水稻又称稻，为一年生禾本科稻属植物，营养价值高，种植地广泛，是五谷之首，人们食用最多谷物之一[1]，也是人类饮食中主要淀粉质食品之一[2]。现有研究表明，稻米富含70%～80%淀粉，并含约8%蛋白质和约2%脂肪，含硫胺、烟酸、核黄素、铁和钙[3]。《中华人民共和国药典2010版》正式把稻芽和谷芽区分，定义为本品为禾本科的植物稻的成熟果实通过发芽和干燥后的炮制加工品，将稻谷用水浸泡后，保持适合的温湿度，待须根长至约10 mm时，干燥得到稻芽[4]。作为中药材，稻芽具有强健脾胃的功效，可以单用，更多和麦芽、陈皮等一起使用[5]。随着人们对健康意识的提高，稻谷发芽产品，除用作主食之外，还被开发加工成多系列食品，如发芽糙米糕、糙米芽酱汁、发芽糙米药膳等[6]。
稻芽含有蛋白质、脂肪油、腺嘌呤、胆碱以及多种糖类物质和氨基酸[7]。稻谷在发芽的过程中，米体的营养物质发生了变化，休眠的酶活力被激活大大释放出来[8]，大分子物质开始转变为小分子物质如蛋白质开始降解为氨基酸及多肽，淀粉开始转化为可溶性多糖、还原糖等，维生素、矿物质也大大增加[9]；吴凤凤[10]研究发现，随着发芽糙米时间的延长，其体外抗氧化活性及免疫功能明显提高；刘雅晴等[11]研究表明，稻谷在发芽时随着时间增长，其体外抗氧化活性逐渐增强；胡玲玲等[12]研究发现，发芽糙米蛋白具有一定的抗氧化活性。
西方国家对稻芽产品研究已经开展了几十年，有力地促进了工业化生产[13]。但是，在我国无论是在市场上还是在网络媒体中，很少报道焦香稻芽发酵饮料的工艺研究。因此，本研究以稻芽为原料，经过发芽、焙烤、复配、糖化、利用自制发酵剂发酵等工艺，研制出一款具有特殊香气和口感适宜的焦香稻芽发酵饮料。并采用单因素及响应面试验，优化焦香稻芽发酵饮料工艺条件，并对其理化指标进行评价，旨在增加稻芽饮料新品种，为稻芽的加工提供新方法，也为谷物发酵饮料的产品创新等方面的研究提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
水稻（品种由吉林市昌邑区农业技术推广中心陈俸鉴定为“小町”）、基础麦芽（4-7EBC，原产地为澳洲）：市售；自制发酵剂（库德毕赤酵母∶东方伊萨酵母∶20菌型川秀乳酸发酵剂=1∶1∶0.15）：北华大学食品开发与检测研究院提供。
1.2 仪器与设备
BSD-100振荡培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SAINMATE SEC 3Y三层六盘商用电烤箱：广州粤盟厨具有限公司；BPG-9240A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；2WAJ阿贝折光仪：上海精科实业有限公司；JYL-CO2OE破壁机：九阳股份有限公司；37 L厌氧发酵罐：齐河县浩德设备有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 焦香稻芽发酵饮料工艺流程及操作要点[14-17]
复配稻芽粉碎→蛋白休止→糖化→煮沸→悬沉→原汁（上清液）→发酵→焦香稻芽饮料
①复配稻芽的制备：称取水稻发芽后的绿稻芽3.0 kg装盘平铺厚度1.5 cm，用湿纱布包裹，设置电热鼓风干燥箱的温度：一阶段为60 ℃、时间为12 h，二阶段为70 ℃、时间为6 h，得到基础稻芽；称取2.0 kg基础稻芽经过升温，在112 ℃条件下保温4 h，焙烤成浅色焦香稻芽；称取1.0 kg浅色焦香稻芽快速升温至135 ℃，此温度条件下焙烤2 h成深色焦香稻芽。设定底物原料复配配比为基础稻芽55%、浅色焦香稻芽20%、深色焦香稻芽15%，并添加10%基础麦芽。用破壁机将底物原料破碎，要求破而不碎，同时借鉴啤酒加工工艺，确定料液比为1∶5（g∶mL）；
②蛋白休止：设定蛋白水解时间为50 min、水解温度55 ℃；
③糖化：设定糖化工艺为69 ℃水浴60 min；
④煮沸：将糖化后所得醪液加热至沸腾保温60 min，停止加热，冷却至室温；
⑤悬沉：采用悬沉沉降法过滤糖化液，悬沉30 min，取上层清液；
⑥发酵：在37 L厌氧发酵罐中，接种一定量的自制发酵剂，通入纯氧，待发酵罐压力表升至0.005 kPa，停止输氧，通入二氧化碳，待发酵罐压力表升至0.020 kPa停止输送二氧化碳，封闭发酵罐，进行恒温（18 ℃）静置发酵18 h，得到焦香稻芽发酵饮料。
1.3.2 焦香稻芽发酵饮料发酵工艺优化
焦香稻芽发酵饮料工艺优化单因素试验：分别设定发酵温度为16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃，发酵时间为12 h、14 h、16 h、18 h、20 h，发酵剂接种量为2%、4%、6%、8%、10%，进行单因素试验，考察不同因素对发酵效果的影响。以发酵后焦香稻芽饮料的感官评分为评价指标确定最佳工艺。
响应面试验优化焦香稻芽发酵饮料发酵工艺[18-22]：在单因素试验的基础上，以发酵温度（A）、发酵时间（B）和发酵剂接种量（C）3个因素为自变量，以产品感官评分（Y）为响应值，采用Design-Expert V.8.0.5进行响应面设计优化发酵工艺，响应面试验因素与水平见表1。
表1 焦香稻芽发酵饮料发酵条件优化响应面试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation conditions optimization of burnt rice sprouts fermented beverage
1.3.3 测定方法
总酸（以乳酸计）：按照GB 5009.239—2016《食品酸度的测定》测定；固形物含量：以阿贝折光仪测定；蛋白质：按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》测定；还原糖：斐林试剂法；氨基酸态氮：按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》测定；产气量：按照GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》测定。
细菌总数：稀释平皿计数法；大肠菌群：按照GB4789.3—2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》测定；乳酸菌活菌数：按照GB 4789.35—2016《食品微生物学检验乳酸菌检验》测定；酵母菌数：按照GB 4789.15—2016《食品微生物学检验霉菌和酵母计数》测定；致病菌：按照GB 4789.4—2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》测定。
感官评价：经过感官评价培训的人员10人对焦香稻芽发酵饮料进行打分，满分为100分。感官评价标准见表2。
表2 焦香稻芽发酵饮料感官评价标准
Table 2 Sensory evaluation standards of fermented beverage with burnt rice sprouts
续表
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化单因素试验
2.1.1 发酵温度对焦香稻芽发酵饮料感官评价的影响
由图1可知，随着发酵温度的升高，焦香稻芽发酵饮料感官评分呈现出先上升后下降的趋势，在发酵温度为24℃时，感官评分达到最高为96.5分。可能是因为发酵剂的活性受到影响，在发酵温度过低或过高时，酶活性都呈现下降趋势，发酵剂的活性也随之下降，发酵效果不好，口感一般。发酵温度为24 ℃，饮料的口感和味道最好。因此，选择发酵温度为24 ℃。
图1 发酵温度对焦香稻芽发酵饮料感官评价的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation score of fermented beverage with burnt rice sprouts
2.1.2 发酵时间对焦香稻芽发酵饮料感官评价的影响
由图2可知，随着发酵时间的延长，焦香稻芽发酵饮料感官评分呈现出先上升后下降的趋势，在发酵时间为18 h条件下，感官评分达到最高为97分。由于前期发酵时间较短，发酵剂发酵不充分，酸味不足，口感清淡；发酵时间较长，产酸过多，口感不协调；而发酵时间在18 h时，酸味适中，口感好，发酵效果最好。因此，选择发酵时间为18 h。
图2 发酵时间对焦香稻芽发酵饮料感官评价的影响
Fig.2 Effect of fermentation time on sensory evaluation score of fermented beverage with burnt rice sprouts
2.1.3 接种量对焦香稻芽发酵饮料感官评价的影响
由图3可知，随着发酵剂接种量的增加，焦香稻芽发酵饮料感官评分呈现出先上升后下降的趋势，接种量为4%时，感官评分达到最高为95分。接种量较少时发酵不充分，组织状态不稳定，味道稍差；接种量过多时，酸的生成量过多，味道不协调。接种量为4%时，发酵适宜，酸度适度，饮料的口感和味道最好。因此，选择发酵剂接种量为4%。
图3 接种量对焦香稻芽发酵饮料感官评价的影响
Fig.3 Effect of inoculum on sensory evaluation score of fermented beverage with burnt rice sprouts
2.2 发酵工艺优化响应面试验结果与分析
根据单因素试验结果，以发酵温度（A）、发酵时间（B）及发酵剂接种量（C）为自变量，感官评分（Y）为因变量进行响应面试验，结果与分析见表3，方差分析见表4。
表3 焦香稻芽发酵饮料发酵条件优化响应面试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of response surface methodology for fermentation conditions optimization of fermented beverage with burnt rice sprouts
表4 响应面试验方差分析
Table 4 Variance analysis of response surface methodology
注：P＜0.05表示对结果影响显著；P＜0.01表示对结果影响极显著。
利用软件Design-Expert.V.8.0.5对表3数据进行回归拟合，获得发酵时间（A）、发酵温度（B）、发酵剂接种量（C）对感官评分（Y）影响的多元回归方程为：Y=95.960-2.212A-1.575B-2.787C-20.268A2-3.942B2-23.768C2+5.150AB-8.275AC+1.850BC
由表4可知，模型极显著（P=0.000＜0.01），失拟项不显著（P=0.113＞0.05）。回归模型的决定系数R2=0.997 3，说明该模型能够很好地描述试验结果。变异系数（coefficient of variation，CV）为89%，说明模型的准确度及可靠性较高[23-24]。从表4中P值和回归方程中各因素的一次项系数的绝对值大小可知，影响焦香稻芽发酵饮料感官评价因素主次顺序为发酵剂接种量＞发酵温度＞发酵时间[25]。一次项A、C，二次项A2、B2、C2和交互项AB、AC对产品感官评分的影响达到极显著水平（P＜0.01），一次项B和交互项BC对产品感官评分的影响达到显著水平（P＜0.05）。
利用Design-Expert.V.8.0.5软件对影响焦香稻芽发酵饮料的3个因素进行交互分析，结果见图4。
由图4可知，发酵时间（A）与发酵温度（B）、发酵时间（A）与发酵剂接种量（C）、发酵温度（B）与发酵剂接种量（C）与对饮料的感官评分（Y）影响均达到显著水平（P＜0.05），与方差分析结果一致。
图4 发酵时间、发酵温度和发酵剂添加量交互作用对焦香稻芽发酵饮料感官评分影响的等高线及响应曲面
Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fermentation time，temperature and starter addition on sensory score of fermented beverage with burnt rice sprouts
借助回归模型的数学分析结果得到焦香稻芽发酵饮料的最佳发酵条件为发酵时间17.5 h、发酵温度23.5 ℃、发酵剂接种量3.9%，在此条件下，焦香稻芽发酵饮料感官评分理论值为94.7分。为了便于实际操作，修改发酵条件为发酵时间18 h、发酵温度24 ℃、发酵剂接种量4%，此条件下焦香稻芽发酵饮料的感官评分实际值为95.0分，与预测理论值差别不大，说明该模型可以较好地模拟和预测试验结果。
2.3 焦香稻芽发酵饮料品质分析
2.3.1 理化指标
对焦香稻芽发酵饮料的基本理化指标进行分析，结果见表5。
表5 焦香稻芽发酵饮料的理化指标分析结果
Table 5 Analysis results of physical and chemical indexes of fermentation beverage with burnt rice sprouts
由表5可知，焦香稻芽发酵饮料的蛋白质含量为2.42%，这是由于稻芽中的蛋白只有部分能溶于水中。氨基酸态氮含量为732 mg/100 mL，说明焦香稻芽在焙烤后美拉德反应释放更多的风味物质，使饮料有特殊的焦香味。
2.3.2 微生物指标
经测定，焦香稻芽发酵饮料的乳酸菌活菌为（5.04±0.22）×107 CFU/mL，酵母菌为（3.25±0.41）×107 CFU/mL，细菌总数＜1 000 CFU/mL，大肠菌群＜10 CFU/mL，未检出致病菌。
2.3.3 感官指标
焦香稻芽发酵饮料感官评分达95分，产品清澈透明的黄棕色、稻芽焦香香气浓郁、口味柔和协调，饮料风味饱满突出。
3 结论
经单因素及响应面试验确定焦香稻芽发酵饮料的最优发酵条件为发酵时间18 h、发酵温度24 ℃、发酵剂接种量4%，此条件下饮料的总酸含量为1.98 mL/100 mL，还原糖含量为8.25%，可溶性固形物含量为1.30%，蛋白质含量为2.42%，氨基酸态氮含量为732 mg/100 mL，产气量为0.46%，感官评分为95.0分。焦香稻芽发酵饮料色泽透亮、颜色偏深、无悬浮物，口感清爽醇厚、味道均衡，具有独特的焦香风味、无异味。
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