枸杞是一种适应我国西北干旱地区的多年生落叶灌木，为茄科（Solanaceae）枸杞属（Lycium）植物[1]，其果实（子）、叶和根茎在食品和药品行业具有较大的研究开发和综合利用价值[2-3]。我国宁夏枸杞是唯一载入《中国药典》的品种，宁夏中宁枸杞也是我国地理标志产品。除了宁夏，我国青海、新疆和甘肃等地也种植枸杞，但在这些地区常见的品种为中华枸杞及其变种枸杞[1，4]。
枸杞因其丰富的化学成分和药用特性，在两千多年的历史中一直是中药的重要组成部分[5]。它具有滋肾补髓、养肝明目和祛风等保健作用，多年来一直是营养食品和民族医药领域的研究热点之一[2]。研究发现，枸杞不仅含有丰富的类胡萝素[6-7]、维生素[2，4-5]、氨基酸[3-5]和无机元素等营养成分[4，8]，也含有色素[1，9]、多糖[3-5，10-11]、黄酮类[5，9，12-13]、甜菜碱[3，4]和有机酸[14-16]等生物活性成分[16-17]。现代医学表明，枸杞具有多种药理作用，如抗衰老[3，9，14，18-19]、保护细胞结构和视神经[3，20]、增强免疫力[3，10-11，21]、抗癌[3]、调节脂质代谢和血糖的作用[3，6，18]以及抗氧化等功能特性[2-3，10-12，14，18]。由于我国西北主要枸杞产区的生态环境和气候条件差异很大，海拔、日照时数、昼夜温差以及土壤养分等因素都会影响枸杞果实的发育和化学成分，使得不同地理区域和不同品种的枸杞在大小、颜色、口感风味、功能成分含量以及营养品质等方面均存在显著差异[4，8，15]，而营养功能成分是评价枸杞果实品质的一个重要指标。
近年来对于枸杞内在化学成分和营养价值有多方面的研究报道，但是，具体品质评价指标往往比较复杂[2，4，8，15]。WANG Y B等[4]对7个产区的42种枸杞果实的分析表明，枸杞多糖、甜菜碱和铁等营养成分含量之间存在高度相关性，并以甜菜碱和糖的含量水平为基础建立了枸杞质量评价标准。BERTOLDI D等[8]通过对样品中δ34S、Y、U、Cu、Rb、玉米黄质棕榈酸盐和总类胡萝卜素含量的判别分析，对产地进行了分类。述小英等[22]测定了22种枸杞样品中多糖、甜菜碱和类胡萝卜素等功能成分，并运用主成分分析和聚类分析进行综合评价。KAFKALETOU M等[23]的研究表明，中华枸杞中营养成分含量均较高，苦味和涩味也较强烈。殷涛等[24]以枸杞子的形状和浸出物、多糖、甜菜碱、重金属及有害元素以及二氧化硫残留的含量指标为基础对我国西北四大产区枸杞子进行了综合性的质量评价。优质的枸杞果实要求优良的外观形态、较高的营养价值和良好的口感，因此，系统地揭示枸杞中的营养成分组成，通过比较它们营养价值的差异性，探讨不同品种果实品质性状差异的影响因素，筛选关键评价指标，这对研究植物栽培和枸杞的适销性以及筛选优异枸杞品种具有实际意义。众所周知，营养物质氨基酸、维生素、矿物质等对预防氧化应激、调节免疫反应、维持正常的生理生化和体内平衡机制具有重要作用，而目前还鲜见将枸杞中基础营养成分如氨基酸、维生素和微量元素等与果实质量密切相关的组分都作为评价因子的研究，与品种性质关联的品质评价指标也尚不明确，因而在探讨果实品质的影响研究及评价时并不全面。
本研究对我国地理和气候相近的青海都兰和格尔木地区种植的红枸杞（Lycium barbarum L.）、黄枸杞（Lycium chinense Miller）和黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）中的基础营养物质蛋白质、脂肪、膳食纤维以及氨基酸、维生素、胡萝卜素和微量元素等营养成分进行了比较分析，探讨了不同枸杞品种特性对果实营养品质主要差异指标的影响，并基于枸杞营养成分的检测结果，运用层次聚类分析（hi erarchical cluster analysis，HCA）法建立枸杞质量评价方法，旨在为不同品种枸杞品质综合评价和质控提供科学依据，也可以为优质枸杞种质资源的深入开发利用提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
红枸杞1和2均为宁杞1号（编号为S1、S2），来自青海都兰诺木洪，采收时间分别是9月和8月；黄枸杞1和2（编号为S3、S4），来自青海都兰和格尔木，采收时间分别是9月和8月；黑枸杞1和2（编号为S5、S6）来自青海都兰和格尔木，采收时间分别是9月和8月。上述枸杞均为鲜果采摘后自然晾干的产品。
Wako混合氨基酸标准溶液（H型）：日本和光纯药工业株式会社；钠、钾、镁、钙、铁、锌、铜和锰混合标准储备液（质量浓度1 000 mg/L）：坛墨质检标准物质中心；L-抗坏血酸标准品（纯度99%）：美国Supelco公司；α-维生素E、β-维生素E、γ-维生素E、δ-维生素E和β-胡萝卜素标准品（纯度均为98%）：中国国家标准物质中心；体积分数为65%硝酸（分析纯）：德国默克公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国Fisher Chemical公司；所用其他试剂为国产分析纯。高纯水由Milli-Q Advantage超纯水系统提供。
1.2 仪器与设备
FOSS KjeltecTM 2300型全自动凯氏定氮仪：瑞典福斯公司；Hitachi 8900氨基酸自动分析仪、Hitachi L-2000高压液相色谱仪：日本日立公司；Perkin Elmer Avio-500电感耦合等离子体发射光谱（inductively coupled plasma-optical emission spectrometry，ICP-OES）仪：美国珀金埃尔默公司；Mars classic 6全自动高通量微波消解萃取系统：美国PyNN公司；Shimadzu RF-6000荧光分光光度计：日本岛津公司；SP-2000UV单光束紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；EYELA TVE-1100型平行蒸发仪、EYELA MMV-1000W振荡器、EYELA N-1200旋转蒸发器、EYELA A-1000S循环水真空泵、EYELA CCA-1111冷凝压缩机、EYELA MGS-22型氮吹仪：日本东京理化器械株式会社；98-Ⅱ-B磁力搅拌电热套：天津市泰斯特仪器有限公司；EHD-40型可调式电热炉：北京东航科仪仪器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 理化性质分析
依据国标GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》、GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》、GB 5009.88—2014《食品中膳食纤维的测定》、GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》分别测定枸杞水分、蛋白质、脂肪、膳食纤维和灰分含量，每个样品平行测定3次，结果以干物质计；碳水化合物和能量测定依据国标GB 28050—2011《预包装食品营养标签通则》。
1.3.2 无机元素的含量测定
无机元素的含量：依据国标GB 5009.268—2016《食品中多元素的测定》中的第二法电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）测定钠、钾、镁、钙、铁、锌、铜和锰的含量。每个样品平行测定3次，结果以干物质计。
1.3.3 氨基酸的含量测定
准确称取粉碎均匀的枸杞样品（0.2±0.000 1）g，依据国标GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》的规定进行样品处理后，采用氨基酸分析仪测定其氨基酸含量。每个样品平行测定3次，结果以干物质计。
1.3.4 维生素C、维生素E和β-胡萝卜素的含量测定
维生素C、维生素E和β-胡萝卜素的含量分别依据国标GB 5009.86—2016《食品中抗坏血酸的测定》中的第二法荧光法、GB 5009.82—2016《食品中维生素A、D、E的测定》中的第一法反相高效液相色谱法和GB 5009.83—2016《食品中胡萝卜素的测定》进行测定。每个样品平行测定3次，结果以干物质计。
1.3.5 数据处理
采用Microsoft Office Excel 2007进行数据处理，数据以“平均值±标准差”表示；采用SPSS19.0进行数据差异显著性分析（方差分析采用Duncan法）；采用R语言完成层次聚类热图分析。
2 结果与分析
2.1 红枸杞、黄枸杞和黑枸杞理化性质分析
蛋白质是构成食物营养成分的重要部分，是评价食物营养价值非常重要的指标之一[25]。由图1可知，黑枸杞的蛋白质含量丰富（13.6 g/100 g），高于黄枸杞（10.1 g/100 g）和红枸杞（8.98 g/100 g）的蛋白质含量。样品脂肪含量的高低依次为：S6（5.0 g/100 g）＞S4（4.2 g/100 g）＞S3（1.2 g/100 g）＞S1（1.0 g/100 g），最少的是S5，仅为0.7 g/100 g，说明黑枸杞的脂肪含量较低，是较红枸杞和黄枸杞这两种枸杞更好的低脂肪的食物。由图1可知，在3种枸杞产品中，黑枸杞和黄枸杞的灰分含量分别高达8.5 g/100 g和5.8 g/100 g，明显高于红枸杞的灰分含量（3.1 g/100 g），表明黑枸杞中的无机盐含量最丰富。红枸杞、黄枸杞和黑枸杞中碳水化合物的含量和能量高低为红枸杞＞黄枸杞＞黑枸杞。黑枸杞中碳水化合物含量（48.7 g/100 g）和能量（1 215 kJ/100 g）最低，说明其可以被人体消化吸收利用的各种糖类的含量低，相对于其他两种枸杞，它更适用于当前低糖饮食需求。黑枸杞的总膳食纤维含量也比红枸杞和黄枸杞高得多，而膳食纤维对人体健康有益，可以预防如糖尿病等慢性疾病的发生。
图1 3种枸杞样品种常规营养成分含量测定结果
Fig.1 Determination results of general nutritional components contents in 3 kinds of goji berries samples
因此，基于基本营养成分的对比结果表明，黑枸杞可呈现高蛋白、低脂肪和低糖的特点，红枸杞则具有高碳水化合物和高能量的特点。
2.2 枸杞中无机元素的含量分析
枸杞中含有丰富的矿物质，由于元素与植物种植区的地理和气候特征密切相关，它已被证明是研究农产品植物学和地理特征的有力方法[4，8]。如表1所示，S3中Na含量最高（1 198.93 mg/100 g），S4中K、Na、Mg、Ca、Zn和Cu含量最低。红枸杞、黄枸杞和黑枸杞中Fe和Mn的含量差异较小。除Na以外，样品S6中所测元素的含量均高于其他样品，其K、Mg、Ca、Fe、Mn、Cu和Zn元素的含量分别为1 527.29 mg/100 g、288.96mg/100g、530.72mg/100g、36.13mg/100g、2.30mg/100g、8.11 mg/kg和10.37 mg/kg，高于吴有锋等[26]报道的不同产地及采摘期柴达木枸杞中无机元素含量。结果表明，即使生长于地理和气候相近的地区，枸杞中元素的含量也会因栽培过程、采摘时间或品种的差异而不同。
表1 3种枸杞样品中元素Na、K、Mg、Ca、Fe、Mn、Zn和Cu含量测定结果
Table 1 Determination results of contents of Na,K,Mg,Ca,Fe,Mn,Zn,and Cu in 3 kinds of goji berries samples
2.3 枸杞中维生素和胡萝卜素的含量分析
类胡萝卜素和维生素是维持正常生命活动所必需的有机化合物，均为生物活性物质，具有抗氧化作用、调节免疫、影响胚胎发育和生殖的作用[2，5-6，8-9]。枸杞中β-胡萝卜素、维生素E以及维生素C的测定结果见图2。
由图2可知，样品S6中β-胡萝卜素和维生素E的含量分别为5.23 μg/100 g和17.30 mg/100 g，高于其他5个枸杞样品的含量，差异显著（P＜0.05）。其他5个枸杞样品中β-胡萝卜素和维生素E的含量分别在0.18～0.86 μg/100 g和4.00～7.59 mg/100 g的范围内。黑枸杞中维生素C的含量也高于黄枸杞和红枸杞，S3维生素C的含量最低。红枸杞中维生素E和β-胡萝卜素含量高于黄枸杞。样品S5和其他两个枸杞品种的类胡萝卜素和维生素含量没有显著差异（P＞0.05）。推测两个黑枸杞样本中维生素和β-胡萝卜素含量的差异可能是由于采摘、晾干和存放等原因而造成的。
图2 3种枸杞样品中维生素C、维生素E和β-胡萝卜素含量测定结果
Fig.2 Determination results of contents of vitamin C,and vitamin E and β-carotene in 3 kinds of goji berries samples
2.4 枸杞中氨基酸的组成和含量分析
2.4.1 枸杞果实的氨基酸组成及含量
氨基酸组成及含量是评价食品营养价值的关键，而必须氨基酸的种类、含量和组成比例决定了氨基酸的营养价值[27]。3种枸杞样品的氨基酸组成和含量的分析结果见表2。由表2可知，枸杞样品中共检出17种氨基酸，其中必需氨基酸（essential amino acid，EAA）9种、非必需氨基酸（nonessential amino acid，NEAA）7种、药性氨基酸（pharmaceutical amino acid，PAA）7种、芳香族氨基酸（aromatic amino acid，AAA）2种、含硫氨基酸（sulphur-containing amino acid，SAA）2种、鲜味氨基酸（umami amino acid，UAA）2种和甜味氨基酸（sweet amino acid，SAA）4种。
表2 3种枸杞样品的氨基酸含量测定结果
Table 2 Determination results of amino acid contents in 3 kinds of goji berries samples
注：1为EAA；2为NEAA；3为AAA；4为含硫氨基酸；5为PAA；6为FAA；7GAA；EAA总含量=Thr+Val+Met+Ile+Leu+Tyr+Phe+His+Lys；NEAA总含量=Asp+Ser+Glu+Pro+Gly+Ala+Arg；AAA总含量=Phe+Tyr；SAA总含量=Cys+Met；PAA总含量=Asp+Glu+Val+Leu+Ile+Arg+Lys；FAA总含量=Asp+Glu；GAA=Gly+Ala+Ser+Phe。
各氨基酸的相对含量（各氨基酸含量与总氨基酸含量的比值）、类别及比例分布见图3。由图3A可知，红枸杞、黄枸杞和黑枸杞氨基酸组成一致而含量存在差异。其中，Glu和Asp的相对含量在3种枸杞中均高于其他氨基酸，Met的相对含量最低。枸杞的氨基酸含量主要由其植物基因和外部环境条件两个方面决定。谷氨酸是食物中非常常见的氨基酸，它是植物蛋白和动物蛋白的主要成分，也是大多数食物的主要成分，特别是经过加热、发酵、成熟或陈化等处理后，它以自由的形式存在，是典型的鲜味物质[28]。显然，含量丰富的鲜味氨基酸Glu和Asp使枸杞具有令人愉快的适口性。S6样品中Glu含量为1.5g/100g，高于S3样品（1.05g/100g）和S2样品（0.96 g/100 g）中Glu的含量。由图3B可知，黑枸杞的TAA、EAA、NEAA、PAA、UAA、AAA和SAA的总量均高于其他两种枸杞，其EAA的含量大小为Leu＞Lys＞Val＞Phe＞Thr＞Ile＞Tyr＞His＞Met。由图3C可知，样品S1～S5中的EAA和TAA的比值在34.1%～36.6%的范围内，EAA和NEAA的比值在47.9%～52.5%的范围内，接近世界卫生组织（World Health Organization，WHO）/联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）规定的理想蛋白质的EAA/ TAA为40%左右，EAA/NEAA在60%以上的规定。黑枸杞EAA和NEAA的总量均高于其他两种枸杞，含量分别高达3.64 g/100 g和4.14 g/100 g，样品S6中的EAA与TAA的比值为42.3%，EAA和NEAA的比值达74.7%，符合WHO/FAO规定的理想蛋白质的要求。
图3 3种枸杞样品中氨基酸的相对含量（A）、类别（B）及比例（C）
Fig.3 Distribution of relative content (A),types (B) and proportion (C) of amino acids in 3 kinds of goji berries samples
2.4.2 必需氨基酸营养价值评价
比较红枸杞、黄枸杞和黑枸杞中的EAA成分，并与WHO/FAO“人类营养中蛋白质和氨基酸需要量”专家咨询报告推荐的氨基酸模式值比较，结果见表3。
表3 必需氨基酸与WHO/FAO推荐的氨基酸模式的比较
Table 3 Comparison of essential amino acids with amino acid patterns recommended by WHO/FAO
由表3可知，样品S6中的EAA组分占TAA的质量分数均高于的推荐值，符合氨基酸理想模式比例。所有枸杞SAA（Met+Cys）模式比例大于推荐值。此外，除样品S6外，所有枸杞样品中Thr模式比例都高于或接近推荐值，而且样品S4、S5中的AAA（Phe+Tyr）组分占TAA的质量分数均高于的推荐值，其他氨基酸模式比例都与理想氨基酸模式推荐值有一定的差异。
WHO/FAO规定可以采用氨基酸评分（amino acid score，AAS）[27]反映被测食物蛋白质氨基酸构成和利用率，其计算公式如下：
一种食物蛋白质的氨基酸的评分即为该食物中最低的必需氨基酸评分值，氨基酸评分越高，其蛋白质营养价值越高。以WHO/FAO提出的氨基酸参考模式为标准，采用AAS分析方法，对枸杞样本的EAA进行评价，结果见表4。
依据佩特利用必需氨基酸指数（essential amino acid index，EAAI）评价蛋白质源时的判断标准[29]，当n=6～12时，EAAI＞90%为优质蛋白质源；85%＜EAAI＜95%为良好蛋白质源；75%＜EAAI＜85%为可用蛋白质源；EAAI＜75%为不适蛋白质源。EAAI计算公式如下：
式中：n为必需氨基酸数量（n=7）；T为待评价蛋白质；S为标准蛋白质。
枸杞EAAI计算结果见表4。
表4 3种枸杞样品中氨基酸营养价值评价
Table 4 Evaluation of nutritional value of amino acids in 3 kinds of goji berries samples
由表4可知，样品S6中的氨基酸得分最高，最高的AAA（Phe+Tyr）和Leu的氨基酸评分分别达到了143.83分和128.00分。枸杞第一限制性氨基酸为SAA（Met+Cys），各品种的AAS值介于31.71%～44.29%之间。样品S5、S6中的EAAI分别为107.44%和91.94%，均大于90%，说明在三种枸杞品种中黑枸杞蛋白价值相对最好，属于优质蛋白源。
2.5 多元变量统计分析和品质评价
为了直观反映营养成分如蛋白质、氨基酸、维生素和无机元素等34个指标的含量大小和样品间的差异，采用聚类分析热图对枸杞中营养成分的含量进行可视化处理，通过纵向层次聚类反映34个指标的相互关系，通过横向层次聚类反映样品间的相似性，结果见图4。由图4可知，热图中颜色由蓝变红，显示含量由低变高，颜色越接近红色，表示含量越高。此外，热图顶部的树状图也提供了枸杞样品34个营养成分的相似性和差异性的信息。顶部树状分支高度依次为S6＞S5＞S4＞S3＞S1＞S2，而S6和S5的分支高度比较长，说明黑枸杞与黄枸杞和红枸杞不同。
图4 3种枸杞样品中营养成分聚类分析热图
Fig.4 Heat map of nutrient composition cluster analysis of 3 kinds of goji berries samples
如图4所示，从整体含量水平上看，样品S6与其他枸杞存在显著差异，样品S5与黄枸杞和红枸杞也存在明显差别，黄枸杞和红枸杞之间更相似。结合营养成分的含量大小，通过层状聚类分析将枸杞样品分为3类，第一类为样品S6，除水分、总碳水化合物和蛋白质外，其他营养成分含量都接近或远大于其他枸杞的含量，属于高品质枸杞；第二类为样品S5，除总碳水化合物、蛋白质和总脂肪外，其他营养成分含量都接近或远大于黄枸杞和红枸杞的含量，属于中等品质枸杞；黄枸杞和红枸杞中各个营养成分含量虽有不同但更接近，划分为第三类，属于一般品质枸杞。
因产地的地理和气候条件接近，推断两个黑枸杞营养价值和品质的差异可能是由栽培、采摘时间、晾干和储藏等过程的变化或差异而引起，而黑枸杞与黄枸杞以及红枸杞营养价值和品质的差异则主要可能是由植物基因和遗传导致。
3 结论
本研究对青海地理和气候相近地区的红枸杞、黄枸杞和黑枸杞的蛋白质、碳水化合物、膳食纤维、氨基酸、维生素、β-胡萝卜素、无机元素等含量进行了分析和比较，采用层次聚类分析法确定了基于上述营养参数的枸杞营养价值和品质评价方法。
三种枸杞营养成分各有特点。红枸杞的碳水化合物含量高，能量高，维生素E和β-胡萝卜素的含量高于黄枸杞。黑枸杞蛋白质、膳食纤维和灰分含量较高，碳水化合物含量低。
黑枸杞含有丰富的必需氨基酸、鲜味氨基酸和药用氨基酸资源，EAA/TAA较高，是较为优质的蛋白质资源。枸杞第1限制性氨基酸为含硫氨基酸（蛋氨酸＋半胱氨酸）。并且，相较其他两个枸杞品种，黑枸杞也可以拥有较高的维生素和β-胡萝卜素。此外，通过元素分析与评价发现黄枸杞Na和K元素含量丰富，Cu和Zn含量低。黄枸杞中Ca、Na、Mg、K、Zn和Cu的元素含量与其他两种枸杞差异显著。黑枸杞中Ca、K、Na、Mg和Zn含量均较为丰富。
研究证明黑枸杞各种营养成分含量丰富，配比合理，具有较高的开发利用价值和发展前景。另外，除地理和气候因素外，枸杞栽培、采收、晾干和储存等过程的差异也会影响枸杞中各种营养组分的含量。
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