肠杆菌数量达到最低检出值以下；当剂量达到3.68 kGy时真菌数量达到最低检出值以下；当辐照剂量达到8.15 kGy时，菌落总数降至最低检出值以下，说明电子束辐照能有效抑制昭通酱中微生物数量，使其达到微生物商检标准，延长保鲜期。
表3 电子束辐照剂量对昭通酱微生物的影响
Table 3 Effect of electron beam irradiation dose on microorganism of Zhaotong soybean paste
注：同列字母不同表示差异性显著（P＜0.05）。下同。
电子束辐照剂量与菌落总数、真菌数量和大肠杆菌数量均呈负相关，根据辐照剂量与菌落总数对数值的线性变化，可得出其回归方程为y=-0.884 0x+7.052 8（R2=0.999 7），由此可计算出D10值（指杀灭90%微生物所需的辐射剂量）为1.16 kGy。当辐照剂量为3.68 kGy时，昭通酱中菌落总数为未辐照时的0.07%，同时真菌数和大肠杆菌数已低于最低检测限，达到卫生标准。电子束辐照是用电子加速器产生的高能电子束照射可使一些物质产生物理、化学和生物学效应[22]。食品中的含水量也会影响辐照灭菌的效果，因为在干燥状态下照射，生成的游离基因失去了水的连续相而变得不能移动，游离基等的辐射间接作用就会随之降低，因而辐射作用显著减弱[23-24]。而昭通酱作为一种特色酱类，其含水量比较高，因此在辐照过程中更容易发生电离，使微生物失活或者死亡。因此说明昭通酱的辐照剂量不宜超过3.68 kGy。
2.3 电子束辐照剂量对昭通酱部分理化指标的影响
电子束辐照剂量对昭通酱部分理化指标的影响见表4。由表4可知，随着辐照剂量的增加，昭通酱的还原糖和蛋白质含量呈略微下降的趋势；脂肪含量先略微下降，当辐照剂量超过3.68 kGy时下降明显，后随辐照剂量增加下降趋于平缓。随着辐照剂量的增加，昭通酱的总酸含量几乎不变；酸价值略微上升；而过氧化值随着辐照剂量的增加而上升，当辐照剂量超过9.80 kGy时，过氧化值上升明显。因此根据辐照灭菌不应改变营养成分及理化指标的原则，说明昭通酱的辐照剂量不宜超过3.68 kGy。
表4 电子束辐照剂量对昭通酱营养及理化指标的影响
Table 4 Effect of electron beam irradiation dose on nutrition and physical and chemical indexes of Zhaotong soybean paste
2.4 电子束辐照剂量对昭通酱大豆异黄酮的影响
由表5可知，在辐照剂量为0～2.01 kGy时，染料木苷、大豆素、染料木素、大豆黄素和大豆黄苷5种大豆异黄酮含量呈略微上升的趋势，当辐照剂量为2.01～12.48 kGy时，含量随着辐照剂量的增加逐渐减少，而且剂量越大下降速度越快；大豆苷的含量随辐照剂量的增加始终呈下降的趋势。这6种大豆异黄酮均含有羟基、碳氧双键、碳氧单键和碳碳双键，可能在辐照过程中发生脱氯化氢反应与降解反应，产生共轭双键，含多官能团不饱和的物质会在辐照下产生交联反应[25-27]。根据前人研究可知，多官能团不饱和单体在辐照引发下优先产生自由基并自聚[28-29]，这很可能是大豆异黄酮含量随着辐照剂量的增加而下降的主要原因。从变化趋势可知当辐照剂量达到5.80 kGy时，6种大豆异黄酮含量下降趋势明显，且下降幅度开始增大，因此从大豆异黄酮的指标分析，昭通酱电子束辐照剂量不宜超过3.68 kGy。
表5 电子束辐照剂量对昭通酱中6种大豆异黄酮含量的影响
Table 5 Effect of electron beam irradiation dose on 6 soybean isoflavones content of Zhaotong soybean paste
2.5 电子束辐照剂量对昭通酱氨基酸的影响
电子束辐照剂量对昭通酱氨基酸含量的影响见表6。由表6可知，昭通酱中共检测出17种氨基酸，主要由赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丝氨酸和谷氨酸组成。随着辐照剂量的增加，其中赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、组氨酸和脯氨酸呈微上升趋势，异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸和丝氨酸呈下降趋势。当辐照剂量达到5.80 kGy时，必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、总氨基酸（total amino acid，TAA）、SAA和呈味氨基酸（delicious amino acids，DAA）的变化明显，结合表4中蛋白质含量随辐照剂量的增加而微微下降，有可能因为随着辐照剂量的增加，促进了蛋白质的水解，从而导致氨基酸含量的增加，从DAA/TAA值看，低剂量辐照对呈味氨基酸的变化影响较小，当辐照剂量超过9.80 kGy时，DAA/TAA值下降明显，说明此时昭通酱中风味物质发生了明显的改变。电子束灭菌对昭通酱中氨基酸的形成有一定的促进作用，但光靠考察氨基酸含量的变化不能直接表明辐照对昭通酱的风味和营养有一定积极作用，因此从保证样品原有的风味和营养特征的前提下，昭通酱的电子束辐照剂量不宜超过3.68 kGy。顾可飞等[30]研究发现，对农产品中，蛋氨酸及蛋白质特定的二级结构对电子束辐照相对敏感；梅卡琳等[31]的研究也表明，电子束辐照对蟹肉的氨基酸组成及其营养价值没有明显的不利影响，与本研究结果基本类似。
表6 不同剂量电子束辐照处理昭通酱中的氨基酸组成
Table 6 Amino acid composition of Zhaotong soybean paste treated by different doses of electron beam irradiation
注：“*”代表条件必需氨基酸，“#”代表呈味氨基酸，EAA表示必需氨基酸，TAA表示总氨基酸，NEAA表示非必需氨基酸，DAA代表呈味氨基酸，SAA代表条件必需氨基酸。
3 结论
本实验以昭通酱的感官评价、部分营养及理化成分为考查指标，研究电子束辐照剂量对其品质的影响。结果表明，当辐照剂量为2.01 kGy时，昭通酱中大肠杆菌含量降到最低检测水以下，此时脂肪的含量开始呈下降趋势，过氧化值开始上升，大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素和染料木素5种大豆异黄酮含量呈微微上升的趋势，大豆苷呈下降趋势；当辐照剂量为3.68 kGy 时，昭通酱中真菌数量已经下降到最低检测水平以下，脂肪的含量继续呈下降趋势，下降速度减缓，当辐照剂量达到5.80 kGy时，昭通酱气味开始有所改变，而且6种大豆异黄酮含量下降变的明显；当辐照剂量为8.15 kGy 时，口感和滋味开始发生改变，菌落总数含量已经下降到最低检测水平以下，此时氨基酸含量变化明显，过氧化值和酸价值变化变大；当辐照剂量为9.80 kGy时，口感、气味和滋味变化严重，产生了一些不愉快的气味和滋味，脂肪含量继续小幅度下降，氨基酸含量继续变化；当辐照剂量为12.48 kGy时，昭通酱色泽开始变暗，过氧化值上升速度和幅度加快，大豆异黄酮下降速度变快，氨基酸含量开始变少，特别是呈味氨基酸下降比较明显。因此根据各指标变化情况，表明3.68 kGy电子束辐照剂量既能杀死昭通酱中大多数微生物，使得菌落总数为未辐照时的0.07%，延长货架期，又能最大限度保持昭通酱中原有的理化指标及风味成分，是有效的昭通酱辐照灭菌剂量。
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