甘露聚糖是自然界中半纤维素的第二大组分[1]，普遍存在于植物性食品及动物饲料中，它是一种抗营养因子，在家禽和猪等单胃动物体内会形成凝胶，使消化道内容物有很大的黏性，从而影响营养物质的消化吸收[2-3]。β-1,4-D-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannanase）是一类水解甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖以及半乳葡萄甘露聚糖中β-1,4-D-吡喃甘露糖苷键的内切酶[4-6]，广泛存在于动植物和微生物中。β-甘露聚糖酶用于饲料工业，不仅可以消除饲料中的抗营养因子甘露聚糖，其水解产物甘露低聚糖还可以改善饲料营养、提高饲料利用率、促进畜禽生长[7]，同时还能促进双歧杆菌和乳酸杆菌等有益菌的增殖，抑制病原菌生长，改善肠道微生态环境，显著提高动物免疫功能，减少饲料中抗生素等化学药物的使用，从而减少养殖污染[8]。β-甘露聚糖酶在自然界中普遍存在，微生物是其最主要的生产来源。虽然目前国内外已有很多通过分子技术手段，使β-甘露聚糖酶异源表达水平大大提高的报道[9-10]，但现有的微生物β-甘露聚糖酶因生物安全性问题，限制了其在饲料生产领域的应用[11]，因此筛选更为安全的生产菌株，增加野生β-甘露聚糖酶生产菌的种质资源至关重要。
本试验通过刚果红平板初筛和液体发酵复筛的方法，从不同地区的魔芋生产基地土壤中，筛选分离β-甘露聚糖酶高产菌株；通过形态学察、生理生化试验及分子生物学的方法对所筛选的菌株进行鉴定，并对其所产β-甘露聚糖酶的酶学性质进行了研究，以期为β-甘露聚糖酶在饲料工业中的广泛应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 材料
土壤样品：采自河南省南阳西峡县、河南省南阳西峡县后塘沟村、云南省昆明市盘龙区新发村、福建省南平市政和县天井洋村等地的魔芋生产基地。
1.1.2 主要试剂
胰蛋白胨、酵母膏、琼脂粉、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、魔芋粉：北京索莱宝生物科技有限公司；甘露糖：麦克林生物技术有限公司；甘露聚糖：美国Sigma公司；琼脂糖：北京鼑国生物技术有限责任公司；API 50CHB、ZYM鉴定试剂盒：物梅里埃中国有限公司；DNA Marker、2×Es Taq脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶：北京康为世纪生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）：北京酷来搏科技有限公司；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒：美国Omega Bio-Tec公司；细菌16SrDNA通用引物27F和1492R：深圳华大基因科技有限公司。试验所用试剂均为分析纯或生化试剂。
1.1.3 培养基
富集培养基：魔芋精粉5 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母膏1 g/L，NaCl 0.05 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。121 ℃灭菌15 min。
初筛分离培养基：魔芋精粉3 g/L，蛋白胨6 g/L，酵母膏1 g/L，K2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.25 g/L，刚果红0.5 g/L，琼脂15 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0。121 ℃灭菌15min。
发酵培养基：魔芋精粉15g/L，蛋白胨8g/L，酵母膏4g/L，K2HPO4 1 g/L，MgSO4 0.25 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.2。121 ℃灭菌15 min。
种子培养基采用LB培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 5 g/L，蒸馏水1 000 mL，pH 值7.0。121 ℃灭菌15 min。
1.2 仪器与设备
K-8D电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；QYCAxioImageM2全自动荧光显微镜：德国Zeiss公司；Thermoblock梯度电泳仪：德国Biometra公司；TCYQ全温摇瓶柜：太仓市豪成实验仪器制造有限公司；Varioskan Flash全波长扫描式多功能读数仪：美国Thermo公司；DChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统：美国Bio-Rad公司；DYY-6C电泳仪：北京六一生物科技有限公司；Biometra TGRADIENT聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪：德国Waterman公司。
1.3 方法
1.3.1 高产β-甘露聚糖酶菌株的筛选
取10 g土壤样品于装液量为100 mL/250 mL富集培养基中，在30 ℃、180 r/min条件下摇床培养24 h，将富集培养液用无菌水梯度稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5后，取100 μL涂布于初筛分离培养基上，置于30 ℃培养箱倒置培养48 h后，记录透明圈直径（D）与菌落直径（d）之比（D/d），作为产β-甘露聚糖酶菌株能力的初筛标准。选用D/d值较大即产酶能力较强的菌株，接入种子培养基，30 ℃、180 r/min摇床培养18 h后，按3%（V/V）的接种量转接到发酵培养基中，相同条件摇床培养24 h，在4 ℃、10 000 r/min条件下离心10 min，上清液即粗酶液，测定β-甘露聚糖酶酶活，复筛菌株。
1.3.2 分析检测
β-甘露聚糖酶的酶活测定按照国标GB/T 36861—2018《饲料添加剂β-甘露聚糖酶活力的测定分光光度法》[13]。β-甘露聚糖酶酶活定义：在37 ℃、pH值为5.5条件下，每分钟从质量浓度为3 mg/mL甘露聚糖溶液中释放1 μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。
1.3.3 高产β-甘露聚糖酶菌株的鉴定
形态学观察：对筛选分离纯化的菌株进行菌落和细胞形态观察，并进行革兰氏染色[12]。
生理生化鉴定：通过API 50CHB和ZYM鉴定试剂盒，对所筛选的菌株进行生理生化鉴定。
分子生物学鉴定：将菌株接种于LB液体培养基上，在30 ℃、180 r/min条件下摇床培养过夜，采用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取筛选菌株的基因组DNA，以其为模板，采用16S rDNA通用引物27F和1492R扩增目标菌株的16S rDNA序列。PCR反应体系（30 μL）为：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）1 μL，2×Es Taq酶15 μL，引物27F和1492R（20 μmol/L）各1 μL，无菌双蒸水12 μL，混匀。PCR扩增程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，52 ℃复性40 s，72 ℃延伸90 s，25个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃终止反应。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至华大基因公司进行测序。将所得序列结果提交至美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的GenBank基因库中进行基本局部比对工具（basic local alignment search tool，BLAST）检索，选取同源性较高的已知菌种的16S rDNA序列，采用MEGA 7.0软件中的邻接（neighbor-joining，NJ）法构建系统发育树。
1.3.4 β-甘露聚糖酶酶学性质分析
参考张建新等[14]的双水相萃取法，在16%（NH4）2SO4、18%PEG2000和2%NaCl的双水相体系条件下，对粗酶液进行纯化，纯化后的酶液用于酶学性质分析。
最适反应pH值：采用不同缓冲体系配成一系列浓度0.1 mol/L的缓冲液，缓冲体系和pH值范围分别为：甘氨酸-HCl缓冲液（pH 3.0）、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 4.0、pH 5.0）、磷酸钠缓冲液（pH 6.0、pH 7.0、pH 8.0）、甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 9.0、pH 10.0）。底物分别用上述不同pH值的缓冲液配制后，在pH 3.0～10.0反应体系下，37 ℃条件下保温30 min，测定β-甘露聚糖酶活力。
pH值稳定性：将酶液与不同pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）缓冲液混合，37 ℃保温2 h后，测定β-甘露聚糖酶活力，计算相对酶活。
最适温度：在pH5.5、0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液体系中，在不同温度（30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）条件下反应30 min，测定β-甘露聚糖酶活力。
温度稳定性：酶液在pH 5.5 0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液体系中，不同温度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃）条件下，保温30 min，立即冰水浴冷却，用未经温度处理的酶液作对照，测定β-甘露聚糖酶活力，计算相对酶活。
金属离子和乙二胺四乙酸（EDTA）对酶活力的影响：在酶反应体系中，分别加入金属离子（Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Li+、Ca2+、Co2+）和EDTA溶液（使终浓度为2.5 mmol/L），以未加金属离子和螯合剂为对照，测定β-甘露聚糖酶活力。
2 结果与分析
2.1 β-甘露聚糖酶高产菌株的筛选鉴定
2.1.1 β-甘露聚糖酶高产菌株的分离筛选
通过平板初筛的方法，从不同地区魔芋生产基地的土壤中，共分离筛选得到32株在初筛平板上D/d值较大的菌株，其中6株有代表性的菌株在初筛平板上形成的透明圈见图1。32株菌经液体发酵24 h复筛后，上清液酶活见表1。由表1可知，分自河南省南阳西峡县后塘沟村土壤样品的菌株HTGC-10经液体发酵24 h后，发酵液中β-甘露聚糖酶活力最高，可以达到61.75 U/mL，其产酶能力显著高于现有报道的多数野生菌株[15-17]，且经反复发酵后产酶能力稳定。因此，进一步对菌株HTGC-10进行鉴定。
图1 6株代表性菌株在初筛平板上形成的透明圈
Fig.1 Transparent circles formed by 6 representative strains on the primary screening plate
菌株HTGC-10、XFC-21、HTGC-1、XXX3-2、TJYC-6和XFC-13的D/d值分别为4.56、4.50、5.16、3.20、3.92和1.15。
表1 32株分离菌株的β-甘露聚糖酶活力
Table 1 β-mannanase activity of 32 isolated strains
2.1.2 高产β-甘露聚糖酶菌株的鉴定
菌株HTGC-10的菌落及细胞形态见图2。由图2A可知，菌落呈圆形，无色半透明，表面光滑湿润，边缘整齐，将菌落挑起后有明显拉丝现象。由图2B可知，经革兰氏染色结果发现，菌株HTGC-10产椭圆形芽孢，芽孢呈蓝紫色，因此鉴定其为革兰氏阳性菌。
图2 菌株HTGC-10的菌落（A）及细胞（B）形态
Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphology of strain HTGC-10
菌株HTGC-10的接触酶反应（contact enzyme reaction，ZYM）和可利用碳源（API 50CHB）试验结果分别见表2、表3。
表2 菌株HTGC-10的接触酶反应结果
Table 2 Contact enzyme reaction results of strain HTGC-10
注：“+”表示结果呈阳性或生长；“-”表示结果呈阴性或不生长。下同。
表3 菌株HTGC-10的碳源利用能力
Table 3 Carbon source utilization capacity of strain HTGC-10
菌株HTGC-10的16S rDNA PCR扩增产物电泳结果见图3。由图3可知，菌株HTGC-10在1 500 bp附近有明显条带，经过测序，菌株HTGC-10的16S rDNA序列长度为1 493 bp。
图3 菌株HTGC-10的16S rDNA聚合酶链式反应扩增产物电泳结果
Fig.3 Electrophoresis results of 16S rDNA polymerase chain reaction amplification products of strain HTGC-10
M为DNA Marker。
菌株HTGC-10的系统发育树见图4。由图4可知，菌株HTGC-10与Bacillus amyloliquefaciens的相似度最高，结合菌株HTGC-10的菌落形态特征、生理生化试验结果和16SrDNA分析，该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。
图4 基于16S rDNA序列菌株HTGC-10的系统发育树
Fig.4 Phylogenetic tree of strain HTGC-10 based on 16S rDNA sequence
2.2 菌株HTGC-10产β-甘露聚糖酶的酶学性质
2.2.1 pH值对酶活力的影响
pH值对甘露聚糖酶活力的影响见图5。由图5可知，在pH3.0～6.0时，随着pH值的升高，酶活力迅速升高，并在pH值为6.0时其酶活达到最高，为54.94 U/mL；而在pH 6.0～10.0时，酶活力随着pH值的升高则逐渐下降，在pH10.0时的酶活力仅为pH 6.0时的2.7%，说明该酶适合在弱酸性的条件下发挥作用。因此，菌株HTGC-10产β-甘露聚糖酶的最适反应pH值为6.0，偏酸性，这与已报道[18-20]的芽孢菌产生的β-甘露聚糖酶的酶学性质相似。
图5 反应pH值对β-甘露聚糖酶活力的影响
Fig.5 Effect of reaction pH value on β-mannanase activity
2.2.2 温度对酶活力的影响
不同反应温度对β-甘露聚糖酶活力的影响结果见图6。由图6可知，当反应温度在30～55 ℃时，随温度的升高，酶活力逐渐升高，并在温度55 ℃时β-甘露聚糖酶达到最高，为84.97 U/mL；而当反应温度＞55 ℃之后，酶活力随温度的升高迅速下降，70 ℃时的酶活力仅为55 ℃的15.1%。因此，菌株HTGC-10产β-甘露聚糖酶的最适反应温度为55 ℃，这与黄俊丽等[11]筛选的假单胞菌产生的酶的最适反应温度相似。
图6 反应温度对β-甘露聚糖酶活力的影响
Fig.6 Effect of reaction temperature on β-mannanase activity
2.2.3 β-甘露聚糖酶的pH稳定性
将酶液与不同pH缓冲液混合，37 ℃保温2 h后，剩余β-甘露聚糖酶活性见图7。由图7可知，在pH 3.0、5.0～9.0保温后，剩余相对酶活力均在60%以上，表明酶在该pH范围内时，活性相对稳定，但当pH值等于4.0或大于9.0 时，酶活力迅速下降，相对酶活力均在5%以下，说明该酶偏碱性条件耐受性较差；这里比较特殊的是，在pH4.0保温2 h后，出现了大量沉淀，酶活力只有最高活力的3.9%，这可能与酶的等电点有关，该观点需要进一步试验证明。
图7 pH值对β-甘露聚糖酶稳定性的影响
Fig.7 Effect of pH value on β-mannanase stability
2.2.4 β-甘露聚糖酶的热稳定性
温度对酶稳定性的影响见图8。由图8可知，该酶在40 ℃相对稳定，保温30 min后剩余酶活力为原酶活力的82.1%，但随着温度的升高，酶活力迅速下降，在45 ℃条件下保温30 min后，活力为原酶活力的24.3%，后随着温度的升高，酶活力继续下降，在温度达到55 ℃以上保温30 min后，β-甘露聚糖酶几乎已经完全失活。由此可知，本试验筛选菌株HTGC-10产β-甘露聚糖酶的热稳定性相对较差。
图8 温度对β-甘露聚糖酶稳定性的影响
Fig.8 Effect of temperature on the β-mannanase stability
2.2.5 金属离子和EDTA对酶活力的影响
金属离子和EDTA对酶活性的影响见图9。由图9可知，EDTA对酶活有显著的抑制作用，与对照组相比，酶活力下降了24.3%；金属离子Li+和Co2+对酶活力基本没有影响；其余金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著，加入Cu2+后，酶活力仅为对照组酶活力的11.9%，这与张建新等[14]报道的Cu2+对枯草芽孢杆菌YZ-21产生的β-甘露聚糖酶活性有显著抑制作用相似。
图9 乙二胺四乙酸和金属离子对β-甘露聚糖酶活力的影响
Fig.9 Effect of ethylene diamine tetraacetic acid and mental ions on β-mannanase activity
3 结论
本试验经过平板初筛和液体发酵复筛的方法，从不同地区的魔芋生产基地采集的土壤样品中，筛选出一株高产β-甘露聚糖酶活性菌株HTGC-10，该菌株液体发酵24 h后，β-甘露聚糖酶活力可以达到61.75 U/mL；经过形态学观察、ZYM和API 50CHB生理生化试验及16S rDNA序列分析，鉴定菌株HTGC-10为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。菌株HTGC-10所产β-甘露聚糖酶的最适反应pH值为6.0，具有较强的pH值耐受能力，最适反应温度为55 ℃，热稳定性相对较差；EDTA和金属离子Na+、K+、Mn2+、NH4+、Mg2+、Fe2+、Cu2+、Ca2+对酶活力均有不同程度的抑制作用，其中Cu2+对酶活力的抑制作用最显著。菌株HTGC-10具有较好的产β-甘露聚糖酶能力，有一定的开发利用价值。
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