L-乳酸是一种重要的有机酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。作为可生物降解的新材料——聚乳酸（polylactic acid，PLA）的主要原料，L-乳酸已经成为目前最重要的有机酸之一[1-2]。由于其居高不下的生产成本，难以在价格上与传统的塑料相竞争[3-4]。
我国是农产品种植大国，每年产生的农作物秸秆还有其他农作物废弃物较多[5]。数量巨大的小麦秸秆尚未进行大规模有效的利用与开发，多采用焚烧处理造成环境污染，利用这些廉价的小麦秸秆可以代替粮食生产乳酸[6-7]。木质纤维素经过各种处理后，其水解液包含大量的葡萄糖和木糖[8-11]。因碳代谢阻遏效应（carbon catabolite repression，CRR）[12-13]，即葡萄糖的存在会抑制其他糖的代谢，致使大肠杆菌（Escherichia coli）优先利用葡萄糖，葡萄糖耗尽后才可利用其他糖类[14-15]，绝大多数的微生物无法利用水解液中的木糖。
为解除在利用木糖时存在的碳代谢阻遏效应，有研究表明，可以通过基因工程技术对微生物进行改造[16]，该阻遏效应与磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶（phosphoenolpyruvate-sugarphos photransferase，PTS）系统密切相关[17]。PTS系统主要负责特异性地转运葡萄糖，同时将葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，进入糖酵解过程[18]。有研究报道，敲除PTS系统中的葡萄糖转运酶基因ptsG来降低碳代谢阻遏效应，进而提高木糖的利用程度，提高糖酸转化效率；半乳糖的相关转运系统也可以转运葡萄糖，通过敲除半乳糖转运基因mglB，也可降低碳代谢阻遏效应，使重组大肠杆菌能够同时利用葡萄糖和木糖[19]，如丁小云等[20]构建的葡萄糖转运酶基因ptsG缺失乳酸工程菌可同时利用葡萄糖和木糖发酵产D-乳酸，产量为83.04 g/L；江吉雄[21]通过敲除半乳糖转运基因mglB，降低了混合糖发酵D-乳酸中的葡萄糖效应，使发酵周期缩短了约40%，转化率提高了2.3%；许琼丹等[18]通过敲除mglB基因，降低了混合糖发酵乙醇中的葡萄糖效应，使发酵周期缩短了约36%，转化率提高了5.8%。
本研究以可高效利用葡萄糖产L-乳酸的大肠杆菌（E.coli）JH16为出发菌株，通过Red同源重组技术构建ptsG/mglB双基因缺陷菌株JH2705，以减弱葡萄糖效应，提高混合糖中木糖的利用率，为基于木质纤维素等可再生原料高效生产L-乳酸提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 菌株与质粒
本研究所用的菌株和质粒见表1。
表1 本研究所用的菌株和质粒
Table 1 Stains and plasmids used in this study
1.1.2 试剂
CaCl2·2H2O、L-阿拉伯糖（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；DL5 000脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）Marker、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix：美国Fermentas公司；10×TE溶液、氨苄青霉素、卡那霉素（纯度均为99%）：法国Mersco公司；PCR引物：上海生工生物工程技术服务有限公司。
1.1.3 培养基
LB液体培养基[16]：1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉，0.5%NaCl。LB固体培养基在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂粉。
抗性筛选培养基[16]：LB固体培养基中添加50 μg/mL氨苄青霉素或卡那霉素。
种子培养基[16]：LB液体培养基中加入20 g/L葡萄糖或木糖。
发酵培养基[16]：LB液体培养基加入56 g/L葡萄糖和24 g/L木糖。
上述培养基均在121 ℃条件下灭菌20 min。
1.2 仪器与设备
MicroPluser电转仪、My Cycler PCR仪：美国Bio-Red公司；Waters e2695型高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪：美国Waters公司；Sartorius BB-8846880发酵罐：德国Sartorius Stedim Biotech公司。
1.3 方法
1.3.1 PCR引物设计
根据ptsG和mglB基因序列设计敲除引物分别为△ptsGP1、△ptsG-P2、△mglB-P1、△mglB-P2，结果见表2。该对引物5'端碱基长度为45 bp的基因片段与ptsG和mglB基因序列同源，以18～20 bp（表中下划线序列）与质粒pkD4上FRT-kan-FRT阅读框序列同源。
表2 本研究所用引物
Table 2 Primes used in the study
1.3.2 ptsG/mglB双基因敲除大肠杆菌的构建
以质粒pkD4为模板，△ptsG-P1、△ptsG-P1为引物进行PCR扩增得到带有卡那霉素抗性基因的PCR扩增产物。PCR扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，循环30次。
采用CaCl2法[22]将质粒pkD46转化入E.coli JH16的细胞中，通过氨苄青霉素抗性筛选培养基上筛选得到阳性单菌落。将阳性单菌落接种于含有1.6%L-阿拉伯糖的LB培养基中，30 ℃条件下培养至OD600nm值=0.3～0.6，冰水浴30 min后，用去离子水洗涤4次后得到感受态细胞E.coli JH16/pkD46。
采用电转法[19]将PCR扩增产物转化到感受态细胞E.coli JH16/pkD46中，涂布到卡那霉素抗性筛选培养基上。在37 ℃培养箱中培养24 h，挑选生长良好的阳性单克隆在卡那霉素抗性筛选培养基上转接1～2代，并用鉴定引物△ptsG-P3、△ptsG-P4进行PCR验证。将成功敲除ptsG基因的E.coli JH16命名为E.coli JH17。
敲除mglB基因方法与敲除ptsG基因方法相同。将成功敲除mglB基因的E.coli JH17命名为E.coli JH2705。
1.3.3 发酵摇瓶培养
挑取E.coliJH2705单菌落接种于LB液体培养基中，装液量为100 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min条件下培养至OD600nm值至1.0～1.2左右，作为种子液。按2%（V/V）的接种量将种子液接种于发酵培养基中，装液量为100 mL/250 mL，37 ℃、200 r/min条件下培养，定时取样，测定菌体浓度光密度值（OD600nm值）、葡萄糖、木糖残留量及乳酸产量，每个处理作三个平行。
1.3.4 发酵罐发酵培养
一级种子液培养：挑取E.coli JH2705单菌落接种于LB液体培养基中，装液量为50 mL/250 mL，37 ℃、100 r/min条件下培养12 h。二级种子液培养：取20 mL一级种子液接种于LB液体培养基中，装液量为400 mL/1 L，37 ℃、150 r/min条件下培养到OD600nm值为1.0左右。将培养好的二级种子液按10%（V/V）的接种量接种至发酵培养基中，装液量为4 L/7 L发酵罐，37 ℃、200 r/min条件下发酵72 h，发酵过程中采用3 mol/L的Ca（OH）2作为中和剂控制发酵液pH值为7.0。定时取样，测定菌体浓度OD600nm值、葡萄糖、木糖残留量及L-乳酸产量。
1.3.5 分析检测
菌体浓度OD600nm值：采用紫外分光光度计在波长600 nm处测定菌液的吸光度值；葡萄糖、L-乳酸含量：采用生物传感仪检测法测定[23]；木糖含量：采用高效液相色谱分析[19]。
2 结果与分析
2.1 重组菌大肠杆菌JH2705的构建结果
以鉴定引物△ptsG-P3和△ptsG-P4、△mglB-P3、△mglBP4对磷酸转移酶系统中的葡萄糖转运酶基因ptsG（碱基长度为950 bp）和半乳糖转运基因mglB（碱基长度为910 bp）的敲除结果进行验证，结果见图1。由图1可知，E.coli JH16经过菌落PCR扩增后，出现碱基长度分别为950 bp和910 bp的基因片段，而敲除这两个基因后的重组菌E.coli JH2705经菌落PCR扩增后，无ptsG、mglB基因片段，说明重组菌E.coli JH2705中的ptsG、mglB基因已经成功被敲除。
图1 ptsG/mglB基因缺陷菌株Escherichia coli JH2705的PCR鉴定结果
Fig.1 PCR identification result of ptsG and mglB genes deficient Escherichia coli JH2705
M：DL 5 000 DNA Marker；1：以△mglB-P3、△mglB-P4为引物E.coli JH16的菌落PCR结果；2：以△mglB-P3、△mglB-P4为引物E.coli JH2705的菌落PCR结果；3：以△ptsG-P3和△ptsG-P4为引物E.coli JH16的菌落PCR结果；4：以△ptsG-P3和△ptsG-P4为引物E.coli JH2705的菌落PCR结果。
2.2 摇瓶发酵试验结果
以小麦秸秆为代表的木质纤维素水解液中，由纤维素水解得到葡萄糖约为60%，且半纤维素与木糖比大约为7∶3[24]，因此，本研究模拟小麦秸秆水解液组成，设定5.6%葡萄糖与2.4%木糖为发酵碳源，不同菌株对混合糖的发酵效果见表3。由表3可知，E.coli JH16、E.coli JH17、E.coli JH2705三菌株在72 h内可发酵完毕，与出发菌E.coli JH16相比，E.coli JH2705的葡萄糖残糖量（18.7 g/L）增加，葡萄糖消耗速率（0.52 g/（L·h））降低33.3%，无木糖残留，木糖消耗速率（0.36 g/（L·h））升高38.5%，乳酸生产强度（0.56 g/（L·h））提高33.3%。说明敲除ptsG和mglB基因后，碳代谢阻遏效应减弱，提高木糖消耗速率。
表3 Escherichia coli JH16、JH17、JH2705对混合糖发酵结果
Table 3 Mixed sugar fermentation results of Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705
注：不同字母表示差异显著性（P＜0.05）。
2.3 发酵罐发酵试验结果
2.3.1 生长曲线
E.coli JH16、E.coli JH17、E.coli JH2705在7 L发酵罐中发酵利用混合糖时的生长情况见图2。由图2可知，E.coli JH16、E.coli JH17及E.coli JH2705分别在发酵24 h、28 h、32 h时，OD600nm值达到最大（7.1、7.4、8.4）后进入稳定期。与E.coli JH16相比，E.coli JH17和E.coli JH2705的菌体生长更为明显，表明敲除基因后的两菌株可以摄取更多的碳源用于菌体生长[25]。
图2 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705发酵利用混合糖时的生长曲线
Fig.2 Growth curves of Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 in fermentation with mixed sugars
2.2.2 葡萄糖和木糖消耗曲线
E.coli JH16、E.coli JH17及E.coli JH2705在7 L发酵罐中发酵利用混合糖时葡萄糖及木糖的消耗情况见图3。由图3可知，E.coli JH2705同时开始利用葡萄糖和木糖，发酵40 h时木糖消耗完毕，发酵至44 h时葡萄糖消耗完毕，而E.coli JH16优先利用葡萄糖，发酵28 h时葡萄糖利用完毕，发酵30 h时开始利用木糖，至52 h还剩余7.1 g/L未被利用；E.coli JH17同时利用葡萄糖和木糖，发酵44 h时葡萄糖利用完毕，发酵至52 h时木糖剩余量为3.1 g/L。E.coli JH16、E.coli JH17、E.coli JH2705消耗葡萄糖的速率分别为2.01 g/（L·h）、1.28g/（L·h）、1.20g/（L·h），消耗木糖速率分别为0.33 g/（L·h）、0.40 g/（L·h）、0.60 g/（L·h）。结果表明，ptsG基因的缺失，可有效降低分解代谢阻遏效应，使得葡萄糖消耗速率降低，木糖消耗速率升高。而ptsG、mglB基因双缺陷菌E.coli JH2705的木糖消耗速率比ptsG基因缺陷菌E.coli JH17提高50%，表明两个基因对木糖利用效率升高具有叠加效应。
图3 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705发酵利用混合糖时木糖和葡萄糖消耗曲线
Fig.3 Curves of xylose and glucose consumption in Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 fermentation with mixed sugars
2.2.3 L-乳酸产量
E.coli JH16、E.coli JH17、E.coli JH2705的L-乳酸产量见图4。由图4可知，在发酵16 h之前，E.coli JH16的L-乳酸产量高于E.coli JH17、E.coli JH2705，E.coli JH17、E.coli JH2705同时利用葡萄糖和木糖产L-乳酸，但利用木糖的速率较慢，而E.coli JH16虽然不能利用木糖，但其利用葡萄糖产L-乳酸的速率却大于E.coli JH17、E.coli JH2705利用葡萄糖和木糖产L-乳酸的速率之和；在发酵18 h后，E.coli JH17和E.coliJH2705的L-乳酸产量逐渐超过E.coli JH16，E.coli JH17和E.coli JH2705利用木糖产L-乳酸的能力远大于E.coli JH16。发酵至48 h时，E.coli JH16的L-乳酸产量为34.12 g/L，转化率为42.0%，生产强度为0.71 g/（L·h）；E.coli JH17的L-乳酸产量为53.22 g/L，转化率为66.5%，生产强度为1.02 g/（L·h）；E.coli JH2705的L-乳酸产量为56.03 g/L，转化率为70.0%，生产强度为1.27 g/（L·h）。与出发菌株E.coli JH16相比，重组菌株E.coli JH17、JH2705生产强度分别提高了43.9%、79.1%。重组菌株E.coli JH2705已消耗完所有碳源，而E.coli JH17、JH16分别剩余3.1 g/L、7.1 g/L的木糖。结果表明，敲除ptsG和mglB基因后，菌株的生产强度提高。
图4 Escherichia coli JH16、JH17及JH2705发酵混合糖产L-乳酸含量
Fig.4 Contents of L-lactic acid produced by Escherichia coli JH16,JH17 and JH2705 fermented with mixed sugars
3 结论
本研究以大肠杆菌JH16为出发菌株，通过Red同源重组技术，同时敲除了磷酸转移酶系统中的葡萄糖转运酶基因ptsG和半乳糖转运基因mglB，构建ptsG/mglB双基因缺陷型大肠杆菌JH2705。该菌株以8%混合糖（5.6%葡萄糖+2.4%木糖）为碳源发酵产L-乳酸时，能同时利用葡萄糖和木糖，大幅度减小了葡萄糖效应所带来的不利影响，其木糖利用速率为0.60 g/（L·h），L-乳酸生产强度为1.27 g/（L·h），较出发菌株E.coli JH16分别提高50%、79.1%，并且E.coli JH2705的糖酸转化率高达70%，为木质纤维度高效利用木糖提供一定的理论基础。
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