益生乳酸菌是对人体健康有益的活性微生物，能够调节肠道菌群，合成多种维生素（如维生素B1、维生素B2、维生素B6、叶酸、烟酸、维生素B12等）供人体所需，促进机体对蛋白质的消化与吸收，促进机体对钙、铁、维生素D的吸收等[1]。双歧杆菌（Bifidobacterium）是由法国巴斯德研究院的TISSIER于1899年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离出来的专性厌氧菌，是健康动物肠道内的优势菌种，其数量随年龄而变化，且与机体内许多生理病理变化关系密切[2]。双歧杆菌被认为是人类和其他温血动物肠道中的关键微生物属[3-4]。动物双歧杆菌乳亚种即乳双歧杆菌[5-7]，是肠道中最典型的有益菌，具有促进肠道健康[8-9]、提高免疫力[10-12]、抑制有害菌生长[13]、预防肠道有关疾病[14]等多种生理功能，可以作为发酵剂或原料应用于食品领域，如微生态制剂、双歧杆菌果汁饮料、乳制品、保健食品及其他益生菌产品中。
动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）HCS04-002具有优良的耐逆环境能力及缓解乳糖不耐受、降甘油三酯等益生特性，但具有较好的存活能力和较高的活菌数是益生菌发挥作用的基础，适合的培养条件是其实现高活菌数培养的关键。培养基作为菌体所处的直接环境，不但为菌体生长提供所需的营养物质，同时还会参与到菌体细胞内的多种代谢过程，因此培养基成分必须具有细胞膜通透性，同时可以为细胞生长提供能量，并提供碳源、氮源、无机盐、生长因素和水等基础生长元素[15]。陈夷平[16]通过对罗伊氏乳杆菌IMAU10281的培养条件进行优化后，获得了108 CFU/mL的菌体密度，是优化前的6.81倍。陈百莹等[17]对植物乳杆菌ZJ316的发酵条件进行了优化，菌体密度达到了9.28×109 CFU/mL。
本研究以动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）HCS04-002为研究对象，以菌泥收率为考察指标，通过单因素及正交试验优化其发酵工艺；以活菌数为响应值，通过单因素试验及Box-Behnken试验设计优化其培养基组成，为实现其冻干菌粉的产业化生产及其在益生菌发酵产品中的应用提供研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌种
动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）HCS04-002：筛选自2月龄健康顺产男婴粪便，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19509。
1.1.2 化学试剂
FP103酵母蛋白胨、FM902酵母浸出物：安琪酵母股份有限公司；无水葡萄糖：食药集团圣雪葡萄糖有限责任公司；无水乙酸钠、磷酸二氢钾、一水硫酸锰、七水硫酸镁：江苏科伦多食品配料有限公司；吐温80：江苏四新界面剂科技有限公司；Hilmar5000乳糖：天津银河伟业进出口有限公司。试验所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
MRS改良培养基：酵母蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉10.0g/L，酵母浸出物10.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，K2HPO4 2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，MnSO4·7H2O 0.05 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH值6.2。121 ℃高压灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
SW-CJ-2D双人单面净化工作台：苏州净化设备有限公司；DHP-360/420电热恒温培养箱：北京市永光明医疗仪器厂；721型可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；XSP-10CA生物显微镜：上海佑科仪器仪表有限公司；DZKWS-8电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；TGL-16M低温高速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；LAI-3DT厌氧工作站：上海龙跃仪器设备有限公司。
1.3 方法
1.3.1 菌种保存
挑取动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）HCS04-002单菌落，接种于5 mL MRS改良培养基中，39 ℃静置培养16 h后，以5%（V/V）接种量转接于200 mL MRS改良培养基中，39 ℃静置培养16 h，将200 mL菌悬液离心（12 000 r/min、10 min）后取菌泥，加入8 mL MRS改良培养基和12 mL 50%甘油，分装于冻存管中（1 mL/支），-80 ℃冷冻保存。
1.3.2 菌种种子液制备
将动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）HCS04-002菌种冻存管放入37 ℃水浴锅内进行菌种复苏15～30 s，将冻存管内菌种1 mL接种至10 mL MRS改良培养基，静置培养17 h，获得种子液。
1.3.3 菌种发酵工艺优化
（1）单因素试验
培养温度、发酵液初始pH值和接种量是影响乳酸菌高活菌数培养的重要因素[18-20]，因此试验选择这3个因素对菌株HCS04-002的发酵工艺优化。取种子液以一定的接种量转接到80 mL MRS改良培养基中，一定温度下静置培养17 h后，测定发酵液的pH和菌泥收率，分别单独考察发酵温度（33 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃、41 ℃）、接种量（1%、2%、3%、4%、5%）和初始pH值（6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）对菌泥收率的影响，其计算公式如下：
（2）正交试验
在单因素试验结果基础上，以发酵温度、初始pH值和接种量为影响因素，以发酵液菌泥收率为评价指标，采用3因素3水平正交试验设计L9（33）进行正交试验，正交试验设计因素与水平见表1。
表1 发酵工艺优化正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation technology optimization
1.3.4 发酵培养基组分优化
（1）单因素试验
将冷冻菌种复苏后，接种至MRS改良培养基中经过活化后转接到300 mL发酵培养基中进行发酵培养。发酵培养基中固定成分添加量为低聚果糖5 g/L，L-苹果酸5 g/L，柠檬酸2 g/L，氯化钙0.5 g/L，七水合硫酸镁0.5 g/L，乙酸钠5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，考察不同添加量的酵母蛋白胨（0、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L）、酵母浸出物（10 g/L、20 g/L、30g/L、40g/L、50g/L）、葡萄糖（0、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L）、乳糖（0、5 g/L、10 g/L、15 g/L、20 g/L）对菌株发酵液活菌数的影响。按照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中的方法进行菌落计数。
（2）响应面试验
在单因素试验的基础上，依据Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken试验设计原理，选择酵母蛋白胨（A）、酵母浸出物（B）、葡萄糖（C）、乳糖（D）添加量为考察因素，以菌悬液活菌数（Y）为响应值，进行4因素3水平的试验设计，以确定发酵培养基的最佳组合，Box-Behnken试验设计因素与水平见表2。
表2 发酵培养基优化Box-Behnken试验因素与水平
Table 2 Factors and levels of Box-Behnken tests for fermentation medium optimization
1.3.5 统计分析
所有试验均重复3次，结果以“平均值±标准偏差”表示。通过Design-Expert 8.0.6软件对回归模型进行方差分析和可靠性分析。
2 结果与分析
2.1 发酵工艺优化
2.1.1 单因素试验
发酵温度、接种量及初始pH值对菌悬液菌泥收率的影响见图1。由图1a可知，当发酵温度在33～39 ℃时，随着温度的升高菌泥收率逐渐升高；当发酵温度为39 ℃时，菌泥收率达到最高，为0.847%；当发酵温度高于39 ℃之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳发酵温度为39 ℃。由图1b可知，当接种量在1%～3%时，菌泥收率随之逐渐升高；当接种量为3%时，菌泥收率达到最高，为0.820%；当接种量＞3%之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳接种量为3%。由图1c可知，当初始pH值在6.8～7.2时，菌泥收率随之逐渐升高；当初始pH值为7.2时，菌泥收率达到最高，为0.828%；当初始pH值＞7.2之后，菌泥收率迅速下降。因此，最佳初始pH值为7.2。
图1 发酵温度（a），接种量（b）及初始pH值（c）对发酵液菌泥收率的影响
Fig.1 Effect of fermentation temperature (a),inoculum (b) and initial pH value (c) on bacterial sludge yield of fermentation broth
2.1.2 正交试验
在单因素试验的基础上，以发酵温度（A）、接种量（B）、初始pH值（C）为自变量，以菌泥收率为考察指标，进行3因素3水平正交试验设计，正交试验结果与分析见表3。
表3 发酵工艺优化正交试验结果与分析
Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation technology optimization
由表3可知，根据R值可知，影响菌泥收率的因素顺序为A＞C＞B，即发酵温度＞初始pH值＞接种量。由k值可知，最优发酵工艺组合为A3B2C2，即发酵温度39 ℃，接种量3%，初始pH值7.2。按此培养条件对动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002进行发酵培养，重复试验3次，菌泥收率平均值达1.07%。
2.2 发酵培养基优化
2.2.1 单因素试验
考察酵母蛋白胨、酵母浸出物、葡萄糖、乳糖添加量4个因素对活菌数的影响，考察其中1个因素时其他3个因素的水平固定为水平中间值，试验结果见图2。由图2可知，酵母蛋白胨、酵母浸出物、葡萄糖、乳糖4个因素对活菌数的影响均呈现先上升后下降的趋势。当酵母蛋白胨添加量为20 g/L时发酵液活菌数最高，为2.0×109 CFU/mL；当酵母蛋白胨添加量＞20 g/L，发酵液活菌数下降。因此，最佳酵母蛋白胨添加量为20 g/L。当酵母浸出物添加量为20 g/L时，发酵液活菌数达到最高，为2.1×109 CFU/mL；随着酵母浸出物添加量的继续增加，发酵液活菌数下降。因此，最佳酵母浸出物添加量为20 g/L。当葡萄糖添加量为10 g/L时，发酵液活菌数达到最高，为2.2×109 CFU/mL。因此，最佳葡萄糖添加量为10 g/L。乳糖添加量＜10 g/L时，活菌数随乳糖添加量的增加而升高；当乳糖添加10 g/L时活菌数最高，为2.2×109 CFU/mL；当乳糖添加量＞10 g/L时，发酵液活菌数反而下降。因此，最佳乳糖添加量为10 g/L。
图2 发酵培养基优化单因素试验结果
Fig.2 Results of single factor tests for fermentation medium optimization
2.2.2 响应面试验
以单因素试验结果为基础，依据Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken试验设计原理，选择酵母蛋白胨（A）、酵母浸出物（B）、葡萄糖（C）、乳糖（D）添加量为考察因素，以菌悬液活菌数（Y）为响应值，进行4因素3水平的试验设计，Box-Behnken试验设计及结果见表4，方差分析见表5。
表4 发酵培养基优化Box-Behnken试验设计与结果
Table 4 Design and results of Box-Behnken tests for fermentation medium optimization
续表
表5 回归模型方差分析
Table 5 Variance analysis of regression model
注：“*”表示对结果影响显著（P＜0.05）；“**”表示对结果影响极显著（P＜0.01）。
应用Design-Expert 8.0.6软件对表4试验结果进行分析，得到二次多项回归方程Y=2.68+0.25A-0.042B-0.067C+0.075D+0.100AB+0.000AC+0.20AD+0.28BC+0.050BD-0.075 CD-0.33A2-0.24B2-0.56C2-0.59D2
由表5可知，回归模型极显著（P＜0.01），说明该模型对动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002发酵培养的活菌数的分析和预测较精准，失拟项（P=0.593 4＞0.05），无显著性差异。模型决定系数R2=0.788 5，校正决定系数R2Adj=0.577 0，说明该模型方程拟合度良好，可以较好的反应各因素之间的关系[21]。各因素的F值可评价该因素对响应值的影响，F值越大，表明该因素的影响越显著[22-23]。因此，对活菌数的影响顺序依次是酵母蛋白胨＞乳糖＞葡萄糖＞酵母浸出物。一次项A、二次项A2对活菌数有显著影响（P＜0.05），二次项C2和D2对活菌数有极显著影响（P＜0.01）。
响应面曲面的坡度反映该因素对活菌数影响的强弱程度[24，25]，等高线椭圆形表明变量间交互作用显著，圆形则表明变量间交互作用不显著[26]。各因素交互作用对结果影响的响应面及等高线结果见图3。由图3可知，相应曲面图形的开口均向下，说明响应面范围覆盖了最大值所在的区域。等高线图均呈规则的椭圆形，四个因素两两之间交互作用均显著。
图3 各因素交互作用对动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002活菌数的影响的响应面及等高线
Fig.3 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of various factors on the viable bacterial count of Bifidobacterium animalis subsp. lactis HCS04-002
模型预测最佳发酵培养基为：酵母蛋白胨24.13 g/L、酵母浸出物29.70 g/L、葡萄糖19.23 g/L、乳糖10.68 g/L，在此条件下，活菌数理论值为2.74×109 CFU/mL。为了方便实际操作，将最佳发酵培养基配方修正为：酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此条件下进行5次平行验证试验，活菌数实际值为2.73×109 CFU/mL，与理论值接近，说明该模型能准确反映各因素添加量的变化与活菌数之间的关系，该模型具有可靠性。
3 结论
本研究对动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp.lactis）HCS04-002发酵条件进行优化，首先以菌泥收率为评价指标，通过单因素试验和正交试验优化动物双歧杆菌乳亚种HCS04-002发酵工艺为：培养温度39 ℃，接种量3%，初始pH值7.2。通过单因素试验和响应面优化发酵培养基为酵母蛋白胨24 g/L、酵母浸出物30 g/L、葡萄糖19 g/L、乳糖11 g/L。在此优化条件下，发酵液的活菌数达2.73×109 CFU/mL，是MRS改良培养基及37 ℃培养活菌数（8.82×108 CFU/mL）的3.10倍，达到增菌培养的目的。
[1] 赵龙玉.益生乳酸菌的筛选及其在食品加工上的应用研究[D].泰安：山东农业大学，2015.
[2]吕锡斌，何腊平，张汝骄，等.双歧杆菌生理功能研究进展[J].食品工业科技，2013，34（16）：353-358.
[3]REUTER G.The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine:Composition and succession[J].Curr Issues Intest Microbiol,2001,2(2):43-53.
[4] RADA V,VLKOVÁ E,NEVORAL J,et al.Comparison of bacterial flora and enzymatic activity in faeces of infants and calves[J].FEMS Microbiol Lett,2006,258(1):25-28.
[5] VENTURA M,ZINK R.Rapid identification,differentiation,and proposed new taxonomic classification of Bifidobacterium lactis[J].Appl Environ Microbiol,2002,12(68):6429-6434.
[6]ZHU L,LI W,DONG X Z.Species identification of genus Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences and proposal of Bifidobacterium thermacidophilum subsp.porcinum subsp.nov[J].Int J Syst Evol Microbiol,2003,53(5):1619-1623.
[7]MASC L,VENTURA M,ZINK R,et al.Polyphasic taxonomic analysis of Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium lactis reveals relatedness at the subspecies level:reclassification of Bifidobacterium animalis as Bifidobacterium animalis subsp.nov.and Bifidobacterium lactis as Bifidobacterium animalis subsp.lactis subsp.nov[J].Int J Syst Evol Microbiol,2004,54(4):1137-1143.
[8] BARBOSA I C,OLIVEIRA M E G,MADRUGA M S,et al.Influence of the addition of Lactobacillus acidophilus La-05, Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 and inulin on the technological,physicochemical,microbiological and sensory features of creamy goat cheese[J].Food Funct,2016,7(10):4356-4371.
[9] MATIJAŠIC′ B B,OBERMAJER T,LIPOGLAVŠEK L,et al.Effects of synbiotic fermented milk containing Lactobacillus acidophilus La-5 and Bifidobacterium animalis ssp.lactis BB-12 on the fecal microbiota of adults with irritable bowel syndrome:a randomized double-blind,placebo-controlled trial[J].J Dairy Sci,2016,99(7):5008-5021.
[10]SCHIFFRIN E J,ROCHAT F,LINK-AMSTER H,et al.Immunomodulation of human blood cells following the ingestion of lactic acid bacteria[J].J Dairy Sci,1995,78(3):491-497.
[11] PACHECO-ORDAZ R,WALL-MEDRANO A,GONI M G,et al.Effect of phenolic compounds on the growth of selected probiotic and pathogenic bacteria[J].Lett Appl Microbiol,2018,66(1):25-31.
[12]GARRIGUES C,STUER-LAURIDSEN B,JOHANSEN E.Characterisation of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-12 and other probiotic bacteria using genomics,transcriptomics and proteomics[J].Aust J Dairy Technol,2005,60(2):84-92.
[13] SIEBER R,DIETZ U T. Lactobacillus acidophilus and yogurt in the prevention and therapy of bacterial vaginosis[J].Int Dairy J,1998,8(7):599-607.
[14]LV C H,WANG T,REGMI N,et al.Effects of dietary supplementation of selenium-enriched probiotics on production performance and intestinal microbiota of weanling piglets raised under high ambient temperature[J].J Anim Physiol Anim Nutr(Berl),2015,99(6):1161-1171.
[15]杨加怀.植物乳杆菌299 高密度培养基冷冻干燥保护的研究[D].天津：天津科技大学，2015.
[16]陈夷平.罗伊氏乳杆菌IMAU10281 生长培养基的优化[D].呼和浩特：内蒙古农业大学，2015.
[17]陈百莹，郑苗，邓泽元，等.植物乳杆菌ZJ316 培养基优化和高密度培养的研究[J].中国食品学报，2020，20（7）：65-74.
[18]赵宏飞.乳糖对瑞士乳杆菌生长代谢影响及高密度培养研究[D].北京：北京林业大学，2014.
[19]王英，周剑忠，卢俭，等.微囊化乳酸菌高密度培养及释放特性的研究[J].江苏农业学报，2011，27（3）：658-662.
[20]CÁRCAMO M B,SAA P,GARCÍAS J T,et al.Effective dissolved oxygen control strategy for high-cell-density cultures[J]. IEEE Lat Am T,2014,12(3):389-394.
[21]陈铭中，刘志芳，吴海珍，等.响应面法优化发酵青梅酒澄清工艺[J].中国酿造，2019，38（3）：84-87.
[22]洪晶，陈涛涛，唐梦茹，等.响应面法优化韭菜籽蛋白质提取工艺[J].中国食品学报，2013，13（12）：89-95.
[23]徐璐，汪涛，郭巧生，等.响应面法优化超声辅助法提取昆仑雪菊色素的工艺研究[J].中国中药杂志，2014，39（24）：4792-4797.
[24]岳喜庆，鲍宏宇，于娜，等.响应面法优化卵黄蛋白质提取工艺[J].食品研究与开发，2011，32（4）：48-52.
[25]李婷婷，陈雪，程涛，等.基于响应面法优化酿酒酵母培养体系[J].中国酿造，2020，39（11）：126-131.
[26] RODRÍGUEZ-GONZÁLEZ V M,FEMENIA A,MINJARES-FUENTES R,et al.Functional properties of pasteurized samples of Aloe barbadensis Miller:Optimization using response surface methodology[J]. LWT-Food Sci Technol,2012,47(2):225-232.