樱桃的营养非常丰富、味道鲜美,富含糖、维生素、氨基酸、有机酸和矿物质等成分[1-2]。此外,樱桃中还含有类黄酮、抗坏血酸、酚类、花青素等营养健康成分[3-4]。我国种植樱桃品种主要为甜樱桃(Prunus avium L.)、酸樱桃(Prunus cerasus L.)、中国樱桃(Prunus pseudocerasus L.)和毛樱桃(Prunus tomentosa Thunb),主要樱桃产地为山东省、江苏省和四川省[5]。由于樱桃水分含量高,皮薄、肉软,组织娇嫩,采摘后不易储存,导致樱桃极易变味、变质而失去价值[6]。随着樱桃产量的增加、人们对产品质量要求的提高,开发樱桃酒等高附加值、易储存的产品成为一种趋势。
风味是评价食品质量的重要指标,也是樱桃酒最重要的特征和品质之一。樱桃中的主要风味物质为己烯醛、2-己烯-1-醇、乙醇、2-丙酮、乙醛、己醛、苯甲醛和苯甲醇[1]。经过酵母菌发酵后,樱桃酒的风味成分变得更为复杂。在樱桃酒中,可以检测到许多成分:如氨基酸、微量元素、有机酸、酚类和风味物质等。风味物质是评价食品质量的基本感官指标之一,影响着最终产品的质量。酒的风味受到原料、菌种、发酵工艺、熟化过程等多种因素的影响[5,7-9]。在过去的研究中,数千种风味物质可以在果酒中被检测到,但只有很少能够达到气味阈值并被闻到。NIU Y W等[10]通过固相微萃取(solid phase microextraction,SPME)结合气质联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术,从樱桃酒中检出24种成分;结合气相色谱-嗅闻技术(gas chromatography olfactometry,GC-O),确定了7种主要挥发性成分。SUN S Y等[11]利用顶空固相微萃取结合气质联用,从樱桃酒中检出21种挥发性成分,包括6种酯类、2种醇类、6种萜类和1种酚类等。通过应用顶空固相微萃取(headspacesolid phase microextraction,HS-SPME)、气相色谱(gas chromatography,GC)、气相色谱-质谱联用、顶空-气相色谱或氢火焰离子化检测器(headspace-gas chromatography/flame ionization detector,HS-GC/FID)等技术手段,根据其所含的风味物质成分,分析原料、菌种、发酵方式和熟化过程等对樱桃酒品质的影响,并评价其质量[12-15]。
离子迁移谱(ion mobility spectrometry,IMS)是一种能够单独检测气体混合物的分析仪器,具有小巧、轻便、灵敏、所需样品少的特点[16-17]。通过与气相色谱联用后,经过气相色谱柱的初次分离,随后进入离子迁移管,待测分子在电离区带电后,在电场和逆向漂移气的作用下迁移到达检测器检测,实现二次分离。它结合了二者优势,无需预处理、分辨率较高,仅需3~5 min就可以完成样品的检测[18]。在食品分类和掺假检测、食品新鲜度和腐坏度评价、异味检测、食品加工过程监测、食品贮藏等过程中香气变化评价具有极大的优势[19]。本实验以山东日照产新鲜樱桃发酵而成樱桃酒,通过顶空气相色谱-离子迁移谱(HS-GC-IMS)研究樱桃酒的挥发性风味成分,为理论研究和相关企业开发樱桃产品提供参考。
樱桃:山东省日照市五莲山“红灯”樱桃;白砂糖:市售。
果胶酶(酶活力1 000 U/g):诺维信生物技术有限公司;果酒酵母:湖北安琪酵母有限公司;氢氧化钠、盐酸(均为分析纯);产品用水为纯净水。
CTC CombiPAL自动顶空进样器:瑞士CTC Analytics AG公司;FlavourSpec气相离子迁移谱、食品风味分析与质量控制系统(Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析软件及GC×IMS Library Search Software定性软件):德国G.A.S公司;MJ-BL1052A料理机:广东美的生活电器制造有限公司;L550低速离心机:长沙湘仪离心机仪器有限公司;HPX-200生化培养箱:上海跃进医疗器械有限公司;HH-6电热恒温水浴锅:北京医疗设备厂;AE 200电子分析天平:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
1.3.1 樱桃酒制作基本工艺与操作要点
新鲜樱桃→拣选→清洗→除梗→去核→打浆→酶解→加糖→接种酵母菌→发酵→去渣→澄清→樱桃酒
操作要点:
取适量新鲜樱桃,去除其中的坏果、腐烂果和其他杂物,选择成熟度良好、颜色深的新鲜樱桃;手工摘除樱桃的果梗,再去掉樱桃核,将处理好的樱桃加入料理机,直接将樱桃进行破碎、打浆;打浆好的樱桃,加热至50 ℃,加入一定量果胶酶,保温并保持搅拌2 h;酶解过的樱桃浆,加入15%白砂糖并溶解[20],加入0.03%焦亚硫酸钠,搅拌均匀,接种0.05%果酒酵母,于23 ℃条件下,保持静置发酵7 d,至酒精度不再升高;发酵结束后使用离心机于4 000 r/min离心10 min,得到上层清液;经检测,酒精度为12.51%vol,还原糖含量9.7 g/L。
1.3.2 理化指标的测定
残糖量的测定:按照GB 5009.7—2016《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》执行[21];酒精度的测定:按照GB 5009.225—2016《食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定》执行[22]。
1.3.3 HS-GC-IMS分析条件
顶空孵育温度:35 ℃;孵育时间:10 min;孵育转速500 r/min;顶空进样针温度:40 ℃;进样体积:100.0 μL;色谱柱:FS-SE-54-CB-1(15 m×0.53 mm,1 μm);柱温:60 ℃;IMS温度:45 ℃;载气:高纯氮气(N2)(纯度≥99.999%)。
1.3.4 樱桃酒中风味物质的特征化合物的香气特征测定
基于LAV软件的GalleryPlot插件,确定樱桃酒中挥发性有机物(volatile organic compounds,VOCs)图谱,经过美国国家标准技术研究所(national institute of standards and technology,NIST)数据库和IMS数据库对物质定性分析,得到挥发性化合物的定性数据和峰面积数据,结合文献对化合物的描述[23-24],确定樱桃酒中风味物质的特征化合物的香气特征。
樱桃酒挥发性物质的GC-IMS三维图谱见图1,坐标分别代表保留时间,迁移时间和峰强度,每个峰信号代表一种挥发性化合物,三维图中可以直观看出挥发性有机物。根据保留时间和迁移时间可以鉴定出挥发性化合物的种类,峰强度则可以比较化合物浓度的差别。
图1 樱桃酒中挥发性物质三维离子迁移谱
Fig.1 Three-dimensional (3D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine
樱桃酒中挥发性物质二维图谱见图2,由图2可以看出:樱桃酒中的主要挥发性物质在迁移时间0.8~1.8 ms,保留时间200~800 s的范围内。通过HS-GC-IMS在樱桃酒中检出38种物质,对应鉴定出23种挥发性有机物。
图2 樱桃酒中挥发性物质二维离子迁移谱
Fig.2 Two-dimensional (2D)-ion mobility spectrometry of volatile compounds in cherry wine
通过HS-GC-IMS检出的物质和相关参数见表1,结果表明,樱桃酒中共检出23种挥发性化合物,其中酯类9种,分别为辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯和乙酸乙酯;醛类4种,分别为苯甲醛、糠醛、丙醛和戊醛;醇类5种,分别为己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇和丙醇;酮类3种,分别为3-羟基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮和丙酮;此外,还有部分2,6-二甲基吡嗪和乙酸存在。
表1 GC-IMS检测樱桃酒中的挥发物参数
Table 1 GC-IMS integration parameters of volatile compounds in cherry wine
续表
注:“D”代表二聚体;“M”代表单体。
樱桃酒的酯类成分尤为丰富,之前的报道中[12-14,25],乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸异丁酯为樱桃酒中的主要挥发性化合物,异丁酸乙酯和乙酸丙酯的相对含量较低,其中丙酸乙酯和乙酸异丁酯未有在樱桃酒检测到的报道。醇类成分中,不考虑乙醇的存在,3-甲基丁醇、2-甲基丙醇和丙醇是樱桃酒中的主要醇类风味物质,主要在酒精发酵过程中产生,与先前的报道一致[13],丁醇和己醇的相对含量较低。高级醇(包括丙醇、异丁醇、异戊醇和戊醇等)对酒类产品的风味有很大的影响,主要由酿酒酵母通过Ehrlich循环或糖酵解途径水解支链氨基酸产生[26]。高级醇的产生和含量的高低受到很多因素的影响,包括发酵温度、氨基酸浓度、发酵罐尺寸和陈酿条件等[27-28]。苯甲醛主要来自于樱桃果实中[29],糠醛和戊醛主要产生于酵母菌发酵过程中。此外,4-甲基-2-戊酮、2,6-二甲基吡嗪、3-羟基-2-丁酮和丙酮作为樱桃酒中重要的风味成分,也有着重要的作用,同时风味物质中还有少量乙酸的存在。
基于LAV软件的Gallery Plot插件,樱桃酒中挥发性物质的VOCs图谱见图3。
图3 樱桃酒中挥发性物质Gallery Plot图谱
Fig.3 Gallery Plot of volatile compounds in cherry wine
注:1.2-甲基丙醇-M,2.2-甲基丙醇-D,3.3-甲基丁醇-M,4.3-甲基丁醇-D,5.丙醇,6.丁醇-M,7.丁醇-D,8.己醇,9.丙醛,10.糠醛-M,11.糠醛-D,12.苯甲醛-M,13.苯甲醛-D,14.戊醛,15.4-甲基-2戊酮,16.丙酮,17.3-羟基-2-丁酮-M,18.3-羟基-2-丁酮-D,19.乙酸,20.丙酸乙酯,21.乙酸乙酯,22.乙酸异丁酯-M,23.乙酸异丁酯-D,24.辛酸乙酯,25.乙酸异戊酯-M,26.乙酸异戊酯-D,27.乙酸丙酯,28.己酸乙酯-M,29.己酸乙酯-D,30.丁酸乙酯,31.异丁酸乙酯,32.2,6-二甲基吡嗪-M,33.2,6-二甲基吡嗪-D。
由图3可知,樱桃酒中的挥发性成分含量较高主要为丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、丁醇、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羟基-2-丁酮、丙酮、4-甲基-2-戊酮和戊醛,这些成分为樱桃酒的主要挥发性风味成分。从挥发性图谱来看,2,6-二甲基吡嗪、异丁酸乙酯、乙酸、苯甲醛、糠醛、丙醛、丙醇和己醇的相对含量可能较低。
樱桃中香气成分十分复杂,经过发酵后带来更为丰富的风味。樱桃酒中风味物质的特征化合物和香气特征见表2,香气类型分析图见图4。由表2和图4可知,樱桃酒中的挥发性物质的香气类型主要为水果香气,包括7种果香(fruity):己酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯和苯甲醛;3种柔和果香(ethereal):乙酸丙酯、乙酸乙酯和2-甲基丙醇;此外,其他物质也带来青草(green)、白兰地(waxy)、发酵(fermented)、烤面包(bready)、草本(herbal)、咖啡(coffee)、酒精(alcoholic)、黄油(buttery)、芳香气味(solvent)、巧克力(chocolate)、酸味(acidic)等香气,这些挥发性成分共同组成了樱桃酒香气的风味和特征。
表2 樱桃酒中风味物质的香气成分及特征
Table 2 Aroma components and characteristics of volatile compounds in cherry wine
图4 樱桃酒香气类型分析图
Fig.4 Analysis diagram of aroma types of cherry wine
构成樱桃酒风味成分的主要成分为酯类和醇类,酯类主要赋予樱桃酒新鲜的水果香气,乙醇和高级醇类赋予了樱桃酒的酒精味道和其他复杂风味。香气特征为水果香的物质除了苯甲醛外,其他全部为酯类。苯甲醛主要来自于樱桃果实中,酯类主要为乙酸酯和脂肪酸乙酯,主要产生于发酵中期,来自醇类和酰基辅酶A的缩合反应[30]。其他挥发性成分作为酿酒酵母的发酵产物,为樱桃酒带来青香、蜡香、咖啡味、巧克力和酸味等其他风味,使酒体的风味构成更为丰富。
以新鲜樱桃发酵生产樱桃酒,通过HS-GC-IMS分析樱桃酒的挥发性风味成分,获得樱桃酒的挥发性物质图谱。樱桃酒中共检出23种挥发性化合物,其中,酯类9种,醇类5种,醛类4种,酮类3种,吡嗪类1种和有机酸1种。结合樱桃酒挥发性物质图谱和软件分析,确定为辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、异丁酸乙酯、丙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯、苯甲醛、糠醛、丙醛、戊醛、己醇、3-甲基丁醇、丁醇、2-甲基丙醇、丙醇、3-羟基-2-丁酮、4-甲基-2-戊酮、丙酮、2,6-二甲基吡嗪和乙酸为樱桃酒中的主要风味物质。其中,仅有苯甲醛和丙醛在樱桃中存在,其他大部分由酿酒酵母在樱桃酒发酵过程中产生。经过樱桃酒的香气特征分析,樱桃酒的香气特征主要为果香和柔和果香,其他物质也带来青香、蜡香、发酵香、烤面包香气、咖啡、酒精、黄油、芳香气味、巧克力、酸味等香气,这些挥发性成分共同组成了樱桃酒的风味和特征。
[1] VAVOURA M V,BADEKA A V,KONTAKOS S,et al.Characterization of four popular sweet cherry cultivars grown in Greece by volatile compound andphysicochemicaldataanalysisandsensoryevaluation[J].Molecules,2015,20(2):1922-1940.
[2]SUN S Y,JIANG W G,ZHAO Y P.Comparison of aromatic and phenolic compounds in cherry wines with different cherry cultivars by HS-SPME-GCMS and HPLC[J].Int J Food Sci Technol,2012,47(1):100-106.
[3]DE SOUZA V R,PEREIRA P A P,DE SILVA T L T,et al.Determination of the bioactive compounds,antioxidant activity and chemical composition of Brazilian blackberry,red raspberry,strawberry,blueberry and sweet cherry fruits[J].Food Chem,2014,156:362-368.
[4] BLANDO F,OOMAH B D.Sweet and sour cherries:origin,distribution,nutritional composition and health benefits[J]. Trend Food Sci Technol,2019,86:517-529.
[5]XIAO Z B,ZHANG N,NIU Y W,et al.Multivariate classification of cherry wines based on headspace solid phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry of volatile compounds[J]. Int J Food Propert,2015,18(6):1272-1287.
[6]孙海燕.樱桃酒的研制[J].食品工业,2016(10):15-18.
[7]FLEET G H.Yeast interactions and wine flavour[J].Int J Food Microbiol,2003,86(1-2):11-22.
[8]ESTEBAN M L G,UBEDA C,HEREDIA F J,et al.Impact of closure type and storage temperature on chemical and sensory composition of Malbec wines(Mendoza,Argentina)during aging in bottle[J].Food Res Int,2019,125:108553.
[9]BENITO S.The impact of Torulaspora delbrueckii yeast in winemaking[J].Appl Microbiol Biotechnol,2018,102(7):3081-3094.
[10]NIU Y W,WANG P P,XIAO Z B,et al.Evaluation of the perceptual interaction among ester aroma compounds in cherry wines by GC-MS,GC-O,odor threshold and sensory analysis:An insight at the molecular level[J].Food Chem,2019,275:143-153.
[11]SUN S Y,GONG H S,LIU W L,et al.Application and validation of autochthonous Lactobacillus plantarum starter cultures for controlled malolactic fermentation and its influence on the aromatic profile of cherry wines[J].Food Microbiol,2016,55:16-24.
[12] LI H M,JIANG D Q,DAI Z G,et al.Aromatic property of cherry wine produced by malolactic fermentation of controlled and spontaneous on the bacterial evolution[J].Int J Food Propert,2019,22(1):1270-1282.
[13] XIAO Q,ZHOU X,XIAO Z,et al.Characterization of the differences in the aroma of cherry wines from different price segments using gas chromatography-mass spectrometry,odor activity values,sensory analysis,and aroma reconstitution[J].Food Sci Biotechnol,2017,26(2):331-338.
[14]SUN S Y,ZHANG Q F,LIU W L,et al.Influence of maceration techniques on the chemical,aromatic,sensory and biogenic amine profiles of cherry wine[J].J I Brewing,2018,124(4):477-484.
[15]姜东琪,张云舒,武晓玮,等.酿酒酵母对樱桃酒挥发性组分及感官品质的影响[J].中国酿造,2019,38(8):94-99.
[16] DANIELE C,SANDRO Z,CHIARA D,et al.Ion mobility spectrometry coupled to gas chromatography:A rapid tool to assess eggs freshness[J].Food Chem,2019,271:691-696.
[17] VAUTZ W,ZIMMERMANN D,HARTMANN M,et al.Ion mobility spectrometry for food quality and safety[J].Food Addit Contamin,2006,23(11):1064-1073.
[18] WITKIEWICZ Z,PERYCZ U,MAZIEJUK M,et al.Coupling gas chromatography with ion mobility spectrometry[J]. LC-GC Europe,2016,29(6):294-303.
[19] CAVANNA D,ZANARDI S,DALLASTA C,et al.Recent progress in food flavor analysis using gas chromatography-ion mobility spectrometry(GC-IMS)[J].Food Chem,2020,315:126158.
[20] ZLATIC E,PICHLER A,LONCARIC A,et al.Volatile compounds of freeze-dried sour cherry puree affected by addition of sugars[J].Int J Food Propert,2017,20:449-456.
[21]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.7—2016 食品安全国家标准食品中还原糖的测定[S].北京:中国标准出版社,2016.
[22]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 5009.225—2016 食品安全国家标准酒中乙醇浓度的测定[S].北京:中国标准出版社,2016.
[23]EBELER S E,THORNGATE J H.Wine chemistry and flavor:looking into the crystal glass[J].J Agr Food Chem,2009,57(18):8098-8108.
[24]POLASKOVA P,EBELER S E,HERSZAGE J.Wine flavor:chemistry in a glass[J].Chem Soc Rev,2008,37(11):2478-2489.
[25]XIAO Z,LIU S,GU Y,et al.Discrimination of cherry wines based on their sensory properties and aromatic fingerprinting using HS-SPME-GC-MS and multivariate analysis[J].J Food Sci,2014,79(3):284-294.
[26]HAZELWOOD L A,DARAN J M,MARIS A J A,et al.The Ehrlich pathway for fusel alcohol production:a century of research on Saccharomyces cerevisiaemetabolism[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(8):2259-2266.
[27]MENDES-FERREIRA A,COELHO E,BARBOSA C,et al.Production of blueberry wine and volatile characterization of young and bottle aging beverages[J].Food Sci Nutr,2019,7(2):617-627.
[28] LIU M M,YANG K,QI Y M,et al.Fermentation temperature and the phenolic and aroma profile of persimmon wine[J].J I Brewing,2018,124(3):269-275.
[29]NIU Y W,ZHANG X M,XIAO Z B,et al.Characterization of odor-active compounds of various cherry wines by gas chromatography-mass spectrometry,gas chromatography-olfactometry and their correlation with sensory attributes[J].J Chromatogr B,2011,879(23):2287-2293.
[30]郝瑞颖,王肇悦,张博润,等.葡萄酒中酿酒酵母产生的重要香气化合物及其代谢调控[J].中国食品学报,2012,12(11):121-127.
Analysis of the volatile flavor compounds in cherry wine by HS-GC-IMS