米曲霉（Aspergillus oryzae）属于曲霉属[1-2]，主要存在于发酵食品、粮食、土壤以及腐败的有机物中，是美国食品与药品管理局和美国饲料公司协会发布的安全菌种之一[3-4]。米曲霉是一类可以产复合酶的菌种[5-7]，菌丝一般由多细胞组成，能够产生丰富的蛋白酶系，包括碱性蛋白酶，中性蛋白酶和酸性蛋白酶，中性蛋白酶能耐受较高的温度[8]。由于液态深层发酵具有生长周期短、成本低、传质传热性良好、各种生化反应更为均匀的特点[9-10]，而且霉菌在液态培养基中一般长势良好，产酶的效率较高[11-13]，明显高于固态发酵[14-16]。因此，霉菌生产蛋白酶主要采用液态深层发酵的方法[17-18]。
香菇（Lentinula edodes）既富含蛋白质、碳水化合物、脂肪酸、维生素、膳食纤维以及矿物质等营养成分又含有多糖等多种活性成分，属于食药两用菌[19-21]。目前，我国由香菇资源开发的产品还不是很多，其中大部分被作为食材，在欧洲地区及日本等发达国家，香菇除作食材外，主要用于肽类药物以及功能食品和食品添加剂[22]。香菇残次品和加工中的下脚料作为发酵原料制作酒精[23]、葡萄酒[24]、饮料[25-26]和调味品[27]等，但是，其利用率还不高，产品的种类偏少且附加值高的产品不多[28]。对香菇残次品进行液态发酵，提高蛋白酶酶活以提高其利用率[29-30]，但蛋白酶活受菌种以及发酵条件的影响[30-32]。
本研究以香菇残次品及其加工中的下脚料为主要原料，以米曲霉（Aspergillus oryzae）为菌种，采用液态发酵，以蛋白酶活为响应值，通过单因素试验及响应面试验优化米曲霉产蛋白酶的发酵条件，以期利用香菇残次品生产蛋白酶提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料与菌株
香菇残次品及其加工中的下脚料：荆州市欣恺生物科技有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）：长江大学生命科学学院保藏。
1.1.2 试剂
葡萄糖、蔗糖、硝酸钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、盐酸、干酪素、氢氧化钠、茚三酮、醋酸、醋酸钠、三氯乙酸（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；L-酪氨酸、L-丙氨酸（纯度均为99%）：上海麦克林生化科技有限公司。
1.1.3 培养基
酪蛋白培养基[33]：干酪素4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO4 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.001 g/L，NaCl 1 g，ZnCl2 0.015 g/L，CaCl2·2H2O 0.005 g/L，琼脂20 g，蒸馏水溶解定容1 000 mL，pH 6.5～7.0。121 ℃灭菌25 min。
马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextroseagar，PDA）培养基[34]：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，蒸馏水1 000 mL。121 ℃灭菌25 min。
香菇液体培养基：将香菇残次品加入6～12倍的蒸馏水，用高速匀浆机打成浆。121 ℃灭菌25 min。
1.2 仪器与设备
DL-5-C高速冷冻离心机：上海予皓科学仪器有限公司；ET-2010KA立式双门回旋摇床：金坛市亿通电子有限公司；UV-1800紫外分光光度计：日本岛津（SHIMADIU）公司；HH-4恒温水浴锅：上海蓝凯仪器仪表有限公司；BS-IE电热恒温振荡培养箱：上海精宏实验设备有限公司；HVE-50立体式高压灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；SPX-250B-Z生化恒温培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；FSH-2高速匀浆机：常州亿通分析仪器制造有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种活化
将米曲霉接种到酪蛋白培养基中，30 ℃恒温静置培养72 h，观察透明圈直径大小，挑出直径较大的菌落，接种到PDA斜面上，30 ℃恒温静置培养72 h。转接3次，得到蛋白酶活力较高的菌株，4 ℃条件保藏，备用。
1.3.2 孢子悬液的制备
吸取20 mL无菌水加入到米曲霉斜面试管上，用接种环将试管斜面上的孢子轻轻刮下，倒入带有4层擦镜纸的灭菌漏斗中过滤，然后将过滤的米曲霉菌液倒入盛有小玻璃珠50 mL的灭菌三角瓶中，重复3次，于30 ℃，150 r/min条件下振荡15 min，将孢子充分打散，得到米曲霉单孢子悬液。
1.3.3 米曲霉产蛋白酶发酵条件优化
单因素试验：将单孢子悬液按1%（V/V）接种于发酵培养基，30 ℃恒温发酵，考察发酵时间（1 d、2 d、3 d、4 d、5 d）、料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g∶mL））、初始pH值（5.5、6.5、7.5、8.5、9.5）、转速（135 r/min、155 r/min、175 r/min、195 r/min、215 r/min）对蛋白酶活力的影响。
响应面试验：在单因素试验的基础上，固定发酵时间3 d，以米曲霉蛋白酶活力（Y）为响应值，选取对结果影响较大的初始pH值（A）、料液比（B）和转速（C）作为影响因素，进行3因素3水平的响应面试验，因素与水平见表1。
表1 发酵条件优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization
1.3.4 分析检测
蛋白酶活力的测定采用商业行业标准SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》中的福林法[36]；氨基酸含量测定采用茚三酮比色法[37]。蛋白酶活力定义：即每1 mL液体酶在40 ℃下，1 min水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸所需酶量，定义为1个蛋白酶活力单位（U/mL）。
1.3.5 统计分析
采用Design-Expert 8.0.6.1软件进行Plackett-Burman试验和Box-Behnken响应面优化试验设计，运用该软件的数据分析功能进行数据分析，建立回归模型，并对建立的模型进行验证，利用Origin 8.5和SPSS 20.0软件对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 米曲霉产蛋白酶发酵条件优化单因素试验
2.1.1 发酵时间对米曲霉产蛋白酶活力的影响
发酵时间对蛋白酶活力的影响见图1。
图1 发酵时间对蛋白酶活力的影响
Fig.1 Effect of fermentation time on protease activity
由图1可知，随着发酵时间在1～3 d范围内的延长，蛋白酶活力曲线呈上升趋势；当发酵时间为3 d时，米曲霉蛋白酶活力最高，为541.9 U/mL；当发酵时间＞3 d之后，蛋白酶活力有所下降。分析原因可能是，在发酵前期（发酵时间3 d前），随发酵时间的延长，米曲霉处于生长旺盛期，产蛋白酶能力增强，因此米曲霉产蛋白酶活力提高。但发酵后期（发酵时间3 d后），米曲霉产生的蛋白酶用于降解香菇中蛋白质而消耗蛋白酶，因此发酵后期蛋白酶活力降低。因此，选择最佳发酵时间为3 d。
2.1.2 料液比对蛋白酶活力的影响
料液比对蛋白酶活力的影响见图2。
图2 料液比对蛋白酶活力的影响
Fig.2 Effect of solid and liquid ratio on protease activity
由图2可知，料液比为1∶6、1∶8、1∶10（g∶mL）时，随着液体占比的增加，发酵液中蛋白酶活力呈现增加的趋势；料液比为1∶10（g∶mL）时，培养基质中蛋白酶活力值最高；当液体占比继续增加，蛋白酶活力下降。水分是微生物生长和代谢很重要的影响因素，水分过低时，不能把香菇中的营养成分充分溶解，不利于米曲霉的生长和代谢产酶。水分过高时，溶液形成水层，不利于氧的传递，影响米曲霉的生长代谢，导致蛋白酶产量较少[38]。因此，选择最佳料液比为1∶10（g∶mL）。
2.1.3 初始pH值对蛋白酶活力的影响
初始pH值对蛋白酶活力的影响见图3。
图3 初始pH值对蛋白酶活力的影响
Fig.3 Effect of initial pH value on protease activity
由图3可知，在不同的初始pH值下，米曲霉产蛋白酶的活力不同。随着培养基初始pH值在5.0～6.5范围内的增加，蛋白酶活力增加；初始pH值为6.5时蛋白酶活力最高，初始pH值为6.5～11.0时，随着初始pH值增加，蛋白酶活力逐渐降低。这说明米曲霉在偏碱性环境中对米曲霉产蛋白酶有一定的抑制作用[39]。因此，选择最佳初始pH值为6.5。
2.1.4 转速对蛋白酶活力的影响
转速对蛋白酶活力的影响见图4。
由图4可知，随着转速在135～175 r/min范围内的增加，蛋白酶活力呈快速增加的趋势；当转速为175 r/min时，蛋白酶活力值达到最大，为405.16 U/mL；当转速为175～215 r/min时，蛋白酶活力下降。可能是因为转速在135～175 r/min，发酵液溶氧量增加，有利于米曲霉的生长[40]，导致米曲霉产蛋白酶酶活增加；而培养转速过高，发酵液流动剪切力不断增强，导致菌丝体结构结实紧密，不利于米曲霉的生长和代谢[41]，导致米曲霉产蛋白酶酶活力降低。因此，选择最佳转速175 r/min。
图4 转速对蛋白酶活力的影响
Fig.4 Effect of rotating speed on protease activity
2.2 米曲霉产蛋白酶发酵条件优化响应面试验
在单因素试验基础上，以初始pH值（A）、料液比（B）、转速（C）为响应因子，以蛋白酶活（Y）为响应值进行评价，采用3因素3水平响应面试验优化米曲霉产蛋白酶发酵条件，Box-Behnken试验设计及结果见表2，二次回归模型方差分析见表3。
表2 发酵条件优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for fermentation conditions optimization
表3 回归模型方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05），“**”表示对结果影响极显著
（P＜0.01）。
通过Design Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多项回归拟合，获得蛋白酶酶活力与初始pH值、料液比和转速的二次多项式回归方程：
Y=1 183.03+5.31A+56.21B-14.14C-22.55AB+31.87AC-109.80BC-123.36A2-172.55B2-190.36C2
由表3可知，模型P＜0.000 1，表明该模型高度显著；失拟项P=0.454 6＞0.05，表明失拟项不显著，该模型的拟合度良好。除一次项A对米曲霉产蛋白酶活力的影响不显著（P＞0.05）外，一次项C和交互项AB对米曲霉产蛋白酶活力的影响显著（P＜0.05），一次项B、交互项AC、BC以及二次项A2、B2、C2对米曲霉产蛋白酶活力影响极显著（P＜0.01）。回归方程决定系数R2=0.965 6，调整决定系数
=0.990 2，表明此回归模型能够解释96.56%的响应变化。说明该模型拟合程度良好，试验误差小，可信度较高，可用此模型对米曲霉产蛋白酶活发酵条件进行预测。同时，确定影响米曲霉产蛋白酶活3因素顺序为B＞C＞A，即料液比＞转速＞初始pH值。
2.3 响应面各因素交互作用分析
各因素交互作用对米曲霉产蛋白酶活影响的响应面及等高线见图5。
图5 各因素交互作用对米曲霉产蛋白酶酶活影响的响应面及等高线
Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on activity of protease produced by Aspergillus oryzae
若响应面较陡峭，说明该因素对蛋白酶酶活的影响较大；若响应面相对平缓，说明该因素对蛋白酶酶活的影响较小。由图5可知，料液比与初始pH值之间交互作用的响应面陡峭，对响应值影响显著；转速与初始pH值之间交互作用的响应面陡峭，对响应值影响极显著；料液比与转速之间交互作用的响应面最陡峭，对响应值影响极显著。这与回归模型方差分析结果一致。
2.4 验证试验
采用Design Expert 8.0.6.1软件对回归方程进行求解，最终确定米曲霉产蛋白酶活的最优发酵条件为初始pH值6.5，料液比1∶10（g∶mL），转速175 r/min，该条件下蛋白酶酶活力预测值为1 183.04 U/mL。为了验证模拟模型的准确性，采用优化后的最佳发酵条件进行3次验证试验，检测的蛋白酶活力的实际平均值为1 182.48 U/mL，与预测值相近，说明该工艺可行。
3 结论
本研究以米曲霉（Aspergillus oryzae）为菌种，对香菇残次品进行液态发酵，在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验方法优化米曲霉产蛋白酶活发酵条件。结果表明，米曲霉液态发酵香菇残次品产蛋白酶活最优条件为发酵时间3 d，发酵初始pH值6.5，料液比1∶10（g∶mL），转速175 r/min。在此优化条件下，蛋白酶活力实际值为1 182.48 U/mL。采用该方法优化米曲霉产蛋白酶活的发酵条件，能够提高其产蛋白酶的酶活力，为香菇残次品的综合利用提供了一定的理论依据。
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