果醋是以水果及其下脚料为原料，通过接种酵母菌和醋酸菌进行两阶段发酵加工而成的新型酸性饮品或调味品[1-2]，不仅含有食醋的营养保健功能，同时保留了水果原有的营养成分及其特有的芳香物质[3]。苹果醋是将新鲜苹果破碎过滤得到苹果汁，经酒精和醋酸发酵而制成的，具有抵抗病菌、降血脂、降血压、抗衰老、预防骨质疏松等作用[4-6]。
鉴于液态单菌发酵果醋风味欠佳的局限，混菌协同发酵有利于增强果醋营养风味[7-9]已成为该领域研究者的共识。近期的研究显示，乳酸菌对果醋风味改善有重要作用，酿酒酵母和植物乳杆菌混菌发酵感官特性明显优于单菌发酵[10]。陈思奇等[11]采用嗜酸乳杆菌、戊糖乳杆菌和生香酵母混菌发酵刺梨果渣，其刺激性涩味明显减弱，风味更加协调柔和。CHEN Y等[12]通过酿酒酵母和植物乳杆菌混合发酵生产柑橘醋风味更佳，具有高抗氧化性。有研究发现巴氏醋杆菌和植物乳杆菌混菌发酵有效促进了香醋关键成分（乙偶姻）的增加[13]。CHAI L J等[14]通过调节干酪乳杆菌和巴氏醋杆菌的微生物代谢，促使了谷物醋在发酵过程中乙偶姻的积累。虽然混合培养在发酵过程中相对于纯培养的优势得到了许多研究者的肯定，但在醋酸发酵阶段巴氏醋杆菌和植物乳杆菌协同发酵苹果醋理化和风味的影响鲜见报道。
本试验以苹果为原材料，在醋酸发酵阶段同时接种巴氏醋杆菌和植物乳杆菌进行双菌协同发酵，采用单因素和响应面试验优化双菌协同发酵苹果醋工艺条件，并与巴氏醋杆菌发酵苹果醋对比分析主要理化指标及挥发性风味物质差异，以期为增强果醋营养风味及工业化生产提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苹果（山东栖霞产红富士）：市售；果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）BJST-S、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ZM803：本实验室保藏；果胶酶（500 U/mg）：上海源叶生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。
巴氏醋杆菌种子培养基：葡萄糖10.0 g/L、酵母粉10.0 g/L，121 ℃高压灭菌20 min，接种前加入2%（V/V）无水乙醇。
植物乳杆菌种子培养基：酪蛋白酶消化物10.0 g/L、牛肉膏10.0 g/L、酵母膏4.0 g/L、柠檬酸三铵2.0 g/L、乙酸钠5.0 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、磷酸氢二钾2.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、吐温80 1.0 g/L。121 ℃高压灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
7890A型气相色谱（gas chromatography，GC）仪：安捷伦科技有限公司；GC-MS-QP2010型气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪：岛津实验器材有限公司；S-433D型氨基酸分析仪：德国SYKAM公司；HYL-C2型组合式摇床：太仓市强文实验设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 苹果醋的加工工艺流程及操作要点
苹果→清洗→切块→打浆→酶解→过滤→苹果汁→调整成分→杀菌→酒精发酵（酵母菌）→杀菌→醋酸发酵（巴氏醋杆菌和植物乳杆菌）→澄清→杀菌→成品
苹果汁的制备：新鲜无腐败的苹果，洗净后切块，用榨汁机破碎打浆。在果浆中加入0.1%果胶酶，于45 ℃水浴酶解2 h后，85 ℃灭酶10 min，先四层纱布再八层纱布过滤得到澄清的苹果汁。
酒精发酵：在37 ℃的5 g/100 mL白砂糖溶液中加入0.6%的果酒酵母，待表面起泡后，即为酵母活化成功，冷却至室温（25 ℃）备用。按照10%的添加量接种果酒酵母，于26 ℃条件下静置发酵7 d。
醋酸发酵：巴氏醋杆菌、植物乳杆菌分别接种于种子液培养基中，于30 ℃、160 r/min活化12 h，备用。酒精发酵结束后，按照初始酒精度9%vol、发酵温度30 ℃、巴氏醋杆菌接种量10%（V/V）、植物乳杆菌接种量10%（V/V）、摇床转速160 r/min进行醋酸发酵12 d。
澄清与杀菌：醋酸发酵结束后，经0.45 μm水相滤膜抽滤得到澄清果醋发酵液，并进行巴氏杀菌（70 ℃、20 min）。
1.3.2 醋酸发酵条件优化
单因素优化试验：以总酸含量为评价指标，分别考察初始酒精度（6%vol、7%vol、8%vol、9%vol、10%vol、11%vol）、发酵温度（28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃、37 ℃）、植物乳杆菌接种量（0、5%、10%、15%（V/V））、摇床转速（120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min）对苹果醋醋酸发酵的影响。
在单因素试验的基础上，固定巴氏醋杆菌接种量为10%，以初始酒精度（A）、发酵温度（B）、植物乳杆菌接种量（C）、摇床转速（D）4个因素为优化条件，以总酸为响应值，利用Design-Expert 8.0.6软件设计4因素3水平Box-Behnken响应面试验，确定醋酸发酵的最佳工艺条件，试验因素与水平表见表1。
表1 苹果醋醋酸发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface tests for acetic acid fermentation conditions optimization of apple vinegar
1.3.3 测定方法
总酸：酸碱滴定法；蛋白质：考马斯亮蓝法[15]；多酚：Folin-Ciocalteu法[16-17]；总黄酮：亚硝酸钠-硝酸铝法[16-17]；维生素C（vitamin C，VC）：分光光度法[18]；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基、羟自由基清除率：参照参考文献[19-21]的方法测定；游离氨基酸：参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》[22]的方法测定。
挥发性香气成分：参照参考文献[23-25]的方法测定。
1.3.4 数据处理
每组试验重复3次，试验结果以“平均值±标准差”表示，采用Origin8.0、Design-Expert 8.0.6、TBtools分析数据及作图。
2 结果与分析
2.1 苹果醋醋酸发酵条件优化结果
2.1.1 苹果醋醋酸发酵条件优化单因素试验结果
酒精是醋酸发酵的主要底物，醋酸菌通过代谢酶系作用底物发酵产酸[26]，过低的酒精浓度无法持续为醋酸菌产酸提供发酵原料，较高浓度酒精会抑制醋酸菌的生长繁殖，产酸速率也会受到抑制[27]，由图1（a）可知，当初始酒精度为9%vol时，总酸最高为51.43 g/L，因此选择初始酒精度为9%vol进行后续试验。由图1（b）可知，不同植物乳杆菌接种量对苹果醋发酵产酸也有影响，当植物乳杆菌接种量为10%时，总酸可达51.85 g/L，与单巴氏醋杆菌发酵苹果醋总酸含量（52.97 g/L）无显著性差异（P＞0.05）。因此选择植物乳杆菌接种量为10%进行后续试验。温度也是影响醋酸发酵的重要因素，当温度较低时，醋酸菌的生长代谢能力减弱，发酵周期较长，产酸速率低，温度过高会加快醋酸菌菌体老化，菌体内酶系活性降低[9]，由图1（c）可知，在发酵温度30 ℃时，醋酸菌的产酸能力最强，总酸最高为51.45 g/L，因此选择发酵温度为30 ℃进行后续试验。醋酸菌是好氧细菌，发酵液中的溶氧量与醋酸菌的生长代谢密切相关，摇床转速过高，也会加快发酵液中酸类物质的挥发，同时过高的溶解氧会加快醋酸菌的衰亡，使得发酵液总酸含量降低，由图1（d）可知，摇床转速180 r/min时，总酸最高为50.91 g/L，因此选择摇床转速为180 r/min进行后续试验。
图1 初始酒精度（a），植物乳杆菌接种量（b），发酵温度（c）和摇床转速（d）对苹果醋酸度的影响
Fig.1 Effects of initial alcohol content (a), Lactobacillus plantarum inoculum (b),fermentation temperature (c),and rotational speed (d) on acidity of apple vinegar
2.1.2 响应面优化双菌协同发酵条件结果分析
根据单因素试验结果，进行4因素3水平的响应面优化试验，以苹果醋的总酸为响应指标，试验设计与结果见表2。使用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行回归分析，回归模型的方差分析见表3。
表2 苹果醋发酵条件优化响应面试验设计与结果
Table 2 Design and results of response surface test for fermentation conditions optimization of apple vinegar
续表
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）；“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）。
采用Design-Expert 8.0对表2数据进行回归拟合，得到总酸含量的二次多项回归拟合方程为：
由表3可知，模型P＜0.001，表明差异极显著；失拟项P=0.109 4＞0.05，差异不显著；决定系数R2=0.969 9，校正决定系数
因而该模型拟合程度较好，试验误差较小，且该回归模型一次项A、B，交互项AB，二次项A2、B2、C2、D2对结果影响极显著（P＜0.01）；一次项D，交互项AC、AD对结果影响显著（P＜0.05）。各因素之间相互作用响应面图，如图2所示，响应值随着单因素的增大，呈先上升再下降的趋势，结合表3可知，各因素对结果的影响顺序依次为初始酒精度＞发酵温度＞转速＞植物乳杆菌接种量。
图2 各因素交互作用对苹果醋总酸影响的响应曲面及等高线
Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of various factors on total acid of apple vinegar
本试验优化得出较优工艺条件为初始酒精度9.36%vol，发酵温度30.52 ℃，植物乳杆菌接种量9.22%，摇床转速174.76 r/min，苹果醋总酸预测值为58.54 g/L。结合实际试验条件，以初始酒精度9%vol、发酵温度31 ℃、植物乳杆菌接种量10%及摇床转速170 r/min进行验证试验，得到的苹果醋总酸实际值为56.13 g/L，与预测值相对误差为0.04%，误差率小。
2.2 苹果醋的理化指标及抗氧化性研究结果
由图3可知，两种苹果醋蛋白质含量差异不显著（P＞0.05），双菌协同发酵苹果醋（DFAV）的总黄酮质量浓度（0.45 mg/mL）显著高于单菌发酵苹果醋（SFAV）中总黄酮质量浓度（0.37 mg/mL）（P＜0.05）；DFAV的总多酚质量浓度高于SFAV，分别为0.30 mg/mL和0.32 mg/mL，这是由于植物乳杆菌能从相应的酚酸中产生更多的挥发性酚类物质[28]；此外，DFAV的VC质量浓度也显著高于SFAV，分别为0.25 mg/mL、0.22 mg/mL。DPPH、ABTS、羟自由基清除率通常用来评价果醋的抗氧化活性[29]。果醋发酵后，SFAV和DFAV的DPPH自由基清除率分别为91.88%和96.29%，有显著性差异（P＜0.05）；DFAV的ABTS自由基清除率为56.52%，显著高于SFAV（P＜0.05），有研究表明利用植物乳杆菌发酵果汁，其自由基清除率效果增加[30]，这与本结果一致；SFAV和DFAV羟自由基清除率分别为58.30%、55.87%。由此可见双菌协同发酵苹果醋可有效提高果醋营养及抗氧化性。
图3 苹果醋的理化指标及自由基清除率分析
Fig.3 Analysis of physicochemical indexes and free radical scavenging rate of apple vinegar
SFAV-单菌发酵苹果醋，DFAV-双菌协同发酵苹果醋；采用邓肯检验法，同一指标中的不同字母表示有显著性差异（P＜0.05），下同。
2.3 苹果醋的游离氨基酸分析
游离氨基酸被认为是醋独特风味的重要贡献者[12]。由表4可知，两种果醋中均检测到了16种氨基酸，其中包含除苏氨酸外人体必需的7种氨基酸[31]，其质量浓度均显著高于单菌发酵果醋，这是由于植物乳杆菌的生长代谢产生更多的游离氨基酸，丰富果醋的营养含量。此外，DFAV中非必需氨基酸质量浓度也显著高于SFAV，特别是呈甜味的氨基酸Gly、Ala、Ser含量分别是SFAV的8.17、3.62、2.49倍，且呈鲜味的氨基酸Glu、Asp质量浓度也显著高于SFAV（P＜0.05），因此双菌协同发酵果醋可以显著改善果醋的风味与口感。
表4 双菌协同发酵苹果醋对游离氨基酸的影响
Table 4 Effects of dual-species cooperative fermentation on free amino acids of apple vinegar
2.4 苹果醋挥发性风味物质分析
单菌和双菌协同发酵苹果醋的挥发性风味物质聚类分析如图4所示，在SFAV和DFAV中分别发现25种和36种挥发性化合物，主要有酸类、酯类、醛类、醇类、酮类。其中酸类物质是醋风味的主要贡献者，醋酸在SFAV和DFAV中质量浓度最高；两种果醋醇类物质差异较小，其中DFAV中的芳樟醇质量浓度显著高于SFAV。在双菌协同发酵过程中，由于植物乳杆菌的作用，在DFAV中检测到乳酸乙酯，且DFAV中乙偶姻（192.35 μg/L）的质量浓度是SFAV（139.07 μg/L）的1.38倍，这与任聪等[13]研究发现巴氏醋杆菌和植物乳杆菌混菌发酵有效的促进了香醋关键成分（乙偶姻）的增加结果一致。SUN S Y等[32]研究发现在发酵过程中添加植物乳杆菌进行发酵可增加酯类化合物的产生，DFAV中酯类化合物的种类和含量均大于SFAV。因此双菌协同发酵更有利于果醋风味物质的生成。
图4 双菌协同发酵苹果醋挥发性化合物聚类热图
Fig.4 Clustering heat map of volatile compounds of apple vinegar by dual-species cooperative fermentation
“**”表示差异极显著（P＜0.01）；“*”表示差异显著（P＜0.05）。
3 结论
本研究在醋酸发酵阶段同时接种巴氏醋杆菌和植物乳杆菌进行协同发酵制备苹果醋。在对发酵工艺进行优化的基础上，与单菌发酵果醋进行了理化性质、抗氧化活性、氨基酸及风味物质对比分析。在双菌协同发酵苹果醋的较优工艺条件（酒精度9%vol，发酵温度31 ℃，植物乳杆菌接种量10%，转速170 r/min）下，苹果醋的总酸含量达到56.13 g/L。双菌协同发酵苹果醋中总多酚、总黄酮、VC、游离氨基酸质量浓度显著高于单菌发酵苹果醋（P＜0.05），且具有较好的抗氧化性，表现出更好的风味。由此可见，利用巴氏醋杆菌与植物乳杆菌进行双菌协同醋酸发酵是改善果醋风味的一个有效途径，本研究结果可为增强苹果醋风味及工业化生产提供一定的理论指导。
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